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玉米象气味降解酶基因的鉴定及谷胱甘肽S-转移酶SzeaGSTd1的功能研究

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玉米象气味降解酶基因的鉴定及谷胱甘肽S-转移酶SzeaGSTd1的功能...

作者：夏道松安徽农业大学

学位级别：硕士

玉米象(Sitophilus zeamais Motschulsky)是世界性的储粮害虫也是我国重要的储粮害虫,对我国储粮造成了巨大的损失,它属于鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)。目前,使用化学熏蒸剂防治储粮害虫带来的抗药性、食品安全问题以及环... 详细信息

玉米象(Sitophilus zeamais Motschulsky)是世界性的储粮害虫也是我国重要的储粮害虫,对我国储粮造成了巨大的损失,它属于鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)。目前,使用化学熏蒸剂防治储粮害虫带来的抗药性、食品安全问题以及环境危害等问题,使得开发环境友好型的绿色防控技术刻不容缓。昆虫可通过自身发达高效的嗅觉感受系统接收外界环境中的气味分子所携带的信息,进而做出相应的生理反应(取食、繁衍后代和躲避天敌等),昆虫的气味降解酶(Odorant Degrading Enzymes,ODEs)在嗅觉感受系统中发挥着快速降解并失活完成信息传递气味分子,维持嗅觉感受系统稳定灵敏性的作用。因此,本文根据实验室前期玉米象触角转录组数据,对玉米象气味降解酶基因进行相关研究工作。1.玉米象气味降解酶基因的鉴定和序列分析通过对玉米象触角转录组进行分析,我们共鉴定出30个玉米象气味降解酶基因,其中谷胱甘肽S-转移酶基因(Glutathione S-transferases,GSTs)有13个、羧酸酯酶基因(Carboxylesterases,CXEs)有17个。13个SzeaGSTs序列长度在606到744 bp之间,编码的蛋白长度为116到239个氨基酸残基,且都与象甲科其他昆虫的GST具有较高的同源性。氨基酸序列的保守功能域、关键氨基酸位点预测结果显示9个SzeaGSTs在序列的N-端预测到谷胱甘肽结合位点;8个SzeaGSTs的C-端预测到底物结合位点。17个Szea CXEs基因序列长度介于1554～2535 bp之间,并且都有完整的开放阅读框,编码的蛋白序列长度在421～744个氨基酸残基。其中Szea CXE1、Szea CXE8和Szea CXE17在序列的N-端具有一段信号肽,表明Szea CXE1、Szea CXE8和Szea CXE17可能是分泌到细胞外发挥作用。序列的功能域和保守位点分析表明这些Szea CXE17都具有较保守的昆虫酯酶序列特征(催化活性中心Gx Sx G version和氧负离子孔Oxyanion hole)。2.玉米象气味降解酶表达模式分析根据荧光定量PCR结果,6个SzeaGSTs基因在触角中高表达,其中SzeaGSTd1特异性的在雌雄虫触角中高表达,两者之间没有显著差异;剩余的SzeaGSTs除SzeaGSTd3外都是雄虫触角显著的高于雌虫触角。SzeaGSTe2、SzeaGSTe5和SzeaGSTz1均特异的在翅中高度表达,SzeaGSTt1则在头部特异的高表达,推测这些在非嗅觉器官高表达的基因可能在玉米象体内行使其他功能作用。在触角中高表达的Szea CXEs基因共有6个,在胸部高表达的有7个,在翅中高表达的有5个。Szea CXE1在玉米象头部特异的高表达,可能在玉米象味觉系统发挥重要功能。3.玉米象SzeaGSTd1蛋白的体外表达和功能分析通过大肠杆菌系统体外表达并纯化得到玉米象SzeaGSTd1蛋白,可溶性蛋白的大小约为25 k Da。酶活性测定结果表明,SzeaGSTd1的最大反应速率(V)为1047±43.09μmol/mg/min,米氏常数(K)为0.42±0.04 m M,温度和p H都能对其活性产生影响,酶蛋白最适条件为30℃,p H7～7.5。底物竞争表明辛醇、苯甲醛和香草醛对SzeaGSTd1酶活性的影响较明显,相对活性分别下降了47.76%、39.74%和51.94%,这3个气味物质对SzeaGSTd1的IC分别是0.39 m M、0.59 m M和0.43 m M。体外降解代谢结果显示,SzeaGSTd1酶蛋白能降解代谢辛醇,对苯甲醛和香草醛没有明显的降解作用。通过对玉米象气味降解酶基因的鉴定以及玉米象SzeaGSTd1的功能研究,有利于理清这些基因在玉米象嗅觉感受系统中的作用机制,可为开发制定基于玉米象嗅觉感受系统的新型防控技术提供理论支持。

