检索结果-南通市图书馆

作者：丁玉骁吉林农业大学

学位级别：硕士

绿盲蝽(Apolygus lucorum)是我国一种重要的农业害虫,具有灵活机动、寄主广泛和隐蔽为害等特点。化学感受行为在绿盲蝽许多生命阶段中发挥着至关重要的作用,如求偶、寄主定位和寄主转移过程中性信息素及花香类气味的探测。气味结合蛋白(... 详细信息

绿盲蝽(Apolygus lucorum)是我国一种重要的农业害虫,具有灵活机动、寄主广泛和隐蔽为害等特点。化学感受行为在绿盲蝽许多生命阶段中发挥着至关重要的作用,如求偶、寄主定位和寄主转移过程中性信息素及花香类气味的探测。气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)被认为参与化学信息素感知过程中的初始生化识别阶段。随着盲蝽性信息素组分的鉴定以及盲蝽性诱剂在田间应用中的发展,干扰昆虫的化学信息通讯已经成为一种害虫防治的新策略。本研究从分子水平深入探索绿盲蝽对性信息素的识别机制,为嗅觉基因的干扰或沉默及优化性诱剂组分提供理论参考。本试验主要研究内容如下:1.通过绿盲蝽触角转录组测序共获得38个OBPs基因,包括26个“classic”OBPs和12“Plus-C”OBPs基因。系统发育树结果表明绿盲蝽OBPs蛋白与半翅目中其它盲蝽的OBPs蛋白在进化树中聚集在一起,亲缘关系表现得更为接近。荧光定量qRT-PCR结果表明在新鉴定的23个OBPs基因中,有11个OBPs基因在绿盲蝽雌雄成虫触角中的表达水平显著高于其他组织,其中有3个在雄虫触角表达水平显著高于雌虫触角,有6个在雌虫触角表达水平显著高于雄虫触角,暗示着它们可能在探测性信息素或寄主植物挥发物中发挥着作用;有3个OBPs基因在口器表达水平显著高于其他组织;有4个OBPs基因在头部表达水平显著高于其他组织;有2个OBPs基因在足部表达水平显著高于其他组织;有1个OBP基因在腹部表达水平显著高于其他组织;有1个OBP基因在翅部表达水平显著高于其他组织;有2个OBPs基因在主要组织如触角、口器、头部、足和翅中都有表达并且差异不显著。大多数具有直系同源基因的绿盲蝽OBPs基因与它们的直系同源基因有着相似的表达谱,强烈地表明这些同源基因在嗅觉或味觉中具有相似的功能。2.筛选出两个绿盲蝽male-biased触角气味结合蛋白AlucOBP13和AlucOBP17作为潜在的性信息素结合蛋白(PBPs),这两个OBPs可能与绿盲蝽识别性信息素过程息息相关。对AlucOBP13和AlucOBP17进行克隆、表达和纯化,通过荧光竞争结合试验和微量热泳动试验对它们与9种潜在的盲蝽性信息素物质,以及59种绿盲蝽偏好寄主植物挥发物、绿叶挥发物、萜烯类物质和引起绿盲蝽较强EAG反应的气味物质的结合能力进行测定。结果表明AlucOBP13结合谱较窄,只能结合β-紫罗酮,我们推测AlucOBP13可能是普通气味分子结合蛋白(GOBP),在绿盲蝽寄主定位和寄主转移过程中发挥着重要的作用;AlucOBP17能与盲蝽性信息素类似物丁酸辛酯、己酸己酯以及棉花挥发物十二醛、花香类物质β-紫罗酮有效的结合,我们推测AlucOBP17可能是潜在的PBP,并在绿盲蝽识别性信息素、寄主定位和寄主转移过程中发挥着重要的作用。

关键词：绿盲蝽转录组测序气味结合蛋白系统发育树组织表达谱气味结合特性

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美洲斑潜蝇气味结合蛋白OBP13的鉴定与功能

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中国农业科学 2018年第5期51卷 893-904页

作者：陈东凯张林雅邢振龙雷仲仁中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室上饶师范学院生命科学学院

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇... 详细信息

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化,获取重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为337 nm,以1-NPN为荧光探针,研究OBP13与25种不同气味配基的结合特性。使用间接免疫荧光染色技术及制备的OBP13的特异性多克隆抗体,对其在组织中的分布情况进行定位。将美洲斑潜蝇触角进行包埋、切片、免疫染色,并在激光共聚焦显微镜下进行观察,了解OBP13在触角感器中的亚细胞分布。【结果】获得了一个美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因,命名为LsatOBP13(Gen Bank登录号:KT250751)。LsatOBP13开放阅读框全长462bp,编码153个氨基酸,预测成熟蛋白分子量为17.80 kD,等电点为5.75,N-末端的前17个氨基酸为信号肽序列。具有4个保守的半胱氨酸位点,为Minus-C OBP。系统发育分析显示,其与地中海实蝇Ccap OBP99a-like位于同一小分支上,亲缘关系较近。检测LsatOBP13在不同组织的表达水平,发现LsatOBP13在触角中的表达量远远高于其他组织。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。对25种气味配基的结合能力检测,发现LsatOBP13与反式-2-己烯醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-紫罗兰酮、苯并噻唑、β-紫罗兰酮具有较强的结合能力,解离常数分别为12.592、10.995、11.165、11.224、10.336、9.218μmol·L,其中与β-紫罗兰酮亲和能力最强。通过免疫荧光定位,发现其在触角中主要定位在毛形感器和锥形感器上,在触角嗅觉窝及触角芒连接处也有分布。【结论】美洲斑潜蝇OBP13为非典型的气味结合蛋白Minus-C OBP。表达情况、气味结合特性、免疫定位结果表明,OBP13主要存在于美洲斑潜蝇触角中,参与触角对绿叶植物中大量存在的气味物质的识别过程,推测其在美洲斑潜蝇嗅觉识别、寄主植物定位中发挥功能。

