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DUSP2敲除提高早期斑马鱼毛特纳细胞的轴突再生能力

DUSP2敲除提高早期斑马鱼毛特纳细胞的轴突再生能力

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作者：邵国健中国科学技术大学

学位级别：硕士

脊髓损伤日趋成为一个重大的科学问题。脊髓损伤后,轴突如何完成形态结构的再生和功能上的恢复,是再生医学中值得关注的研究热点。对于哺乳动物而言,中枢神经轴突损伤后难以完成形态上的再生和功能上的恢复。而哺乳动物的外周神经以及... 详细信息

脊髓损伤日趋成为一个重大的科学问题。脊髓损伤后,轴突如何完成形态结构的再生和功能上的恢复,是再生医学中值得关注的研究热点。对于哺乳动物而言,中枢神经轴突损伤后难以完成形态上的再生和功能上的恢复。而哺乳动物的外周神经以及低等模式动物,如斑马鱼的中枢神经系统,在损伤后展现出了强大的再生能力。这种再生不仅能恢复轴突的长度,还能重建突触间的连接,实现功能上的恢复。近年来应用各种模式动物探究轴突再生已取得一些突破,发现了许多影响轴突再生的关键因素。这些因素总的来说可以分为两类,内在因素和外在因素。外在因素的研究主要集中在神经元及其轴突所处的外在环境,如胶质疤痕、急性免疫、少突胶质细胞成髓鞘等。内在因素则包括了神经元本身的生理特征和细胞内发生的事件,如与神经元活性相关的钙活动、内在基因表达、一些细胞器的活动等。迄今为止,越来越多关于轴突再生的机制在线虫、斑马鱼以及小鼠中得到阐述,但是我们对其依然缺乏深刻的认知,无法全面阐明哺乳动物中枢神经轴突很难再生的原因。因此,对轴突再生机制的探索还需要不断展开。在本研究中,通过分析高通量测序的数据,我们筛选到了一个影响轴突再生的潜在基因,双特异性磷酸酶 2(dual specificity phosphatase 2,dusp2)。dusp2属于双特异性磷酸酶家族,与其家族成员功能相似,可以同时使磷酸酪氨酸和磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸残基去磷酸化,从而调控丝裂原活化蛋白激酶家族的激活。为了探究dusp2在轴突再生中的作用,我们利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼上敲除这个基因,随后利用双光子损毁斑马鱼幼鱼的毛特纳细胞轴突,观察损毁轴突的再生情况。损毁两天后的成像结果显示,dusp2敲除后,轴突再生的长度显著增加。之后,我们使用单细胞电穿孔技术,在单个毛特纳细胞内过表达dusp2,进一步验证这个基因的功能。过表达之后的成像结果显示,轴突再生受到显著抑制。同时,蛋白质免疫印迹和实时荧光定量PCR验证了dusp2缺失影响了c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化,并提高下游基因转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)的 mRNA水平。综上所述,dusp2缺失可能会通过提高JNK磷酸化水平促进毛特纳细胞轴突再生。

关键词：轴突再生双特异性磷酸酶2 单细胞电穿孔 c-Jun氨基末端激酶毛特纳细胞

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