关键词：玉米象气味降解酶谷胱甘肽S-转移酶表达模式降解代谢

绿盲蝽气味降解酶相关基因的鉴定及功能初步研究

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绿盲蝽气味降解酶相关基因的鉴定及功能初步研究

作者：沈忱山西师范大学

学位级别：硕士

盲蝽蟓属于半翅目盲蝽科，是我国棉花生产上一类重要害虫，每年在全世界都对棉花产量造成巨大的损失。目前在我国各棉区已发现的棉盲蝽有20余种，其中危害比较严重的种类，有绿盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽和牧草盲蝽。自1997年... 详细信息

盲蝽蟓属于半翅目盲蝽科，是我国棉花生产上一类重要害虫，每年在全世界都对棉花产量造成巨大的损失。目前在我国各棉区已发现的棉盲蝽有20余种，其中危害比较严重的种类，有绿盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽和牧草盲蝽。自1997年起，随着Bt棉花的广泛种植，有效地控制了以棉铃虫为主的鳞翅目害虫的危害，棉盲蝽种群发生数量剧增，由棉花的次要害虫上升为主要害虫之一。绿盲蝽已成为我国黄河流域、长江流域棉区危害最严重的优势种群。目前防治盲蝽主要靠化学农药，这不仅容易导致盲蝽抗药性的产生，而且对环境造成了巨大的污染和破坏，这就使得开发绿色环境友好型防治绿盲蝽的新方法和新技术显得尤为重要。目前，通过干扰靶标昆虫的嗅觉过程来对其进行有效控制是昆虫行为调控的研究热点。昆虫识别配偶释放的性信息素或植物的挥发性气味是通过位于昆虫嗅觉感器中的相关蛋白来实现的，包括气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）、化学感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）、嗅觉受体（olfactory receptors，Ors）、气味降解酶（odorant degrading enzymes，ODEs）和嗅觉神经元膜蛋白（sensoryneuron membrane proteins，SNMPs）。昆虫的嗅觉反应包括一系列连续的反应：包括气味分子的结合，气味分子在感器淋巴液内的运输，气味分子与受体的结合，信号的转化，传导与终止。其中，信号的终止在嗅觉反应中起着非常重要的作用，不仅避免了嗅觉器官受到连续的化学刺激同时还减小了信号饱和性的干扰。本研究以绿盲蝽为研究对象，通过SMART技术成功构建绿盲蝽触角的cDNA文库并进行详细的生物信息学分析，鉴定大量嗅觉相关基因，筛选出气味降解相关基因，结果获得谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因序列共27条，酯酶（EST）基因序列共12条，细胞色素P450氧化还原酶基因序列共31条。同时结合SMARTer RACE技术克隆有关的气味降解酶（ODEs）基因，成功克隆出一个新的绿盲蝽酯酶基因的全长序列，全长1810bp，开放阅读框为1713bp，编码571个氨基酸。对这条序列命名为Aluc EST1，Gene bank登陆号为JQ715614。预测蛋白分子量为分子量63.44Kd，等电点（PI）为5.99。为研究绿盲蝽气味降解酶生物学功能奠定了基础。随后克隆了两个绿盲蝽内参基因，并采用RT-PCR半定量和Real-time QPCR技术解析Aluc EST1在不同组织的表达图谱。研究结果发现，该酯酶基因在绿盲蝽的触角、头、胸、腹、足、翅各部位都有表达。其中在胸腹部的表达量最高，该基因在触角中也有大量表达。同时利用酶与底物的相互作用关系进行酶活力的测定，本研究以α-醋酸萘酯为底物，固蓝RR盐为显色剂反应，测定了Aluc EST1的酶活力为1.224868（ m OD·min-1·mg-1）。通过以α-/β-乙酸萘酯为底物，对绿盲蝽酯酶图谱进行分析，结果发现在绿盲蝽的成虫中，能看到两条清晰的条带，并且相同的条带在绿盲蝽的若虫中也可以看到，其中在雄虫中的条带看起来颜色更深，显示雄虫中该酶活性可能更高。上述研究为系统阐明绿盲蝽嗅觉识别的分子机制以及绿盲蝽的防治奠定一定的理论基础。这可能成为进一步防控田间绿盲蝽的重要理论依据。

关键词：绿盲蝽气味降解酶酯酶 Aluc EST1 表达谱酶活酯酶电泳

稻纵卷叶螟气味降解酶与茶尺蠖感觉神经元膜蛋白基因鉴定及表达谱分析

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稻纵卷叶螟气味降解酶与茶尺蠖感觉神经元膜蛋白基因鉴定及表达谱...

