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明胶海绵培养间充质干细胞来源的条件培养基对毛囊周期转换的作用及初步机制研究

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明胶海绵培养间充质干细胞来源的条件培养基对毛囊周期转换的作用...

作者：闫永静锦州医科大学

学位级别：硕士

目的1、研究明胶海绵支架培养的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源的条件培养基(conditioned medium,CM)对小鼠毛囊(hair follicles,HFs)周期转换的作用。2、研究明胶海绵支架培养的MSCs来源的CM对小鼠HFs周期转换作用的... 详细信息

目的1、研究明胶海绵支架培养的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源的条件培养基(conditioned medium,CM)对小鼠毛囊(hair follicles,HFs)周期转换的作用。2、研究明胶海绵支架培养的MSCs来源的CM对小鼠HFs周期转换作用的机制。方法1、获取我院产科健康孕妇的脐带,通过组织贴壁培养法得到原代MSCs,消化传代培养,扩增得到第三代MSCs,通过流式细胞术,免疫荧光染色以及三系分化进行鉴定。将MSCs种植于明胶海绵中进行3D培养。加入50μg/m L的抗坏血酸,进行连续培养,每两天对其进行换液,通过活/死细胞染色检测其活力。收集培养第3、7、10天的CM,通过冻干法进行浓缩处理,用于后续实验。2、取7周龄雄性C57BL/6小鼠18只,分成3组,PBS组,CM组,米诺地尔组,PBS组和CM组分别进行皮下注射300μL,米诺地尔逐日进行涂抹,持续处理两周,拍照记录背部皮肤的颜色变化以及毛发生长情况。第14天,断颈法处死小鼠并采集背部皮肤样本,部分样本冷冻于-80℃用于WB分析,其余部分用4%PFA固定用于组织学分析。通过HE染色观察背部皮肤HFs数量,通过ALP染色观察毛乳头ALP活性,通过免疫荧光染色观察K15和PCNA阳性数量。3、培养人头皮毛乳头细胞,传代培养至第三代。通过细胞划痕实验、CCK-8增殖实验,q RT-PCR实验观察CM对细胞迁移,增殖以及ALP基因表达的影响。4、通过WB检测Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin和LEF-1的表达来研究CM的作用机制。结果1、通过组织贴壁培养法成功培养出原代MSCs,流式细胞术检测出细胞高表达CD73、CD105、CD44、CD29、CD90,低表达CD45、HLA-DR、CD34、CD31、CD14、CD19,免疫荧光检测细胞高表达CD73、CD44、CD105、CD90、Oct4、c-MYC,低表达CD29、nanog、CD31、HLA-DR、CD45。三系分化表明细胞能够在体外诱导分化成脂肪、骨、软骨细胞。细胞在明胶海绵中生长状况良好,活/死染色表明在整个培养过程中细胞活力较高。收集了培养第3、7、10天的CM,冻干浓缩用于后续实验。2、CM皮下注射后,大体观察显示CM处理组小鼠背部皮肤较快实现了休止期到生长期的转换,灰度分析结果显示,cm处理组在第11天、14天呈现较PBS组更黑的皮肤颜色(P<0.05),HE染色结果显示CM组有更多的HFs(P<0.001),ALP染色显示CM处理组的毛乳头区域染色范围更大(P<0.001),免疫荧光染色显示CM处理组K15,PCNA阳性数量更多(P<0.001)。总而言之,CM能够促进HFs休止期向生长期的转换。3、CM能够促进毛乳头细胞迁移,增殖以及ALP基因的表达。4、WB结果显示CM处理组背皮组织β-catenin、LEF-1表达上调。结论明胶海绵培养MSCs来源的CM能够促进HFs休止期向生长期的转换,可能是通过激活Wnt/β-catenin通路实现这种转换,MSCs的衍生物可能成为治疗脱发的有前途的选择。

关键词：间充质干细胞条件培养基明胶海绵脱发毛囊周期米诺地尔

IGF-1和IGF-2在成年牦牛皮肤毛囊生长周期中的表达与定位

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核农学报 2022年第10期36卷 1929-1936页

作者：魏鹏强崔燕余四九李仕杰牛静勇张虔甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程研究中心甘肃兰州730070 天祝县动物疫病预防控制中心甘肃天祝733200

