检索结果-南通市图书馆

构建HSA-G4SKNNNKG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活性分析

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

构建HSA-G4SKNNNKG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活...

作者：郭跃东河南师范大学

学位级别：硕士

豹蛙抗瘤酶(ONC)是一种提取自豹蛙的卵细胞,又被称为两栖酶、抗肿瘤酶p30蛋白等,属于核糖核酸酶A的超家族成员,对于肿瘤细胞具有很强的杀伤力。但豹蛙抗瘤酶是一种天然的蛋白质,所以来源有限,产量极低,限制了其在临床上的广泛应用,该问... 详细信息

豹蛙抗瘤酶(ONC)是一种提取自豹蛙的卵细胞,又被称为两栖酶、抗肿瘤酶p30蛋白等,属于核糖核酸酶A的超家族成员,对于肿瘤细胞具有很强的杀伤力。但豹蛙抗瘤酶是一种天然的蛋白质,所以来源有限,产量极低,限制了其在临床上的广泛应用,该问题用基因工程方法得到了很好的解决。此外,人血清白蛋白(HSA)有着广泛的生物学作用,用基因工程方法制备高表达重组的HSA能够在医疗方面得到很高的利用价值。将ONC的抗肿瘤特性和HSA的生物学作用结合起来,制备出一种高活性和高表达特性的融合蛋白,无论是在医学和研究上都会获得巨大的影响力。所以,本实验室利用HSA的高表达的特点,通过对连接肽的构思和设计,构建了HSA-ONC融合蛋白,既满足了豹蛙抗瘤酶的生物学活性,又满足了对表达量的要求。为了能使融合蛋白成功表达,在柔性连接肽(GGGGS)的基础上,加入KNNNK,形成具有高度正负离子化和高度亲水性的GSKNNNKGS连接肽,使融合蛋白的水溶性有所提高,从而达到蛋白的分离纯化更容易进行的目的,希望该连接肽既可以不影响它连接的两个蛋白的生物学活性,又有利于保持甚至提高两个蛋白的表达量和对肿瘤细胞的选择性。本实验利用实验室具有的重组质粒pPIC9K?HSA和pPIC9K?ONC,在融合蛋白HSA-GSKNNNKGS-ONC之间加入提前设计好的连接肽GSKNNNKGS。步骤为:首先设计引物,用重叠PCR技术完成HSA-GSKNNNK GS-ONC序列的合成,将合成的序列连接到扩增载体pMD20-T上,形成重组(扩增)的质粒pMD20-T?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC。将重组质粒导入大肠杆菌DH5α中进行培养,然后进行阳性克隆筛选和鉴定,将正确的阳性菌进行扩大培养。提取(扩增)质粒,用扩增好的重组质粒pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC导入大肠杆菌DH5α中培养,筛选出正确的菌株扩大进行培养。然后提取重组(表达)质粒导入GS115毕赤酵母细胞中,构建GS115?pPIC9K?HSA-GSKNNNKGS-ONC毕赤酵母工程菌,筛选出正确的阳性毕赤酵母工程菌GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC,留作后续实验使用。将上述毕赤酵母工程菌GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC扩大培养,然后通过发酵进行培养,用1%的甲醇诱导其表达,用5d的时间进行诱导,将发酵液离心后,通过SDS-PAGE方法检测上清液中的融合蛋白HSA-GSKNNNKGS-ONC的表达情况同时,对融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC进行分离纯化,将上清液中融合蛋白蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),分离胶浓度为10%,电压为90V,温度为4℃,得到目的蛋白,离心收集上清,真空冷冻干燥,得到融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC粉末,置于-80℃保存备用。然后检测融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC是否具有生物活性,具体方法为:准备好体外培养24h的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,分别用0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、2μM不同浓度的融合蛋白进行处理,经过48h的处理后,用MTT显色法检测其细胞的活性,结果表明融合蛋白对大鼠肝癌细胞CBRH-7919的半致死量(IC50)为0.64±0.06μM,细胞的活性随着药物浓度的增加呈现逐渐减弱的趋势,并且表现出对浓度的依赖性。然后用流式检测细胞周期相的分布和凋亡率,结果表明经融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC处理过的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,处于G0/G1期的细胞比例比对照组高,而处于S期和G2/M期的细胞比例开始减少,经过融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC处理过得细胞凋亡率与对照组相比明显增加,用Western Blot检测细胞内Caspas8、BAX蛋白的表达变化,结果促进细胞凋亡相关蛋白Caspas8、BAX表达上调,说明融合蛋白通过调节细胞凋亡相关蛋白表达来抑制肝癌细胞活性。综上所述,本文通过设计GSKNNNKGS连接肽,构建了重组(扩增)质粒pMD20-T?HSA-GSKNNNKGS-ONC、重组(表达)质粒pPIC9K?HSA-GSKNNNKGS-ONC和GS115?pPIC9K?HSA-GSKNNNKGS-ONC毕赤酵母工程菌,并且使融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC得到了成功的表达。分离纯化该蛋白并检测其生物学作用,发现融合蛋白对大鼠肝癌细胞通过调节细胞凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。