作者：张宇星安徽农业大学

学位级别：硕士

昆虫在长期的进化过程中形成了一套高度发达的嗅觉系统,嗅觉是昆虫与外界进行信息交流的主要方式。在嗅觉过程中,昆虫通过其嗅觉器官表面各种类型的嗅觉感器去感受环境中的挥发性物质,进而产生相应的生理或行为反应,如取食、寻找配偶、... 详细信息

昆虫在长期的进化过程中形成了一套高度发达的嗅觉系统,嗅觉是昆虫与外界进行信息交流的主要方式。在嗅觉过程中,昆虫通过其嗅觉器官表面各种类型的嗅觉感器去感受环境中的挥发性物质,进而产生相应的生理或行为反应,如取食、寻找配偶、产卵、躲避天敌等。昆虫对气味分子的识别过程十分复杂,研究证实有多种蛋白参与其中,如气味结合蛋白(Odorant-binding proteins,OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、气味受体(Odorant receptors,ORs)、离子型受体(ionotropic receptors,IRs)、感觉神经元蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)和气味降解酶(odorant-degrading enzymes,ODEs)等。近年来,由于化学农药的过量使用,农药残留和害虫抗药性成为了越来越不容忽视的问题,因此对昆虫的化学感受机制进行研究,详细阐明气味降解酶及感觉神经元膜蛋白的表达情况,能为基于昆虫嗅觉识别机制的新型行为调控技术提供理论支持。本研究以两种重要农业害虫稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)和茶尺蠖(Ectropis obliqua)为研究对象,通过分子生物学等相关技术,对两种害虫化学感受相关基因及表达模式进行了初步研究,并进一步利用电子显微镜对茶尺蠖雌雄触角的超微结构进行了观察,结果如下:1.稻纵卷叶螟气味降解酶基因鉴定、序列及进化关系分析对稻纵卷叶螟雌雄触角进行了转录组测序,运用生物信息学方法从稻纵卷叶螟触角转录组中鉴定出了 22个气味降解酶基因,包括18个羧酸酯酶(carboxylesterase,CXE)基因和 4个醛氧化酶(aldehyde oxidase,AOX)基因。对这些基因进行序列和进化关系分析发现,在18个CXE中,14个获得了全长ORF,这些CmedCXE基因编码蛋白的长度在494-738个氨基酸之间;序列比对结果显示它们都具有典型的羧酸酯酶结构特征;进化关系分析显示这些CmedCXE分属于昆虫羧酸酯酶的6个亚族。4个CmedA OX基因的均具有完整ORF,它们编码的蛋白长度在1258-1284个氨基酸之间。这些CmedA OXs与其它鳞翅目昆虫的AOXs具有较高的相似性;系统发育分析也显示4个CmedAOXs跟昆虫的AOXs具有更近的进化关系。2.稻纵卷叶螟气味降解酶基因表达谱分析对稻纵卷叶螟的CXE及AOX基因进行了组织表达谱分析。结果显示有3个CmedCXE(CmedCXE1 7、CmedCXE20 和 CmedCXE24)基因在触高表达,其它的CmedCXE则拥有广泛的组织表达谱;而在4个CmedA OX中,只有CmedAOX2在触角高表达且雄虫触角表达量明显高于雌虫触角。以上结果说明在稻纵卷叶螟触角中高表达的CnfedCXE和CmedAOX可能会参与对触角中气味分子的降解,而其它的CmedCXE和CmedA OX则可能具有更广泛的生物学功能。3.茶尺蠖感觉神经元膜蛋白基因鉴定、进化关系及表达谱分析对茶尺蠖雌雄虫触角进行转录组测序,通过生物信息学和分子生物学技术我们从茶尺蠖触角转录组中鉴定出了两个SNMP基因,并对其进行了序列比对和进化关系分析。茶尺蠖EoblSNMP1和EoblSNMP2的开放阅读框全长分别为1554 bp和1548 bp,GenBank 登录号分别为 EoblSNMP1(MH598590)和EoblSNMP2(KT991367)。系统发育分析显示EoblSNMP1和EoblSNMP2属于两个不同的SNMP亚族。组织表达谱显示EoblSNMP1在雄虫触角高表达,而在其它组织中表达量很低;EoblSNMP2在雄虫触角表达量最高,其次是雌虫触角、足、性腺和翅。发育期表达谱显示EoblSNMP1从4龄幼虫到羽化前一天都保持很低的表达,从羽化当天到羽化后2天其表达量显著升高。EoblSNMP2在4龄幼虫到羽化后2天都保持很低的表达水平,在羽化后第3天表达量显著上升。交配前后表达谱结果表明交配行为对EoblSNMP1和EoblSNMP2的基因表达没有显著影响。4.茶尺蠖成虫触角感器扫描电镜观察为了了解茶尺蠖触角超微结构及感器分布情况,通过扫描电镜对茶尺蠖雌雄触角外部形态进行了观察。现已鉴定出7种类型感器:毛形感器(sensilla trichodea)、锥形感器(sensilla basiconca)、刺形感器(sensilla chaetica)、栓锥形感器(sensilla styloconica)、鳞形感器(sensilla squamiformiz)、Bohm 氏鬃毛(Bohm bristles)。其中毛形感器数量最多且雄虫触角数量多于雌虫触