关键词：美洲斑潜蝇气味结合蛋白序列分析表达情况气味结合特性免疫荧光定位

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三叶斑潜蝇气味结合蛋白的鉴定及功能研究

三叶斑潜蝇气味结合蛋白的鉴定及功能研究

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作者：陈东凯中国农业科学院

学位级别：硕士

三叶斑潜蝇Liriomyza trifolii,是一种多食性的世界性害虫,危害多种蔬菜、花卉,造成产量和品质下降。气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)是一类存在于昆虫嗅觉感器淋巴液中的小分子酸性蛋白,特异性识别气味分子,并将化学信号传... 详细信息

三叶斑潜蝇Liriomyza trifolii,是一种多食性的世界性害虫,危害多种蔬菜、花卉,造成产量和品质下降。气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)是一类存在于昆虫嗅觉感器淋巴液中的小分子酸性蛋白,特异性识别气味分子,并将化学信号传递到受体,引发嗅觉反应。本研究通过对三叶斑潜蝇进行转录组测序,鉴定并克隆气味结合蛋白基因,对其时空表达情况进行分析,进行原核表达及纯化,研究其气味结合特性及免疫定位情况,为三叶斑潜蝇气味结合蛋白研究及其嗅觉机制提供理论依据,为绿色防治三叶斑潜蝇提供新的思路和方法。通过对转录组测序结果进行筛选和验证,最终得到9个三叶斑潜蝇气味结合蛋白基因,命名为LtriOBP1-9,分为三个亚家族:7个Classic OBPs,1个Minus-C OBP和1个Dimer OBP,而9个三叶斑潜蝇OBPs的无根进化树显示其之间的同源性较低,但与美洲斑潜蝇的气味结合蛋白具有非常高的同源性。采用qPCR技术,对其进行时空表达分析发现:在不同发育阶段,LtriOBP5在幼虫期大量表达,LtriOBP4在蛹期大量表达,剩下的7个LtriOBPs均在成虫期大量表达,且雄虫表达量均高于雌虫,雄虫表达量随日龄上升或者下降。在不同组织部位中,除了在触角中特异性表达,还有的在头部,足部具有一定的表达量。LtriOBPs时空表达的差异性,侧面反映出其不仅参与嗅觉过程,还参与味觉反应、生长发育等过程相关。为了进一步研究得到的三叶斑潜蝇气味结合蛋白的蛋白功能,对7个三叶斑潜蝇气味结合蛋白进行了原核表达及纯化,获得了具有高纯度的目的蛋白。使用1-NPN为荧光探针,测定LtriOBP1-7与25种气味物质的结合能力。LtriOBP1与13种气味物质有结合,其中与β-紫罗兰酮,亚油酸有较强的结合能力;LtriOBP2与21种气味物质有结合,其中与β-紫罗兰酮,1-辛烯-3-醇,苯并噻唑结合能力最强;LtriOBP3与9种气味物质有结合,与β-紫罗兰酮结合能力较强;LtriOBP4只与3种气味物质:苯并噻唑,芳樟醇,对乙基苯乙酮有结合,且结合能力均较弱;LtriOBP5只与3种气味物质:α-紫罗兰酮,亚油酸,亚麻酸有结合,其中与亚麻酸结合能力最强;LtriOBP6与8种气味物质有结合,其中与芳樟醇,亚油酸有较强结合能力;LtriOBP7与21种气味物质均有较强的结合能力,其中与油酸,β-紫罗兰酮,亚油酸有很强的结合能力。三叶斑潜蝇气味结合蛋白的结合特性为其引诱剂和驱避剂的开发利用提供参考。利用冷冻切片、免疫荧光染色技术对LtriOBP1-7在三叶斑潜蝇头部、口器、前足附节及幼虫和蛹中的蛋白分布情况进行研究。在对触角鞭节的蛋白定位中发现,毛形感器和腔锥感器存在着多种具有广谱性结合气味物质能力的LtriOBPs,表明这两种感器可能参与三叶斑潜蝇对寄主植物的识别、定位过程等多种嗅觉反应。而锥形感器中存在的OBPs对气味更具有选择性,表明锥形感器可能参与特异性的气味识别过程。此外,还发现LtriOBP2、5分布于触角的梗节中,说明梗节也参与嗅觉反应。在口器中定位到LtriOBP2、5、6,印证了其在头部的高表达量,也证实其可能参与味觉反应。存在于三叶斑潜蝇复眼中的LtriOBP2,可能参与转运视觉色素的过程。在足部定位到LtriOBP2、6、7,可能参与三叶斑潜蝇足部对非挥发性物质的味觉反应。三叶斑潜蝇的气味结合蛋白广泛分布于多种组织结构中,具有多种多样的生理功能。

关键词：三叶斑潜蝇气味结合蛋白表达情况气味结合特性免疫荧光定位

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