关键词：毕赤酵母工程菌重组人血清白蛋白重组豹蛙抗瘤酶连接肽融合蛋白表达

构建HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活性分析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

构建HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活...

作者：张照可河南师范大学

学位级别：硕士

近20年以来,现代生物技术快速发展并取得了一系列重大科技的进展和突破。尤其在医疗行业,基因工程制药的发展已经为人类的健康做出重大的贡献。其中,豹蛙抗瘤酶(ONC)是一种天然杀伤肿瘤细胞的核糖核酸酶。具有很强的肿瘤杀伤力,目前在... 详细信息

近20年以来,现代生物技术快速发展并取得了一系列重大科技的进展和突破。尤其在医疗行业,基因工程制药的发展已经为人类的健康做出重大的贡献。其中,豹蛙抗瘤酶(ONC)是一种天然杀伤肿瘤细胞的核糖核酸酶。具有很强的肿瘤杀伤力,目前在很多体内外的肿瘤研究中得到了很好的进展,但临床试验中使用的豹蛙抗瘤酶均提取与蛙卵和早期胚胎中的天然提取物,来源有限,获取困难,产量相对较少,难以实现临床需求。另一方面,已知人血清白蛋白(HSA)具有有酵母高表达的特性。把ONC与HSA两者作用结合起来,制备出一种既高活性又高表达的融合蛋白,将产生巨大的社会效益以及促进医疗行业的进步。由此,本实验室研究组已经从构建了融合蛋白HSA-ONC中得到了高表达的融合蛋白HSA-ONC。为进一步的提高HSA-ONC的表达量、抗肿瘤活性和对肿瘤细胞的选择性,本文拟通过在HSA和ONC之间加上特定连接肽实现上述目标。本次实验是在已有融合蛋白连接肽(GGGGS)基础上,插入本实验实构建的RKDRR序列片段,形成既有高度正负离子化又有高度亲水性的新型GSRKDRRGS连接肽。为了研究连接肽的作用,围绕构建表达融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC工程菌,表达融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC,分离纯化融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC,测定融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC的生物活性四个步骤展开实验,目的是达到不影响连接的两个蛋白活性的同时,又能保持甚至提高两个蛋白的表达量和对肿瘤细胞的选择性。在构建表达融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC工程菌时,利用本实验室构建的pPIC9K∕HSA和pPIC9K∕ONC重组质粒,用重叠PCR技术和阳性克隆筛选和鉴定构建重组(表达)质粒pPIC9K∕HSA-GSRKDRRGS-ONC及毕赤酵母工程菌GS115∕pPIC9K∕HSA-GS RKDRRGS-ONC,其次在表达融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC时,首先将GS115∕pPIC9K∕HSA-G SRKDRRGS-ONC毕赤酵母工程菌进行扩大培养,进行诱导表达。诱导5d后,将发酵液离心,取上清按SDS-PAGE方法检测融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC的表达情况。然后在分离纯化融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC时,取含有融合蛋白HSA-GSR KDRRGS-ONC的发酵液上清进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),电泳结束后,根据目的蛋白在胶板中位置切下目的蛋白,匀浆,洗出目的蛋白,离心收集上清,真空冷冻干燥,得到融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC粉末,置于-80℃保存备用。最后在测定融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC的生物活性时,用0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、2μM浓度的融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC处理体外培养24h大鼠肝癌细胞CBRH-7919,用MTT显色法检测药物处理48h后的细胞活性,结果表明对大鼠肝癌细胞CBRH-7919的半致死量(IC)为0.39±0.14μM。用流式检测细胞周期相的分布和凋亡率,结果表明经融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC处理过的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,处于G0/G1期的细胞比例比对照组高,而处于S期和G2/M期的细胞比例开始减少,融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC处理组的细胞凋亡率较对照组明显增加;用Western Blot检测细胞内Caspas8、BAX蛋白的表达变化,结果促进细胞凋亡相关蛋白Caspas8、BAX表达上调,说明融合蛋白通过调节细胞凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。综上所述,本实验通过设计了GSRKDRRGS连接肽,分离纯化该融合蛋白HSA-GSRKDRRGS-ONC并检测其生物学作用,发现融合蛋白对大鼠肝癌细胞的毒性强于正常细胞,并且通过调节细胞凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。