关键词：稻纵卷叶螟气味降解酶茶尺蠖感觉神经元膜蛋白表达谱

亚洲玉米螟气味降解酶基因鉴定及谷胱甘肽转移酶OfurGSTd1功能分析

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亚洲玉米螟气味降解酶基因鉴定及谷胱甘肽转移酶OfurGSTd1功能分析

作者：沈怿丹安徽农业大学

学位级别：硕士

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我国玉米上的主要害虫,严重影响玉米的产量和品质。目前对亚洲玉米螟的防治主要以化学防治为主,但是化学防治不仅污染环境,而且杀伤天敌,更为严重的是造成害虫抗药性。因此研发高效且对环境友好的新型... 详细信息

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我国玉米上的主要害虫,严重影响玉米的产量和品质。目前对亚洲玉米螟的防治主要以化学防治为主,但是化学防治不仅污染环境,而且杀伤天敌,更为严重的是造成害虫抗药性。因此研发高效且对环境友好的新型害虫防控技术十分必要。基于昆虫嗅觉识别机制的害虫行为调控技术是当前重要的研究方向之一。通过对昆虫嗅觉识别机制开展研究,可以找到气味识别过程中的关键基因,基于关键基因开发出高效的嗅觉阻断剂,能够切断害虫与配偶和寄主植物之间的化学联系。昆虫对气味分子的识别过程十分复杂,前人研究证实有多种蛋白参与其中,如气味结合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、气味受体(odorant receptors,ORs)、离子型受体(ionotropic receptors,IRs)、感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)和气味降解酶(odorantdegrading enzymes,ODEs)等。相较于OBPs、CSPs、ORs、IRs和SNMPs研究的热度,有关ODEs的研究明显匮乏。但是ODEs在昆虫嗅觉过程中的作用至关重要。气味分子激活气味受体后,需要ODEs迅速降解气味分子,从而让气味受体和嗅觉神经元恢复敏感性,以感受下一个气味信号的刺激。在害虫防治中,可以通过抑制ODEs的活性或沉默ODEs基因,从而干扰昆虫的气味识别能力,进而达到控制害虫行为的目的。因此本论文针对亚洲玉米螟ODEs开展研究,一是希望能为解析亚洲玉米螟嗅觉过程中的气味降解机制奠定理论基础,二是希望能为开发基于ODEs的害虫行为调控技术提供理论支持。本研究主要取得如下结果:1.亚洲玉米螟触角转录组测序与气味降解酶基因鉴定对亚洲玉米螟触角进行了转录组测序,将原始序列组装,获得了35,056个单一基因序列(unigenes)。通过搜索NCBI非冗余数据库,对21,012(59.94%)个unigenes进行了注释,并使用了三个数据库GO、KOG和KEGG对这些unigenes进行了功能分类。运用生物信息学方法从亚洲玉米螟触角转录组中鉴定了79个可能与气味降解相关的基因,包括19个羧酸酯酶(carboxylesterases,CXEs)基因、17个谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)基因、24个细胞色素P450(cytochrome P450monooxygenases,CYPs)基因,13个尿苷二磷酸-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases,UGTs)基因和6个醛氧化酶(aldehyde oxidases,AOXs)基因。2.亚洲玉米螟气味降解酶基因表达谱分析使用实时荧光定量PCR对亚洲玉米螟的19个CXEs和1个GST基因(OfurGSTd1)进行了组织表达谱分析。结果显示7个CXEs基因(OfurCXE2/5/7/10/14/15/18)主要表达于成虫触角。其中OfurCXE2,OfurCXE5和OfurCXE18主要表达于雄蛾触角,而OfurCXE7,OfurCXE10和OfurCXE15主要表达于雌蛾触角;OfurCXE14的表达量在雌雄触角之间没有显著差异。此外,发现OfurGSTd1在雌雄触角中特异性表达,推测该基因编码的蛋白可能参与气味分子的降解。3.亚洲玉米螟OfurGSTd1原核表达和活性测定成功构建了OfurGSTd1原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了重组OfurGSTd1蛋白。通过亲和层析方法得到了较高纯度的目的蛋白。测定了OfurGSTd1对通用底物CDNB的活性,结果表明OfurGSTd1具有谷胱甘肽转移酶活性。