为探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子2(IGF-2)对成年牦牛皮肤毛囊生长周期转换的影响,本研究采集成年牦牛毛囊生长期、退行期和休止期的皮肤,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学(I... 详细信息

为探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子2(IGF-2)对成年牦牛皮肤毛囊生长周期转换的影响,本研究采集成年牦牛毛囊生长期、退行期和休止期的皮肤,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学(IHC)方法检测IGF-1和IGF-2在毛囊生长周期过程中皮肤的表达与定位。qRT-PCR结果显示,IGF-1和IGF-2 mRNA转录水平均在毛囊生长期皮肤中最高,在休止期皮肤中最低,且在各个时期之间差异显著(P毛囊生长期皮肤中最高,且显著高于毛囊退行期和休止期皮肤(P毛囊生长期、退行期和休止期皮肤中表达位置基本相同,主要定位于皮肤表皮、毛囊外根鞘和毛母质细胞。综上所述,IGF-1和IGF-2都参与毛囊生长周期的调控,并具有协同作用的关系,且该过程可能通过影响上皮细胞的活性来促进毛囊的生长。本研究结果为进一步探讨IGF-1和IGF-2在牦牛毛囊周期循环中的调控机制提供了理论依据。

关键词：成年牦牛毛囊周期胰岛素样生长因子1(IGF-1) 胰岛素样生长因子2(IGF-2)

mTOR复合物组分Raptor和Rictor在小鼠毛囊周期中的表达与定位

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中南大学学报（医学版） 2019年第7期44卷 725-730页

作者：陈梦婷谢红付刘芳芬徐伞李吉邓智利中南大学湘雅医院皮肤科中南大学湘雅医院分子医学研究中心器官损伤衰老与再生医学湖南省重点实验室长沙410008

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)复合物组分Raptor和Rictor在小鼠毛囊周期中的表达与定位及其意义。方法:通过增殖标志物Ki-67的免疫荧光染色确定所用出生后不同时间的小鼠背部皮肤与所报道的毛... 详细信息

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)复合物组分Raptor和Rictor在小鼠毛囊周期中的表达与定位及其意义。方法:通过增殖标志物Ki-67的免疫荧光染色确定所用出生后不同时间的小鼠背部皮肤与所报道的毛囊周期阶段是否准确对应。采用real-time PCR技术检测Raptor和Rictor mRNA在出生后43 d(P43,静止期早期)、56 d(P56,静止期中期)、69 d(P69,静止期末期)、74 d(P74,生长期早期)中的表达情况;采用免疫荧光共染技术进一步检测Raptor和Rictor蛋白在上述各个时期中的表达与定位。结果:Ki-67免疫荧光结果表明所选取的小鼠皮肤与其所处毛囊周期阶段准确对应。Real-time PCR和免疫荧光检测结果表明:Raptor和Rictor mRNA在毛囊周期各时期的毛囊中表达差异无统计学意义(P>0.05);Raptor特异表达于毛囊隆突部的毛囊干细胞中,而Rictor主要表达在毛囊内根鞘中。结论:Raptor和Rictor的表达水平在毛囊周期各时期并未见明显差异,但Raptor会特异表达于毛囊干细胞中,而Rictor特异表达在内根鞘中,提示Raptor可能是毛囊干细胞的分子标志物之一,Rictor可能参与内根鞘的维持及毛干的形成。

关键词：毛囊周期哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 Raptor Rictor 毛囊干细胞内根鞘

牦牛毛囊单细胞转录图谱的构建及其周期转换分析

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牦牛毛囊单细胞转录图谱的构建及其周期转换分析

作者：郑青波西北民族大学

学位级别：硕士

牦牛复杂的混合型毛被结构及绒毛的季节性生长,将有助于其在高寒高海拔地区生存。毛囊作为毛绒产生的微型器官,不断经历退行期、休止期和生长期三个阶段。毛囊的持续再生循环是一个十分复杂的过程,涉及不同类型的细胞相互作用来共同调... 详细信息