关键词：连接肽毕赤酵母工程菌融合蛋白表达大鼠肝癌细胞CBRH-7919 细胞凋亡

HSA-G4SKEEEKG4S-ONC毕赤酵母工程菌的构建及其表达产物的生物活性分析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

HSA-G4SKEEEKG4S-ONC毕赤酵母工程菌的构建及其表达产物的生物活...

作者：李玲玲河南师范大学

学位级别：硕士

随着生物技术的发展,以基因重组技术为基础的基因工程制药成为医疗行业的重要发展方向。其中,豹蛙抗瘤酶(ONC)是一种对肿瘤细胞有很强杀伤力的核糖核酸酶。但临床试验用的豹蛙抗瘤酶来自天然提取物,来源有限,产量极低,限制了其广泛应用... 详细信息

随着生物技术的发展,以基因重组技术为基础的基因工程制药成为医疗行业的重要发展方向。其中,豹蛙抗瘤酶(ONC)是一种对肿瘤细胞有很强杀伤力的核糖核酸酶。但临床试验用的豹蛙抗瘤酶来自天然提取物,来源有限,产量极低,限制了其广泛应用,用基因工程方法解决该问题势在必行。另一方面,人血清白蛋白(HSA)有广泛的生物学作用,若能用基因工程方法制备高表达重组HSA必将有重要的医疗价值和经济意义。若能进一步把ONC的抗肿瘤作用与HSA的广泛生物作用结合起来,制备出一种高活性和高表达特性的融合蛋白,将产生巨大的经济效益、社会效益和医疗价值。为此,本研究组已构建了融合蛋白HSA-ONC的毕赤酵母工程菌,得到了高表达的融合蛋白HSA-ONC。为进一步提高HSA-ONC的表达量、抗肿瘤活性和对肿瘤细胞的选择性,本文拟通过在HSA和ONC之间加上特定连接肽实现上述目标。本文在现有融合蛋白连接(GGGGS)基础上,加入KEEEK,形成具有高度正负离子化和高度亲水性的GSKEEEKGS连接肽。期望该连接肽即不影响它连接的两个蛋白的活性,又有利于保持甚至提高两个蛋白的表达量和对肿瘤细胞的选择性。在构建表达融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC工程菌时,利用本实验室构建的pPIC9K?HSA和pPIC9K?ONC重组质粒,在HSA和ONC之间加上连接肽GSKEEEKGS。具体方法是:设计引物,用重叠PCR技术合成HSA-GSKEEEK GS-ONC序列,构建重组(扩增)质粒pMD20-T?HSA-GSKEEEKGS-ONC,将其转入大肠杆菌DH5α受体菌中,进行阳性克隆筛选和鉴定。然后将鉴定正确的阳性菌扩大培养,提取(扩增)质粒,用它构建重组(表达)质粒pPIC9K?HSA-GSKEEEKGS-ONC,将其转入大肠杆菌DH5α受体菌中,进行阳性克隆筛选和鉴定,取正确的菌株扩大培养,提取重组(表达)质粒转入GS115毕赤酵母细胞,构建GS115?pPIC9K?HSA-GSKEEEKGS-ONC毕赤酵母工程菌,进行阳性克隆筛选和鉴定,取正确的毕赤酵母工程菌GS115?pPIC9K?HSA-GS KEEEKGS-ONC用于后续实验。在表达融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC时,将GS115?pPIC9K?HSA-GSKEEEK GS-ONC毕赤酵母工程菌进行扩大培养,然后进行发酵培养,1%甲醇诱导表达。诱导5d后,将发酵液离心,取上清按SDS-PAGE方法检测融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC的表达情况。在分离纯化融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC时,取含融合蛋白HSA-GSKEEEK GS-ONC的发酵液上清进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),其中,分离胶浓度为10%,电压为90V于环境温度为4℃,电泳结束后,根据目的蛋白在胶板中位置切下目的蛋白,匀浆,洗出目的蛋白,离心收集上清,真空冷冻干燥,得到融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC粉末,置于-80℃保存备用。