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致病疫霉RxLR效应蛋白Pi16275的毒性功能解析

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致病疫霉RxLR效应蛋白Pi16275的毒性功能解析

作者：杨祝强云南师范大学

学位级别：硕士

马铃薯是世界四大粮食作物之一,然而由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产上最具毁灭性的病害之一。致病疫霉通过分泌大量的效应蛋白到植物体内调控植物免疫反应。病原菌分泌的效应蛋白有毒性功能和/或... 详细信息

马铃薯是世界四大粮食作物之一,然而由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产上最具毁灭性的病害之一。致病疫霉通过分泌大量的效应蛋白到植物体内调控植物免疫反应。病原菌分泌的效应蛋白有毒性功能和/或无毒功能。毒性功能表现为:效应蛋白被分泌到寄主植物并抑制植物的免疫反应、促进病原菌的侵染;无毒功能表现为:效应蛋白被寄主植物抗病蛋白识别进而引起植物的免疫反应。课题组前期研究发现RxLR效应蛋白Pi16275兼具无毒和毒性功能。本研究通过对Pi16275的毒性功能进行解析,初步揭示了Pi16275在致病疫霉侵染马铃薯过程中发挥的作用。主要研究结果如下:1.瞬时超量表达Pi16275促进致病疫霉的侵染本研究利用q RT-PCR技术首先检测了Pi16275在侵染马铃薯不同时期的表达量。结果显示,Pi16275在致病疫霉侵染马铃薯48 h时的表达量最高,比侵染0 h增加83.0%。说明Pi16275在致病疫霉侵染早期上调表达,暗示Pi16275在致病疫霉侵染过程中发挥重要作用。随后,利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统在烟草叶片表皮细胞中瞬时超量表达Pi16275。实验结果表明,在烟草表皮细胞中超量表达Pi16275及GFP（对照）后接种致病疫霉,超量表达Pi16275的烟草叶片病斑面积显著大于对照病斑面积。说明,Pi16275的超量表达显著促进了致病疫霉的侵染,Pi16275在致病疫霉侵染马铃薯过程中发挥毒性功能。***16275定位在植物细胞核、细胞质及细胞膜利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统在烟草表皮细胞中表达融合蛋白（p RI101-GFP-Pi16275）。激光共聚焦显微镜观察结果显示,烟草表皮细胞的细胞核、细胞质及细胞膜中均有绿色荧光信号,说明Pi16275定位于植物细胞的细胞核、细胞质及细胞膜中。利用Western Blot检测Pi16275-GFP融合基因的表达情况,结果显示能够检测到与Pi16275-GFP融合蛋白预期大小一致的条带,说明Pi16275-GFP能够在烟草叶片中稳定表达。***16275在马铃薯中的靶标蛋白鉴定及功能初步研究通过酵母核文库筛选技术,本研究共初步筛选到了10个可能的候选靶标蛋白。利用点对点酵母双杂交技术,最终确定St RPSS、St MUC2和St VAEL三个蛋白与Pi16275存在互作。随后,利用病毒介导的基因沉默技术将St RPS5、St MUC2和St VAEL在烟草中的同源基因进行沉默。在烟草沉默植株的叶片上接种致病疫霉,发现沉默St RPS5的同源基因后显著降低了烟草叶片对致病疫霉的抗性,说明St RPSS在植物抵抗致病疫霉侵染过程中发挥重要作用。

关键词：致病疫霉马铃薯 RxLR效应蛋白毒性功能靶标蛋白

大豆疫霉EGZ018181和EGZ16653基因的抗药性机制与辣椒疫霉效应子PcRxLR207毒性功能研究

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大豆疫霉EGZ018181和EGZ16653基因的抗药性机制与辣椒疫霉效应子P...

作者：邹芬南京农业大学

学位级别：硕士

卵菌(Oomycetes)具有独特的生物地位,在分类上属于茸鞭生物界,形态上与真菌相似但在进化上与真菌相差甚远,严重威胁着全球粮食生产和自然生态系统的安全。疫霉属(Phytophthora)是卵菌中最臭名昭著的一类,有“植物杀手”之称。比如,由大... 详细信息