牦牛复杂的混合型毛被结构及绒毛的季节性生长,将有助于其在高寒高海拔地区生存。毛囊作为毛绒产生的微型器官,不断经历退行期、休止期和生长期三个阶段。毛囊的持续再生循环是一个十分复杂的过程,涉及不同类型的细胞相互作用来共同调控毛囊结构的形成。单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术可以在不同组织器官单细胞水平突出细胞异质性。因此,研究毛囊中细胞类型多样性与毛囊形态发生的关系,以及毛囊中不同细胞类型的调控作用,为解析毛囊中细胞功能多样性提供科学依据。为了探究牦牛毛囊周期性转换的分子调控作用,本研究采集牦牛的肩胛处皮肤组织,制备单细胞悬液用于scRNA-seq。对毛囊生长期与退行期、休止期与生长期的细胞进行了转录图谱的构建,借助已知的参考标记基因对主要细胞类群进行分类,通过t-分布随机近邻嵌入聚类、均匀流形近似和投影聚类、基因本体论和拟时序分析,解析毛囊从生长期到退行期、休止期到生长期形态变化过程,并对主要细胞类型分子途径进行阐述。主要结果如下:1.为了剖析毛囊形态发生过程中的细胞异质性,对牦牛毛囊生长期、退行期和休止期三个时期进行scRNA-seq,获得细胞数目达到3万个。基于Seurat函数对数据集进行质控,检测到三个时期中每个细胞的基因以及nCount＿RNA总数。2.从生长期和退行期共获得了19个细胞簇,确定了8个主要细胞群,并对得到的细胞分子特征进行了进一步的富集分析。结果表明毛囊从生长期向退行期转换过程中主要涉及的细胞有表皮细胞系、内根鞘(inner root sheath,IRS)以及毛干(hair shaft,HS)细胞等,富集结果显示主要涉及的细胞特异性表达基因在表皮发育、上皮细胞分化以及伤口愈合等条目中显著富集。3.通过拟时序分析,描绘了毛囊从生长期向退行期转换过程中表皮与真皮细胞谱系在毛囊周期中的分化轨迹以及主要细胞拟时间基因表达变化。对表皮向HS和IRS细胞特化过程进行了描述,在HS和IRS特化过程中高表达LHX2、KRT25和KRT71等基因,而这些基因与小鼠HS和IRS特化中表达结果具有相似性。4.在单细胞水平上对牦牛毛囊从休止期向生长期转换过程中主要细胞类型进行了筛选鉴定,利用均匀流形近似和投影聚类,得到HS、IRS以及毛乳头(dermal papilla,DP)细胞等主要细胞类型。基于拟时序分析成功构建了DP细胞分化轨迹,系统的阐述了DP细胞特化过程中基因表达变化情况,揭示了参与DP细胞命运的关键基因与功能。综上所述,本研究从单细胞水平阐述了牦牛毛囊周期转换过程中生长期与退行期真皮细胞谱系和表皮细胞谱系在分化过程中差异基因随着时间表达变化过程,鉴定了主要细胞类型,展示了主要细胞类型命运特化规律,同时构建了休止期与生长期毛囊转变过程中单细胞转录组图谱,绘制了DP细胞谱系分化轨迹,对休止期与生长期毛囊转变过程中的DP细胞群进行了更为系统和全面的解析。通过scRNA-seq对毛囊周期中不同类型细胞进行分析,为牦牛毛绒周期的生长发育提供理论和数据支持。

关键词：牦牛毛囊周期 scRNA-seq 拟时序分化轨迹

毛囊周期中毛囊周围血管新生变化及其调控机制的研究进展

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复旦学报（医学版） 2006年第4期33卷 563-565页

作者：孙春秋杨勤萍复旦大学附属华山医院皮肤科上海200040

近年来的研究发现，在以脱发为特征的疾病如雄激素性脱发中，毛囊周围血管新生的减少可能起着关键性的作用。毛囊周期中毛囊周围血管新生变化及其调控机制的研究国外尚属起步阶段，国内还没有相关报道。毛囊周围血管新生调节机制的阐明... 详细信息

近年来的研究发现，在以脱发为特征的疾病如雄激素性脱发中，毛囊周围血管新生的减少可能起着关键性的作用。毛囊周期中毛囊周围血管新生变化及其调控机制的研究国外尚属起步阶段，国内还没有相关报道。毛囊周围血管新生调节机制的阐明，将为毛发疾病发病机制和治疗的研究提供良好的基础。