关键词：亚洲玉米螟嗅觉触角转录组气味降解酶表达谱异源表达

光肩星天牛气味降解酶基因鉴定、表达及功能探究

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光肩星天牛气味降解酶基因鉴定、表达及功能探究

作者：杨欢北京林业大学

学位级别：硕士

气味降解酶（Odorant Degrading Enzymes,ODEs）是一种选择进化的酶类,已知几种酶参与气味降解过程,其中主要包括包括细胞色素P450（Cytochrome P450s,CYPs）、谷胱甘肽S-转移酶（Glutathion-S-transferases,GSTs）,此外还包括少量的羧酸酯酶（Carboxylesterases,CXEs）、糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases,UGTs）等。光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）是我国危险性有害生物,寄主谱广泛,危害柳、榆、杨属等多种植物,造成重大经济损失。为揭示光肩星天牛触角气味降解酶作用机制,本研究采用生物信息学方法挖掘触角转录组数据;结合qPCR研究其表达模式;筛选出高表达量蛋白,用SWISS-MODEL进行同源建模;利用AUTO-DOCK对接技术与关键化合物进行分子对接;最后克隆关键基因,并对其蛋白进行原核表达。具体结果如下:1.在光肩星天牛触角转录组中共鉴定出97个嗅觉降解酶相关基因,包括9个GSTs,20个CXEs,66个P450s和2个UGTs。与其它昆虫的系统进化关系中,发现AglaGSTD2和Tcas GSTD2（即赤拟谷盗的Tc GSTd2）聚在一支,同源性在90%以上,推测其在光肩星天牛体内参与有毒物质的代谢。Agla CYP6EF5和Dpon CYP6DJ1（即中欧山松大小蠹的CYP6DJ1）聚在一支,同源性在90%以上,表明其功能可能和中欧山松大小蠹的CYP6DJ1一样,发挥嗅觉清除和萜烯的代谢作用。***结果显示,AglaGSTT1、Agla CXE13229、Agla CYP4AA2和Agla CYP4Q28在雄性触角显著表达,可能与有毒物质的分解和性信息素的降解有关;Agla CXE12385和Agla CXE14367在雌性触角中的表达高于雄性触角,可能在检测与产卵相关的植物气味方面起作用;AglaGSTD2、AglaGSTD4、Agla CYP6BJ6、Agla CYP6BJ29和Agla CYP345N1在雌雄触角中高表达且表达水平相近,可能在食物来源气味的感知中起作用。3.同源建模和分子对接结果显示,Agla CYP345N1、Agla CYP4Q28、AglaGSTD2、AglaGSTD4 4个蛋白建模成功,与寄主植物青皮垂柳挥发性物质1-Nonanal结合最好的蛋白是Agla CYP4Q28;与3-Carene结合最好的蛋白是AglaCYP345N1;与光肩星天牛雌虫体表物质Hexadecanal对接最好的蛋白是Agla CYP345N1;与寄主植物糖槭主要挥发物成分Cis-2-Hexen-1-ol结合最好的是Agla CYP345N1,Lauric acid结合最好的蛋白是Agla CYP4Q28;光肩星天牛气味结合蛋白Agla OBP1结合较好的Cis-3-Hexenyl acetate在4个气味降解酶中与Agla CYP345N1结合最好。从结合能来看,4个蛋白结合能的趋势基本一致,部分气味分子有差别,与蛋白结合最好气味物质的是3-Carene,其次是Methyl jasmonate和Farnesol。4个蛋白中,与气味分子结合最好的蛋白是Agla CYP345N1,结合最差的是AglaGSTD4。4.在qPCR结果中AglaGSTT1在触角中显著表达,通过构建AglaGSTT1的克隆载体和表达载体,并通过镍柱获得了AglaGSTT1的纯化蛋白,为下一步基于蛋白功能验证奠定基础。