在测定融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC的生物活性时,用0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、2μM浓度的融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC处理体外培养24h的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,用MTT显色法检测药物处理24h后的细胞活性,结果表明随着药物浓度的增加,细胞活性逐渐减弱,并且呈浓度的依赖性。用流式检测细胞周期相的分布和凋亡率,结果表明经融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC处理过的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,处于G0/G1期的细胞比例比对照组高,而处于S期和G2/M期的细胞比例开始减少,融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC处理组的细胞凋亡率较对照组明显增加;用Western Blot检测细胞内c-Jun和BAX蛋白的表达变化,结果表明细胞增殖相关蛋白c-Jun表达下调,促进细胞凋亡相关蛋白BAX表达上调,说明融合蛋白通过调节细胞增殖/凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。综上,本文设计了GSKEEEKGS连接肽,构建了重组(扩增)质粒pMD20-T?HSA-GSKEEEKGS-ONC、重组(表达)质粒pPIC9K?HSA-GSKEEEKGS-ONC和GS115?pPIC9K?HSA-GSKEEEKGS-ONC毕赤酵母工程菌,用它表达出了融合蛋白HSA-GSKEEEKGS-ONC。分离纯化该蛋白并检测其生物学作用,发现融合蛋白抑制CBRH-7919的增殖并且促进其凋亡,并且通过调节细胞增殖/凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。

关键词：毕赤酵母工程菌重组人血清白蛋白重组豹蛙抗瘤酶连接肽融合蛋白表达生物活性

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

毕赤酵母基因工程菌高密度发酵及其应用研究

黑龙江畜牧兽医 2016年第1期 41-45页

作者：刘晓明张爱忠姜宁王秋菊祁丽解堂东黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

构建重组毕赤酵母基因工程菌表达外源目的产物是获取新生物制品的有效途径,高密度发酵是实现这些产品规模化、低成本生产的关键技术。文章对影响毕赤酵母基因工程菌高密度发酵的因素和调控措施(如基因工程菌、培养基、生长阶段菌体密度... 详细信息

构建重组毕赤酵母基因工程菌表达外源目的产物是获取新生物制品的有效途径,高密度发酵是实现这些产品规模化、低成本生产的关键技术。文章对影响毕赤酵母基因工程菌高密度发酵的因素和调控措施(如基因工程菌、培养基、生长阶段菌体密度及比生长速率),以及发酵过程中参数调控和毕赤酵母基因工程菌高密度发酵的应用等进行了综述,并提出该体系存在的问题。

关键词：毕赤酵母工程菌高密度发酵菌体密度优化设计调控发酵参数

重组毕赤酵母发酵产甘露聚糖酶的工艺条件优化

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

重组毕赤酵母发酵产甘露聚糖酶的工艺条件优化

作者：熊鹏中南民族大学

学位级别：硕士

甘露聚糖酶因为其广泛的生物用途而被许多生物技术领域所关注和应用。甘露聚糖酶广泛存在于生物圈中,众多产该酶的生物种类中绝大多数属于微生物源。毕赤酵母发酵产甘露聚糖酶具备操作简单、易于进行高密度发酵、外源蛋白表达水平高、... 详细信息