关键词：脱发毛囊周期血管新生

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毛囊周期性中肿瘤坏死因子受体1的表达

第三军医大学学报 2013年第14期35卷 1437-1441页

作者：赖向东白秀峰余裕王丽娟杨恬杨力连小华钟莉重庆大学生物工程学院国家“111计划”基地重庆400044 第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室重庆400038

目的探讨肿瘤坏死因子受体1(TNFR-1)在毛囊周期中表达的规律及意义。方法采用石蜡切片免疫荧光、Western blot、RT-PCR检测小鼠毛囊生长期(出生后8、15 d,P8d、P15d)、退化期(出生后18 d,P18d)和静止期(出生后24 d,P24d)各时期TNFR-1的... 详细信息

目的探讨肿瘤坏死因子受体1(TNFR-1)在毛囊周期中表达的规律及意义。方法采用石蜡切片免疫荧光、Western blot、RT-PCR检测小鼠毛囊生长期(出生后8、15 d,P8d、P15d)、退化期(出生后18 d,P18d)和静止期(出生后24 d,P24d)各时期TNFR-1的表达情况;免疫荧光检测毛囊细胞分化标记物AE13的周期性表达;TUNEL检测毛囊周期中的细胞凋亡情况。结果在4个时相点的皮肤中TNFR-1都存在不同强度的表达,RT-PCR与Western blot检测结果呈现出一致的规律,即从生长期中期(P8d)到生长期末期(P15d)呈现高表达趋势,退化期(P18d)和静止期(P24d)表达减弱并维持较低水平表达。免疫荧光的结果显示:TNFR-1表达在生长期主要表达于表皮层,毛囊的毛干和内根鞘以及毛母质,生长末期在外根鞘还出现明显表达;退化期在外根鞘、毛干及表皮层有表达,在次级毛芽出现很强的特异性表达;在静止期表皮层及杵状毛中呈现弱表达。AE13在生长期主要表达于表皮层以及毛干的皮质和毛小皮;退化期在毛干尤其是毛干基部端(即角质化区域和杵状毛形成区)强表达;在静止期弱表达于表皮层及杵状毛中。TUNEL检测凋亡结果显示:在生长期TUNEL阳性染色主要出现在表皮层,毛囊的毛干、内根鞘以及毛母质,生长末期还出现在外根鞘;在退化期出现在外根鞘、表皮层以及毛干基部端;在静止期P24d出现在表皮层、杵状毛、bulge区和皮脂腺。结论 TNFR-1表达于毛囊的各个时期,生长期中期到生长期末期呈现高表达趋势,退化期和静止期表达减弱并维持较低水平表达,其表达与毛囊细胞终末分化和凋亡有关。

关键词：肿瘤坏死因子受体1 毛囊周期表达小鼠

TGF-β/BMP/Smad信号通路及其参与毛囊发育及周期调控的研究进展

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解剖科学进展 2023年第6期29卷 667-670页

作者：张博文杨胜男田甜何雪徐学刚中国医科大学附属第一医院皮肤科辽宁沈阳110001 临沂市中心医院皮肤科山东临沂276401 宁夏医科大学总医院皮肤科宁夏银川750003

毛囊形成、发育及其周期性增长、静止、再生循环取决于细胞间复杂的信号通路网络相互作用。TGF-β/BMP/Smad信号通路信号配体、受体、转录因子及其相应基因的遗传突变、基因差异表达将影响毛囊发育和毛囊周期。本文就TGF-β/BMP/Smad信... 详细信息

毛囊形成、发育及其周期性增长、静止、再生循环取决于细胞间复杂的信号通路网络相互作用。TGF-β/BMP/Smad信号通路信号配体、受体、转录因子及其相应基因的遗传突变、基因差异表达将影响毛囊发育和毛囊周期。本文就TGF-β/BMP/Smad信号通路构成及其对哺乳动物毛囊发育及周期的调节机制进行简要综述。