关键词：光肩星天牛气味降解酶组织表达谱分子对接原核表达

鳞翅目昆虫外周神经嗅觉感受分子机制的研究进展

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应用昆虫学报 2023年第3期60卷 641-659页

作者：罗娟马云峰何银银吴旺芝代正梅张亚楠贺鹏绿色农药全国重点实验室教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室贵州大学精细化工研究开发中心贵阳550025 贵州大学化学与化工学院贵阳550025 淮北师范大学生命科学学院淮北235000

鳞翅目是昆虫纲第二大目,包括蛾类和蝶类,很多种类都是重要农林害虫,如小菜蛾Plutella xylostella、棉铃虫Helicoverpa armigera、美国白蛾Hyphantria cunea等,由于它们已经对多种化学杀虫剂产生了较高的抗性,急需开发新的防治手段。近... 详细信息

鳞翅目是昆虫纲第二大目,包括蛾类和蝶类,很多种类都是重要农林害虫,如小菜蛾Plutella xylostella、棉铃虫Helicoverpa armigera、美国白蛾Hyphantria cunea等,由于它们已经对多种化学杀虫剂产生了较高的抗性,急需开发新的防治手段。近年来,基于昆虫嗅觉行为调控的防控技术被认为是绿色可持续的新方法,已引起广泛关注。昆虫嗅觉在求偶、寻找寄主和产卵场所及躲避天敌等过程中起重要作用,深入探索昆虫的嗅觉感受机制,将为研发高效的嗅觉行为调节剂提供新的思路和参考。本文综述了近4年鳞翅目昆虫嗅觉外周神经感受分子机制的研究进展,涉及的嗅觉基因有气味结合蛋白(Odorant binding protein,OBP)、化学感受蛋白(Chemosensory protein,CSP)、感觉神经元膜蛋白(Sensory neuron membrane protein,SNMP)、气味受体(Odorant receptor,OR)、离子受体(Ionotropic receptor,IR)和气味降解酶(Odorant degrading enzyme,ODE),并展望了未来的研究方向。

关键词：鳞翅目嗅觉外周神经气味结合蛋白化学感受蛋白感受神经元膜蛋白气味受体离子受体气味降解酶

基于稻纵卷叶螟触角转录组的羧酸酯酶类气味降解基因CXE66鉴定及其表达谱

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植物保护学报 2021年第6期48卷 1291-1302页

作者：李尧王楚楚杜海涛唐庆东潘秦剑刘芳扬州大学园艺与植物保护学院江苏扬州225000 扬州大学江苏省粮食作物现代生产技术协同创新中心扬州225000 扬州大学农业科技发展研究院国际联合实验室江苏扬州225000

为了解稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis气味降解机制,利用稻纵卷叶螟基因组和触角转录组鉴定羧酸酯酶(carboxylesterase,CXE)基因,同时采用同源比对和系统发育进化树对其进行分类,进一步克隆获得稻纵卷叶螟CXE66的全长序列,并采用... 详细信息

为了解稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis气味降解机制,利用稻纵卷叶螟基因组和触角转录组鉴定羧酸酯酶(carboxylesterase,CXE)基因,同时采用同源比对和系统发育进化树对其进行分类,进一步克隆获得稻纵卷叶螟CXE66的全长序列,并采用实时荧光定量PCR分析该基因在各组织中的表达情况。结果显示,共鉴定出触角特异性表达的45个CXE基因,其中新发现29个CXE,分属于CXE八个亚族。触角组织中高表达的CXE66基因开放阅读框长1605 bp,编码534个氨基酸,且具有典型CXE结构特征,其在稻纵卷叶螟触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,且在触角中表达量最高。表明45个CXE基因可能参与稻纵卷叶螟的气味降解和性信息素降解、有毒物质代谢、蜕皮发育和神经发育等生理生化过程,其中CXE66可能参与酯类植物挥发物的降解。

关键词：稻纵卷叶螟气味降解酶羧酸酯酶基因触角

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小菜蛾两类性信息素降解酶的功能研究

小菜蛾两类性信息素降解酶的功能研究

作者：王梅梅贵州大学

学位级别：硕士

小菜蛾,Plutella xylostella(L.)属鳞翅目菜蛾科,是十字花科蔬菜的世界性重要害虫之一。我国的甘蓝和花椰菜等十字花科作物的种植面积位居世界首位,为小菜蛾提供了充足的食物来源。但长期对于化学农药防治的依赖,使得小菜蛾成为抗药性... 详细信息