卵菌(Oomycetes)具有独特的生物地位,在分类上属于茸鞭生物界,形态上与真菌相似但在进化上与真菌相差甚远,严重威胁着全球粮食生产和自然生态系统的安全。疫霉属(Phytophthora)是卵菌中最臭名昭著的一类,有“植物杀手”之称。比如,由大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根腐病和致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病每年给全球带来约数十亿美元的经济损失。目前,疫霉病害的防治主要依靠杀菌剂和抗病品种的使用,但是由于疫霉菌变异速度快,杀菌剂靶标基因和无毒基因可以产生多种形式的变异以逃逸农药的毒性和新品种的识别:同时,在植物与疫霉菌互作的过程中,疫霉菌为了成功侵染,会分泌大量的效应子发挥毒性功能,调控植物的免疫。因此,准确地掌握疫霉菌抗药性机制和效应子毒性机理,理论上对于理解疫霉菌成灾机制,实践上对于杀菌剂的使用以及合理布局抗病品种具有重要意义。本研究对大豆疫霉两个基因在抗药性中的功能以及辣椒疫霉效应子RxLR207的毒性功能进行了较为系统的分析,并探究了其可能的分子机制,获得的主要结果与结论如下:大豆疫霉EGZ08181可能不是氟吡菌胺的作用靶标且不影响所测试生理表型。本研究通过对9个抗氟吡菌胺菌株进行重测序,再结合生物信息学分析,筛选了一个可能的抗氟吡菌胺基因EGZ08181,功能注释发现EGZ08181是一类Actin-related protein 2/3蛋白,在真菌病原菌的生长发育与致病过程中发挥重要作用。为了进一步确定EGZ08181是否为氟吡菌胺的作用靶标,我们分别利用CRISPR/Cas9技术和大豆疫霉介导的原生质体转化技术对该基因进行了敲除和过表达,获得了敲除转化子T17、T32、T88及过表达转化子T1、T3、T4,通过对转化子进行生长速率测定后发现均不影响生长,随后对转化子进行抗药性测定,发现转化子与野生型相比对氟吡菌胺均不敏感,猜测EGZ08181可能不是氟吡菌胺的作用靶标。为了探究EGZ08181敲除及过表达后对其他表型是否有影响,我们又进行了转化子菌丝形态、致病性、氧化压力测定,发现转化子在这些方面也均无差别。大豆疫霉EGZ16653可能不是甲霜灵的作用靶标但敲除后能影响菌丝生长。本研究前期对获得的6个抗甲霜灵菌株进行了基因组重测序,通过生物信息学分析筛选并进行PCR测序验证后获得了一个可能的抗甲霜灵靶标基因EGZ16653,功能注释后发现EGZ16653是一个糖基转移酶。为了进一步探究EGZ16653是否为甲霜灵的作用靶标,我们在野生型菌株中对该基因进行了敲除和过表达,并在抗药性菌株中对该基因进行了敲除。对转化子分析发现野生型及抗药性菌株中敲除获得的转化子对生长有明显的抑制作用,而过表达转化子则无影响。对过表达转化子进行抗药性检测后发现转化子与野生型相比对甲霜灵均不敏感,猜测EGZ16653可能不是甲霜灵的作用靶标。为了探究过表达EGZ16653后对其他表型是否有影响,我们又进行了转化子菌丝形态、致病性、氧化压力测定,发现转化子在这些方面也均无差别。辣椒疫霉效应子PcRxLR207是其毒性所必需的。前期研究发现PcRxLR207能够引起细胞死亡,并且能够诱导H2O2积累使得接种烟草后致病力下降。为了进一步评估PcRxLR207对辣椒疫霉毒力的作用,本研究使用CRISPR/Cas9技术对RxLR207进行了敲除,一共获得了 T11、T14两个敲除转化子,另外选择T3作为阴性对照。和WT及T3相比较,转化子T11、T14菌丝形态及生长速率没有改变。将转化子及WT菌株分别接种拟南芥及辣椒,与T3和WT相比较,敲除转化子的病斑变小致病性明显下降,明确了效应子PcRxLR207为辣椒毒性所必须,该结论为进一步研究该效应子的功能奠定了基础,为探索疫霉菌的致病机制提供了线索。

关键词：大豆疫霉辣椒疫霉氟吡菌胺甲霜灵抗药性 CRISPR/Cas9 毒性功能

致病疫霉RXLR效应蛋白毒性功能的初步分析

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致病疫霉RXLR效应蛋白毒性功能的初步分析

香烟暴露肺气肿小鼠中CD4+白细胞介素-17+辅助性T细胞对CD8+T细胞毒性功能的影响

多彩菌物美丽中国——中国菌物学会2019年学术年会

作者：郑英转栾宏瑛王洪洋云南师范大学生命科学学院云南师范大学马铃薯科学研究院

由致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病是马铃薯生产中最具毁灭性的病害。在入侵和寄主植物体内繁衍过程中,致病疫霉会向寄主细胞分泌一类RXLR效应蛋白以干扰植物免疫系统。为了挖掘和分析RXLR效应蛋白的毒性功... 详细信息