甘露聚糖酶因为其广泛的生物用途而被许多生物技术领域所关注和应用。甘露聚糖酶广泛存在于生物圈中,众多产该酶的生物种类中绝大多数属于微生物源。毕赤酵母发酵产甘露聚糖酶具备操作简单、易于进行高密度发酵、外源蛋白表达水平高、生产成本低等优点而被酶制剂行业所青睐。本文选择对新构建的一株产甘露聚糖酶的重组毕赤酵母的液体发酵方案进行设计和优化,进而得到中试方案。1.先用摇瓶培养摸索出部分发酵工艺参数,得出最优发酵培养基的组成和配比,最适合的生长温度为28.0℃,最佳pH为4.80。2.用30 L发酵罐发酵对其余工艺参数进行优化,运用溶氧与代谢途径间的关联,高效的优化出其余发酵条件:接种量为0.6-0.9%,发酵最大风量控2.5 m/h,最大搅拌转速为600 rpm/min。3.将发酵过程分为3个时期:生长增菌期、过渡期、诱导产酶期,对每个时期的补料成分和流加速度进行发酵优化。生长增菌期主要是菌体数量的累积,采用甘油进行补料,甘油平均补速为540 g/h,流加10 h左右,此阶段结束时发酵液湿重控制在30%-40%范围,湿重低于30%产酶效率低,高于40%则后处理酶收率低;过渡期采用甘油:甲醇为4:1的混合液作为补料且平均补速为240 g/h,流加4 h左右,此阶段是菌体由生长增殖向诱导产酶的过渡,是代谢途径的转换过程,平稳过渡是菌体长时间高效产酶的基础;诱导期以甲醇为补料,补速为55-60 g/h,大约流加140h（具体时间至酶活不再增长为止）,补速过大菌体容易中毒死亡,补速低甲醇转化率不够、产酶量少。4.用30 L发酵罐对此工艺方案进行验证,发酵183 h放罐,发酵酶活可达到1650 U/mL,较初始摇瓶发酵酶活492 U/mL提高了335%,采用保持相等溶解氧浓度的放大法进行100 L中试放大,发酵过程和发酵酶活基本与30 L发酵罐一致,此工艺方案可以指导100 L发酵罐发酵产甘露聚糖酶。

关键词：毕赤酵母工程菌甘露聚糖酶甲醇酶活中试发酵

内切葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母GS115中的表达

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

内切葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母GS115中的表达

作者：王志强郑州大学

学位级别：硕士

纤维素是自然界中分布最广、数量最多的天然可再生碳水化合物,是D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接组成的线性大分子。纤维素酶是能降解纤维素的多种酶系的统称,属于糖基水解酶家族。依据作用方式不同大致可以三类：内切葡萄糖苷酶、外切葡... 详细信息

纤维素是自然界中分布最广、数量最多的天然可再生碳水化合物,是D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接组成的线性大分子。纤维素酶是能降解纤维素的多种酶系的统称,属于糖基水解酶家族。依据作用方式不同大致可以三类：内切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶。三类酶相互协同作用,将纤维素最终水解为葡萄糖。由于天然的微生物产纤维素酶量少、发酵条件复杂等原因,需要构建基因高产纤维素酶的工程菌。本论文具体的研究工作有：1、验证基因组DNA中内切葡聚糖酶基因egⅠ的存在。先提取DNA,采用PCR技术克隆到egⅠ基因,再将egⅠ连接到PMD18-T载体,连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株,挑取阳性克隆测序。测序结果显示内切葡聚糖酶基因(egⅠ-DNA)大小为833bp,在NCBI上比对后,用序列分析软件Vector NTI比对后发现该基因含有2个内含子和3个外显子,三个碱基发生突变。2、提取土曲霉M11 RNA,利用RT-PCR的方法,从土曲霉M11中克隆出了egⅠ的cDNA序列,测序结果显示egⅠ的cDNA序列的编码区为705bp,正好是DNA序列去除内含子后的外显子长度。3、构建表达载体。使用限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ消化pmd18T-egⅠ。将目的基因小片段连接到经过同样的内切酶双酶切的空穿梭载体载体pPIC9K。将连接产物转化到大肠杆菌中验证载体的构建。4、将重组表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,在甲醇的诱导下,酶得到表达。5、优化工程菌的发酵条件：如重组工程菌培养温度、初始pH、甲醇的浓度、摇床的转速、培养时间等。6、重组酶的性质的初步研究：分别研究了粗酶液的最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、pH稳定性、金属离子对酶活性的影响等。