小菜蛾,Plutella xylostella(L.)属鳞翅目菜蛾科,是十字花科蔬菜的世界性重要害虫之一。我国的甘蓝和花椰菜等十字花科作物的种植面积位居世界首位,为小菜蛾提供了充足的食物来源。但长期对于化学农药防治的依赖,使得小菜蛾成为抗药性发展最为严重的害虫之一,急需新的防治手段。“反向化学生态”是新兴的绿色控害方法,即通过阐明昆虫嗅觉分子机制,解析重要的嗅觉基因的功能,再依据其来设计成本低并且高效的害虫行为干扰剂和阻断剂。触角是昆虫的主要的嗅觉感受器官,在感知性信息素和寄主植物挥发物等嗅觉方面发挥重要作用。昆虫对气味的感受和识别类的基因已被广泛研究,但是对气味信号终止的分子机制研究较少。前期实验证明,触角中气味降解酶(odorant degrading enzyme,ODE)可以快速降解气味分子,是重要的气味信号灭活基因,而性信息素降解酶(pheromone degrading enzyme,PDE)是特化的气味降解酶,能够降解昆虫性信息素气味分子。其中,羧酸酯酶(carboxylesterase,CCE)和醛氧化酶(aldehyde oxidase,AOX)家族中的一些成员是两类重要的ODE基因,分别降解酯类和醛类气味分子。小菜蛾中同时存在酯类和醛类性信息素组分,暗示具有降解对应性信息素组分的CCE和AOX基因。雄性小菜蛾通过触角感受识别同种雌性释放的性信息素(顺11-十六碳乙酸酯(Z11-16:OAc)和顺11-十六碳烯醛(Z11-16:Ald)),搜索配偶。本论文对课题组前期鉴定的小菜蛾触角高表达的醛氧化酶(PxylAOX3),羧酸酯酶(PxylCCE16a和PxylCCE16c)两类候选ODE基因进行了功能研究。首先通过Sf9昆虫细胞异源表达结合Ni亲和纯化,获得了具有酶活性的高纯度重组蛋白。进一步的酶活性测试表明,重组蛋白PxylCCE016c能够降解小菜蛾两个酯类性信息素组分Z11-16:OAc和Z9-14:OAc为对应的醇类,相对降解率分别为27.64±0.79%和24.40±3.07%。而PxylCCE016a对两个性信息素组分Z11-16:OAc和Z9-14:OAc的降解活性相对较低,相对降解率分别仅有8.40±0.27%,6.87±0.60%。同时,这两个CCE对植物来源的酯类挥发物也展现出了类似的活性差异,PxylCCE016a对Z3-6:OAc的相对降解率只有14.83±0.76%,而PxylCCE016c对Z3-6:OAc的相对降解率可以达到63.51±2.30%。此外,抑制剂实验表明,只有PxylCCE016c可以被一种常见的酯酶抑制剂磷酸三苯酯(triphenyl phosphate,TPP)抑制,其半抑制浓度(LC)为1570±520μmol L。醛氧化酶PxylAOX3是触角中3个AOX基因中表达量最高的基因,暗示其是主要的醛气味降解酶。在本研究中,通过进一步昆虫细胞表达、亲和纯化和体外分析了重组PxylAOX3的酶功能:发现PxylAOX3的酶谱较宽,不仅能够降解小菜蛾性信息素的主要成分Z11-16:Ald和性信息素类似物Z11-14:Ald、Z9-16:Ald、Z10-16:Ald,相对降解率均超过40%,还能氧化降解植物来源的醛挥发物和带醛基的异生物质(丙烯醛,杀虫剂涕灭威)。此外,PxylAOX3在不同温度下对苯甲醛的酶活性分析表明,PxylAOX3的热稳定性随温度的升高逐渐降低:在20–40℃时相对稳定,在50℃时相对活性为83.62±2.44%略有下降,而在50–70℃时活性会急剧下降,60℃和70℃时分别只有64.20±2.50%和23.28±1.56%。PxylAOX3氧化活性在70–90℃范围内持续轻度下降,相对活性分别为12.34±2.07%和4.51±0.91%。此外,PxylAOX3、PxylCCE16a和PxylCCE16c的活性强弱均具有pH依赖性。PxylAOX3的酶活性在pH为5–8之间的活性不同:pH=8.0时PxylAOX3的对苯甲醛的酶活性最高;pH=7.0和pH=7.5时活性较高,约为pH=8.0时活性的80%;pH=6.0时,活性较低为22.47±2.48%;pH=5.0时,没有检测到明显活性。PxylCCE016a和Pxy CCE016c酶活性随pH从5.0到7.0时均呈上升趋势,例如:在pH=5.0时,PxylCCE016a对性信息素组分Z11-16:OAc和植物挥发物Z3-6:OAc的降解活性分别只有约5.0%、0.4%,Pxy CCE016c对这两种底物的降解活性分别也是只有约7.0%、3.0%;在pH=6.5时,PxylCCE016a对这两种底物的活性分别为7.0%、2.0%,Pxy CCE016c对这两种底物的活性分别为9.0%、19%