由致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病是马铃薯生产中最具毁灭性的病害。在入侵和寄主植物体内繁衍过程中,致病疫霉会向寄主细胞分泌一类RXLR效应蛋白以干扰植物免疫系统。为了挖掘和分析RXLR效应蛋白的毒性功能,挑选了致病疫霉侵染马铃薯时早期上调表达的68个RXLR类效应子基因,将它们分别克隆到PVX病毒植物表达载体p GR106上,采用农杆菌介导瞬时表达方法在本氏烟上进行效应子基因瞬时表达。表达1天后,对本氏烟接种致病疫霉菌株88069(1.***.4.7)。根据接种叶片病斑发病面积推断RXLR类效应蛋白是否具有明显毒性功能。结果表明:11个效应子基因(PITG7063,PITG3093,PITG6099,PITG1484,PITG1507,PITG0654,PITG2737,PITG4388,PITG5278,PITG2922,PITG4049),能够促进本氏烟感病,病斑面积明显增大。说明这11个RXLR效应蛋白具有毒性功能。

关键词：致病疫霉 RXLR效应蛋白毒性功能晚疫病

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香烟暴露肺气肿小鼠中CD4+白细胞介素-17+辅助性T细胞对CD8+T细胞...

致病疫霉菌RXLR效应基因Pi04196和Pi09732的初步功能研究

中华医学会呼吸病学年会——2011（第十二次全国呼吸病学学术会议）

作者：段敏超钟小宁黄颖何志义唐海娟广西医科大学第一附属医院呼吸内科

目的观察香烟烟雾暴露小鼠外周血、肺实质中CDIL-17辅助性T细胞(Th17)上IL-21的表达情况,研究IL-21对CD T细胞功能的影响,以探讨Th17细胞对香烟诱导肺气肿的调节机制。方法将40只雄性Ba1b/c小鼠按随机数字表法分为4组:对照12周组(C12)... 详细信息

目的观察香烟烟雾暴露小鼠外周血、肺实质中CDIL-17辅助性T细胞(Th17)上IL-21的表达情况,研究IL-21对CD T细胞功能的影响,以探讨Th17细胞对香烟诱导肺气肿的调节机制。方法将40只雄性Ba1b/c小鼠按随机数字表法分为4组:对照12周组(C12)、对照24周组(C24)、烟雾暴露12周组(S12)、烟雾暴露24周组(S24),每组10只。香烟烟雾暴露法建立小鼠肺气肿模

关键词：香烟暴露肺气肿 CD4+白细胞介素 -17+辅助性T细胞 CD8+T细胞毒性功能

来源： cnki会议评论

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致病疫霉菌RXLR效应基因Pi04196和Pi09732的初步功能研究

作者：刘至柔西北农林科技大学

学位级别：硕士

马铃薯是世界上第四大粮食作物,但由卵菌致病疫霉菌(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病(Potato late blight)严重影响其产量。致病疫霉菌属卵菌,在侵染植物的过程中分泌一系列效应蛋白,根据是否进入宿主细胞分为胞外和细胞质... 详细信息

马铃薯是世界上第四大粮食作物,但由卵菌致病疫霉菌(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病(Potato late blight)严重影响其产量。致病疫霉菌属卵菌,在侵染植物的过程中分泌一系列效应蛋白,根据是否进入宿主细胞分为胞外和细胞质效应分子。RXLR效应蛋白是研究较多的卵菌细胞质效应分子。致病疫霉菌RXLR效应蛋白数量庞大且功能多样,能够有效干扰植物正常的生理功能和防卫反应。本研究根据转录组分析数据选取致病疫霉菌侵染时期表达的候选RXLR效应基因Pi04196和Pi09732,研究其表达模式、编码蛋白的亚细胞定位以及毒性功能,主要结果如下:实时定量PCR结果显示致病疫霉菌RXLR效应基因Pi04196在致病疫霉菌营养菌丝中未检测到表达,而在侵染马铃薯早期(6 hpi)高度上调表达。通过PCR扩增和序列比对,发现在14个遗传背景差异较大的致病疫霉菌株中Pi04196高度保守,不存在序列多态性。共聚焦显微镜观察发现在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中Pi04196-GFP融合蛋白与质膜marker共定位于细胞膜,同时在核膜和胞质内有少量分布。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)原生质体中Pi04196-GFP也主要定位于质膜。毒性功能分析表明,根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的Pi04196-GFP瞬时表达显著促进致病疫霉菌侵染本氏烟草。对Pi04196-GFP转基因拟南芥的观察发现,纯合植株生长迟缓,抽薹开花慢,根长明显短于野生型拟南芥Col-0。接菌结果显示相比于野生型拟南芥,Pi04196-GFP转基因植物对寄生疫霉菌(Phytophthora parasitica)更感病。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达技术,在多个马铃薯栽培品种中的测试发现Pi04196能够在陇薯12上引发特异的过敏性坏死反应(Hypersensitive Response,HR),进一步分析表明Pi04196不能在马铃薯鉴别寄主Ma R1-Ma R11上激发HR,说明这些鉴别寄主中不含有识别Pi04196的抗病基因,表明Pi04196可能是一个潜在的新的无毒基因,陇薯12中可能存在能够识别Pi04196的新的抗晚疫病基因。RXLR效应基因Pi09732在致病疫霉菌丝中有低水平表达,在侵染阶段诱导上调表达上百倍,在6 hpi达到表达高峰。在烟草细胞以及拟南芥原生质体中,Pi09732主要定位于细胞膜,在核仁中也有分布。根癌农杆菌介导的Pi09732瞬时表达促进致病疫霉菌侵染本氏烟草。与野生型Col-0相比,GFP-Pi09732的稳定表达未对转基因拟南芥的生长表型造成明显影响,但显著促进寄生疫霉菌的定殖。此外,在本氏烟草中共表达INF1,Pi09732能够延缓INF1引发的HR,表明Pi09732通过抑制INF1诱发的PTI反应促进致病疫霉菌的侵染。