关键词：土曲霉M11 内切葡聚糖酶克隆与表达毕赤酵母工程菌

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

一株产蛋白酶K工程菌发酵工艺的优化

一株产蛋白酶K工程菌发酵工艺的优化

作者：查宇华中农业大学

学位级别：硕士

蛋白酶K是一类对蛋白质类物质进行专一水解的酶,生产生活用途广泛,用量大。蛋白酶K最早于1974年从林伯氏白色念球菌中纯化得到。但一直以来天然菌株培养困难、产量过低的问题严重阻碍了蛋白酶K的实际应用。1985年测定其天然氨基酸序列后... 详细信息

蛋白酶K是一类对蛋白质类物质进行专一水解的酶,生产生活用途广泛,用量大。蛋白酶K最早于1974年从林伯氏白色念球菌中纯化得到。但一直以来天然菌株培养困难、产量过低的问题严重阻碍了蛋白酶K的实际应用。1985年测定其天然氨基酸序列后,多个国家的研究者及相关公司投入了很大力量尝试该蛋白的大规模重组表达,并于2000年前后在大肠杆菌系统中获得成功。但此方法只能得到包涵体蛋白,变复性过程导致酶活力损失严重;2008年后该蛋白的毕赤酵母系统分泌表达获得突破。至此,蛋白酶K的生产和应用进入了一个快速发展的时期。本实验室构建了一株能高效表达蛋白酶K的毕赤酵母工程菌,本文对此菌株的生长产酶特性及发酵工艺进行了研究。1.研究了该菌株的生长特性,表明:此株菌株的生长对数期在10～30h之间;2.研究获得摇瓶发酵的最佳条件:诱导期温度25℃,甲醇浓度1%,诱导期山梨醇添加量6g/L,诱导96h,发酵液的酶活力可达到7235.68U/ml;3.对罐上发酵进行了优化,罐上发酵的最佳条件为:诱导前菌体湿重积累至330g/L,甲醇采用指数-恒定速率方式流加,其中前12h采用指数流加,后改为恒定速率流加,速率基本维持在0.2ml/min/L,诱导期p H=4,诱导期温度为25℃,开始诱导时,一次性加入发酵液体积10%(w/v)的山梨醇固体。最终所获得发酵液中蛋白酶K酶活提高至15.0×10～4U/ml左右,为优化前的3倍;4.采用聚醚砜卷式膜过滤对发酵液进行纯化处理,得到纯度为98.69%蛋白酶K酶液;5.通过正交试验得到喷雾干燥制备酶粉的最佳参数为:进口温度160℃、保护剂PEG2万添加量为2%、雾化速度300L/h,得到的蛋白酶K酶粉能保留93.96%的酶活力;6.菌体回收后重复发酵的结果表明:首次发酵结束后所回收的菌体,经上罐重新诱导60h时,发酵液中蛋白酶K的酶活力可达到5.0×10～4U/ml以上,有一定回收利用价值,但进行第二轮重复发酵时,酶活下降至2.0×10～4U/ml,下降明显。综上所述,通过本课题的研究,将毕赤酵母工程菌表达蛋白酶K的表达量提高至国内外报道的最高水平,为工业化生产奠定了基础。

