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鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶在毕赤酵母中的重组表达及其底物特异性研究

鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶在毕赤酵母中的重组表达及其底物...

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华东地区生物化学与分子生物学学会联合会2017年学术交流会暨安徽省生物化学与分子生物学学会理事会议

作者：李梦思曹敏杰刘光明集美大学食品与生物工程学院福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室

鲫鱼肌肉中存在一种水解特性类似于胰蛋白酶的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound senne proteinase,MBSP),由于其在生物体内含量少、分离纯化困难,因此有必要利用基因工程技术来大量获得以便进行后续研究。目前,鲫鱼MBSP基因... 详细信息

鲫鱼肌肉中存在一种水解特性类似于胰蛋白酶的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound senne proteinase,MBSP),由于其在生物体内含量少、分离纯化困难,因此有必要利用基因工程技术来大量获得以便进行后续研究。目前,鲫鱼MBSP基因序列已被克隆得到并实现在毕赤酵母菌中的诱导表达。对于其底物特异性的研究,主要采用定点突变引入突变位点来获得突变基因;突变基因分别与克隆载体、表达载体连接,经两轮测序确保表达载体开放阅读框架以及目的片段的完整性后,对带有突变基因的表达载体进行线性化处理以及DNA纯化回收,并利用电转化法将DNA导入到酵母细胞中;直至单菌落长成后做酵母转化子表型鉴定(Mut),选择阳性转化子诱导表达;表达产物经底物特异性检测,再结合分子对接方法对其底物特异性发生变化的原因进行分析。SDS-PAGE与Western blot结果表明,鲫鱼MBSP突变体毕赤酵母表达菌株的成功构建及诱导表达;底物特异性检测结果发现,与野生型MBSP相比,突变体S171A丧失了对Lys残基的水解能力;分子对接结果显示,当底物与酶结合口袋以及催化活性中心相互作用时,酶水解底物的能力最强;而当底物与酶的作用部位彻底偏离口袋与活性中心时,酶就不能切割对应底物。由于重组MBSP与胰蛋白酶一样,能水解蛋白产生小肽,因此热稳定性优于胰蛋白酶的重组MBSP有望应用于未来的质谱鉴定。对于生物活性肽的多样性主要取决于不同底物特异性的蛋白酶,因此底物特异性变化的重组MBSP也具有较好的应用价值。

关键词：鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶底物特异性毕赤酵母重组表达

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FAD葡萄糖脱氢酶生产工艺研究

FAD葡萄糖脱氢酶生产工艺研究

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作者：陈济民浙江大学

学位级别：硕士

当前全球糖尿病患者已超过4.25亿,血糖检测的全球市场容量高达200多亿美元。在酶电极法检测血糖的原料酶中,FAD葡萄糖脱氢酶（FAD-GDH）,能够避免麦芽糖和氧分压对葡萄糖测定的干扰,在当下及未来血糖检测领域有着较大的价值,研究制备FAD... 详细信息

当前全球糖尿病患者已超过4.25亿,血糖检测的全球市场容量高达200多亿美元。在酶电极法检测血糖的原料酶中,FAD葡萄糖脱氢酶（FAD-GDH）,能够避免麦芽糖和氧分压对葡萄糖测定的干扰,在当下及未来血糖检测领域有着较大的价值,研究制备FAD-GDH的生产工艺具有重要意义。天然来源的菌发酵FAD-GDH,存在表达水平低、发酵液成分复杂难于纯化等问题。已报道的FAD-GDH重组表达,停留在摇瓶和小规模发酵水平,缺少对大规模发酵、发酵液预处理、柱层析等过程的详细阐述。建立重组FAD-GDH生产工艺,需要解决FAD-GDH基因及表达菌的选择、重组表达菌的构建、培养条件的选择、发酵的放大验证、发酵液的预处理和蛋白纯化条件验证等问题。本文通过分析和比较不同来源的FAD-GDH酶的性质及当前生产水平,从酶的特异性、比酶活、当前产量、专利限制等因素考虑,发现土曲霉来源的FAD-GDH具有工业化应用的潜力。从外源蛋白表达水平、表达后的修饰、培养的复杂性等方面考虑,进行了毕赤酵母X-33及pPICZα载体构建FAD-GDH表达菌的验证。通过单因素实验比较分析了四种碳源,发现甘油更适于FAD-GDH重组毕赤酵母的培养和表达。设置不同pH条件下的诱导,发现pH 6.0的条件较pH4.0、pH 5.0、pH 5.5条件更为合适。在摇瓶和发酵罐两个规模水平上,通过不同诱导温度的实验,发现30℃的诱导温度在表达量和产FAD-GDH的比酶活上优于25℃和33℃条件下的诱导。进行不同批次的单因素发酵实验,发现诱导过程中9 ml/（L*h）的甲醇流速较6 ml/（L*h）和12ml/（L*h）合适,发现溶氧水平影响发酵过程产酸和发酵色素产生。验证了发酵规模从10L至100 L的放大,产酶量达到7736 KU。在发酵液预处理方面,发现混纤滤膜的过滤效果好于聚醚砜滤膜,采用不同孔径滤膜级联过滤的方法,过滤时长缩短50%。发现上样量对柱填料体积超过7mg/ml时,会发生上样流穿损失增大的现象。柱层析过程中,在1 cm/min的线性流速下,蛋白回收率及纯化效率较高,Buffer A中添加30 mM的咪唑,会降低蛋白回收率,但能提升酶纯化后的比酶活。本文研究方法所获得的FAD-GDH应用于血糖试纸时,电流信号与血糖浓度线性相关系数达到0.9997,批间试纸条CV值小于15%。在-20℃条件下,保存4个月,酶的应用性能仍符合血糖试纸用酶的要求。本研究验证了 FAD-GDH从基因选取、菌种构建、发酵表达到分离纯化各生产工序的参数,积累了重要数据,为FAD-GDH工业化生产积累了重要经验。

关键词： FAD葡萄糖脱氢酶毕赤酵母重组表达发酵工艺发酵液预处理蛋白纯化

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