关键词：气味降解酶小菜蛾羧酸酯酶醛氧化酶性信息素植物挥发物酶动力学参数

暗黑鳃金龟Sigma家族GSTs蛋白对寄主植物挥发物降解作用

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暗黑鳃金龟Sigma家族GSTs蛋白对寄主植物挥发物降解作用

作者：李昀朔吉林大学

学位级别：硕士

暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela Motschulsky）为鞘翅目 Coleoptera、金龟总科Scarabaeoidea、鳃金龟科Melolonthidae、齿爪鳃金龟属Holotrichia昆虫,分布于我国多个省区。幼虫称蛴螬,栖息于地下,以土壤中的腐殖质以及植物的种子、... 详细信息

暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela Motschulsky）为鞘翅目 Coleoptera、金龟总科Scarabaeoidea、鳃金龟科Melolonthidae、齿爪鳃金龟属Holotrichia昆虫,分布于我国多个省区。幼虫称蛴螬,栖息于地下,以土壤中的腐殖质以及植物的种子、块茎、根部等为食,对玉米、花生、大豆、马铃薯等多种作物造成严重的危害。因其为害方式隐秘,传统的药剂防治难以产生理想的效果。鉴于此,开展暗黑鳃金龟嗅觉识别机制的研究,明确暗黑鳃金龟气味降解酶对植物挥发物的降解作用,为应用化学生态学手段防控地下害虫奠定了重要的实验基础。为了明确暗黑鳃金龟Sigma家族GSTs蛋白对植物挥发物的降解作用,本研究利用线上建模和分子对接技术揭示了Sigma家族GSTs蛋白和醛类化合物的互作;应用高效液相色谱法（HPLC）测定HparGSTs蛋白对醛类化合物的降解效果;并利用EAG系统和行为学实验测定了暗黑鳃金龟对醛类化合物的反应,主要研究结果如下:（1）利用Swissdock蛋白质线上同源建模软件对暗黑鳃金龟触角中表达的3种 Sigma 家族谷胱甘肽-S转移酶（Glutathione-S-transferases,GSTs）HparGSTS2、HparGSTS6和HparGSTS12进行了同源建模,并利用Autodock4.2分子对接软件将得到的三维模型与气味化合物进行分子对接模拟,以期找到与暗黑鳃金龟上述GSTs蛋白互作性高的化合物。HparGSTS2、HparGSTS6、HparGSTS12三种蛋白同源性较高,有相似的生理功能。在备选气味化合物中选出了与暗黑鳃金龟HparGSTS2、HparGSTS6、HparGSTS12有明显互作作用的六种化合物,分别为肉桂醛、反-2-己烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、2,4-己二烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醛以及反-2-戊烯醛。（2）建立了暗黑鳃金龟HparGSTS2、HparGSTS6以及HparGSTS12与分子对接筛选所得化合物的体外实验反应体系,利用高效液相色谱法（HPLC）测定HparGSTs蛋白对植物挥发物的降解作用,明确其降解效率。HparGSTS2、HparGSTS6、HparGSTS12对6种气味化合物的降解效率测定。结果表明,暗黑鳃金龟HparGSTs对6种气味化合物有明显酶促反应降解功能,其中,3种蛋白对反-2-己烯醛的降解效率最高。仅HparGSTS12对反-2-戊烯醛未发现明显降解作用。（3）为进一步明确待测化合物与暗黑鳃金龟之间的关系,对化合物进行EAG和行为学分析,为筛选对暗黑鳃金龟有作用的食诱剂提供实验基础。EAG试验表明,该6种植物挥发物均能引起暗黑鳃金龟成虫的触角电位变化,而反-2-己烯醛对暗黑鳃金龟的影响较强,并且雌虫对于反-2-己烯醛的响应更为明显。通过Y型嗅觉仪及室内罩笼试验确定了反-2-己烯醛对暗黑鳃金龟成虫有吸引作用,并验证了反-2-己烯醛对于暗黑鳃金龟雌虫的影响大于雄性的结论。

关键词：暗黑鳃金龟谷胱甘肽-S-转移酶气味降解酶分子对接 EAG反应