关键词：毕赤酵母工程菌蛋白酶K 甲醇补料重复发酵

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

一株产蛋白酶K工程菌发酵工艺的优化

一株产蛋白酶K工程菌发酵工艺的优化

作者：査宇华中农业大学

学位级别：硕士

蛋白酶K是一类对蛋白质类物质进行专一水解的酶,生产生活用途广泛,用量大。蛋白酶K最早于1974年从林伯氏白色念球菌中纯化得到。但一直以来天然菌株培养困难、产量过低的问题严重阻碍了蛋白酶K的实际应用。1985年测定其天然氨基酸序列后,多个国家的研究者及相关公司投入了很大力量尝试该蛋白的大规模重组表达,并于2000年前后在大肠杆菌系统中获得成功。但此方法只能得到包涵体蛋白,变复性过程导致酶活力损失严重;2008年后该蛋白的毕赤酵母系统分泌表达获得突破。至此,蛋白酶K的生产和应用进入了一个快速发展的时期。本实验室构建了一株能高效表达蛋白酶K的毕赤酵母工程菌,本文对此菌株的生长产酶特性及发酵工艺进行了研究。1.研究了该菌株的生长特性,表明:此株菌株的生长对数期在10～30h之间;2.研究获得摇瓶发酵的最佳条件:诱导期温度25℃,甲醇浓度1%,诱导期山梨醇添加量6g/L,诱导96h,发酵液的酶活力可达到7235.68U/ml;3.对罐上发酵进行了优化,罐上发酵的最佳条件为:诱导前菌体湿重积累至330g/L,甲醇采用指数-恒定速率方式流加,其中前12h采用指数流加,后改为恒定速率流加,速率基本维持在0.2ml/min/L,诱导期pH=4,诱导期温度为25℃,开始诱导时,一次性加入发酵液体积10%(w/v)的山梨醇固体。最终所获得发酵液中蛋白酶K酶活提高至15.0×10U/ml左右,为优化前的3倍;4.采用聚醚砜卷式膜过滤对发酵液进行纯化处理,得到纯度为98.69%蛋白酶K酶液;5.通过正交试验得到喷雾干燥制备酶粉的最佳参数为:进口温度160℃、保护剂PEG2万添加量为2%、雾化速度300L/h,得到的蛋白酶K酶粉能保留93.96%的酶活力;6.菌体回收后重复发酵的结果表明:首次发酵结束后所回收的菌体,经上罐重新诱导60h时,发酵液中蛋白酶K的酶活力可达到5.0×10U/ml以上,有一定回收利用价值,但进行第二轮重复发酵时,酶活下降至2.0×10U/ml,下降明显。综上所述,通过本课题的研究,将毕赤酵母工程菌表达蛋白酶K的表达量提高至国内外报道的最高水平,为工业化生产奠定了基础。

关键词：毕赤酵母工程菌蛋白酶K 甲醇补料重复发酵

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

重组人超氧化物岐化酶基因工程菌稳定性研究

科技创新与应用 2018年第4期8卷 11-12页

作者：李敏侯增淼李晓颖何越高恩杨小琳赵金礼陕西慧康生物科技有限责任公司陕西西安710054

目的:研究重组人超氧化物岐化酶毕赤酵母基因工程菌的遗传稳定性。方法:基因工程菌连续传代50次,每10代取样保藏菌种,通过对菌株形态、菌落形态、质粒稳定性、目的基因的PCR鉴定,蛋白表达的SDS-PAGE鉴定来评价工程菌的稳定性。结果:在... 详细信息

目的:研究重组人超氧化物岐化酶毕赤酵母基因工程菌的遗传稳定性。方法:基因工程菌连续传代50次,每10代取样保藏菌种,通过对菌株形态、菌落形态、质粒稳定性、目的基因的PCR鉴定,蛋白表达的SDS-PAGE鉴定来评价工程菌的稳定性。结果:在连续传代50代的过程中,菌株、落形态与原始工程菌相比无明显差异,质粒保有率高,PCR鉴定结果显示,重组载体携带目的基因传至50代未消失,SDS-PAGE结果表明,传至50代蛋白表达量无明显差异。结论:该工程菌有良好的遗传稳定性。

关键词：重组人超氧化物岐化酶毕赤酵母工程菌遗传稳定性