关键词： Smad信号通路周期调控毛囊发育毛囊周期再生循环遗传突变 BMP 基因差异表达

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斑秃皮损的炎症浸润和毛囊周期改变特征

广东医学 2013年第6期34卷 867-871页

作者：张小婷赵莹张斌蔡泽明西兰巩毓刚杨建章星琪中山大学附属第一医院皮肤性病科广州510080

目的观察斑秃皮损炎症细胞的分布情况以及毛囊周期改变特点,初步探讨嗜酸性粒细胞和肥大细胞在斑秃皮损形成中发挥的作用。方法回顾分析136例斑秃患者临床表现、实验室检查、皮损病理改变,对组织片进行吉姆萨和免疫组化染色,观察嗜酸性... 详细信息

目的观察斑秃皮损炎症细胞的分布情况以及毛囊周期改变特点,初步探讨嗜酸性粒细胞和肥大细胞在斑秃皮损形成中发挥的作用。方法回顾分析136例斑秃患者临床表现、实验室检查、皮损病理改变,对组织片进行吉姆萨和免疫组化染色,观察嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞的分布特点,以及毛囊周期改变特点。结果 73.5%(100/136)斑秃患者的脱发皮损可见毛囊周围蜂窝状炎症浸润,多为病程短、处于疾病活动阶段患者。47.8%(65/136)斑秃患者存在嗜酸性粒细胞浸润,其中弥漫型斑秃患者皮损发生的概率较高。真皮浅深层比较,肥大细胞的数目及活化比例在深层毛囊周围多于浅层毛囊,而在浅深层血管周围则无区别。在浅层血管周围的肥大细胞数目以及深层毛囊活化肥大细胞数与血清IgE呈正相关关系。血管周围的真皮浅层CD8+T淋巴细胞浸润和真皮深层血管周围CD3+、CD4+T淋巴细胞浸润在活动期高于稳定期皮损。毛囊的终毛/毳毛比例方面,亚全秃/全秃/普秃患者较斑片型、弥漫型为低,病程大于2年较病程小于3个月者的比例低。脱发面积≤50%患者的终毛/毳毛比例均高于脱发面积76%～100%组。结论斑秃皮损中嗜酸性粒细胞、肥大细胞和CD8+T淋巴细胞浸润与斑秃毛囊终毛/毳毛比例降低和疾病活动性相关,真皮浅层血管周围的炎症浸润明显,说明这些细胞和真皮浅层在斑秃发病起重要作用。

关键词：斑秃嗜酸性粒细胞肥大细胞毛囊周期 T淋巴细胞

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JNK在小鼠毛囊周期中的动态表达

第三军医大学学报 2012年第22期34卷 2274-2277页

作者：王瑞敏星懿展郭海英何龙杨恬连小华查何彭惠民重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室重庆400038 重庆大学生物工程学院重庆400030

目的研究JNK在生后小鼠背皮毛囊周期中的表达规律及探讨其对毛囊周期的调控作用。方法选择生后不同时期(1、7、14、16、21、31 d)C57BL/6J小鼠54只,采用RT-PCR技术,检测JNK mRNA在小鼠背皮毛囊周期中的表达情况;采用Western blot和免疫... 详细信息

目的研究JNK在生后小鼠背皮毛囊周期中的表达规律及探讨其对毛囊周期的调控作用。方法选择生后不同时期(1、7、14、16、21、31 d)C57BL/6J小鼠54只,采用RT-PCR技术,检测JNK mRNA在小鼠背皮毛囊周期中的表达情况;采用Western blot和免疫组化技术,进一步检测JNK蛋白在毛囊周期中的表达规律。结果 RT-PCR检测结果表明,在毛囊周期中,JNK1在生长早期(生后7、31 d)表达最强,退化期(生后16 d)和静止期(生后21 d)维持较弱的表达;JNK2在各时相点均有中等强度表达。单因素方差分析显示,JNK1的表达水平在生长早期(0.99±0.02)与静止期(0.30±0.01)间存在显著差异(P毛囊生长期,JNK主要表达于毛母质和外根鞘;进入退化期,JNK表达于外根鞘和上皮索;静止期毛囊中无表达。结论 JNK在毛囊周期中呈动态表达模式,生长期JNK可能通过影响毛母质细胞的增殖和/或分化来调节毛囊生长;退化期JNK可能涉及毛囊细胞的凋亡过程。

关键词： JNK 毛囊毛囊周期小鼠表达