关键词：马铃薯晚疫病致病疫霉菌 RXLR效应基因毒性功能转基因拟南芥亚细胞定位

小麦条锈菌效应蛋白Hasp83的功能分析和靶标筛选

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小麦条锈菌效应蛋白Hasp83的功能分析和靶标筛选

作者：张艳茹西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦条锈病是小麦的一类重大病害,由病原真菌条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis ***,Pst）引起。培育和种植抗病品种是防治小麦条锈病最安全、经济、有效的方法。然而,条锈菌毒性小种变异快,容易造成抗病品种抗病性的“丧失”... 详细信息

小麦条锈病是小麦的一类重大病害,由病原真菌条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis ***,Pst）引起。培育和种植抗病品种是防治小麦条锈病最安全、经济、有效的方法。然而,条锈菌毒性小种变异快,容易造成抗病品种抗病性的“丧失”,病害不断流行危害。因而,加快研究条锈菌致病机理对于开发小麦持久抗病性具有重要意义。小麦条锈菌是活体营养型专性寄生真菌,在侵染过程中形成吸器,通过吸器在植物中汲取营养以维持生长发育。吸器分泌的效应蛋白可以调控寄主免疫反应,从而促进条锈菌侵染。前期在吸器转录组测序基础上获得一个效应蛋白Hasp83,它可以在烟草上抑制由BAX引起的PCD过程。本研究拟深入分析效应蛋白Hasp83的毒性功能,筛选鉴定其互作靶标,以期揭示效应蛋白Hasp83在条锈菌致病过程中的调控机理,从而为创制新型抗病材料提供依据。主要研究结果如下:（1）种间多态性分析显示效应蛋白Hasp83是条锈菌特有的效应蛋白,小种内多态性比对结果表明Hasp83在七个生理小种内有5个核苷酸发生突变,表明其在进化过程中较保守。（2）借助细菌III型分泌系统将小麦条锈菌效应蛋白在小麦中瞬时表达,在小麦品种MX169中,Hasp83能够抑制荧光假单胞菌引起的胼胝质积累,说明Hasp83可以抑制小麦的PTI防卫反应;在CYR23和小麦水源11非亲和互作体系中,Hasp83可以抑制活性氧迸发和HR反应,说明Hasp83可以抑制小麦的ETI防卫反应;qRT-PCR分析显示,效应蛋白Hasp83在条锈菌侵染时期上调表达。在CYR31和小麦水源11亲和互作体系中,利用HIGS技术将条锈菌中的Hasp83沉默后,条锈菌的产孢量明显减少,菌丝长度,菌丝面积和吸器数目也减少,说明Hasp83有助于条锈菌致病性。（3）利用酵母双杂交系统筛选并验证发现,效应蛋白Hasp83与候选靶标小麦过敏性坏死诱导蛋白Tahir1、Tahir2和Tahir3互作,而与同源性程度较低的Tahir4不互作。亚细胞定位显示效应蛋白Hasp83及其去信号肽后的Hasp83nosp在烟草细胞细胞膜、细胞质和细胞核均有分布,Tahir1、Tahir2和Tahir3定位在细胞膜,二者均在细胞膜有分布。双分子荧光互补BIFC实验进一步证明了Hasp83及其候选靶标存在互作。

关键词：小麦条锈菌效应蛋白毒性功能靶标鉴定

效应蛋白OhEF 2正调控拟南芥对橡胶树白粉菌感病性

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效应蛋白OhEF 2正调控拟南芥对橡胶树白粉菌感病性

作者：程度海南大学

学位级别：硕士

白粉菌是子囊菌门白粉菌目的一种专性活体寄生真菌,通过在植物细胞内形成吸器,产生大量的效应蛋白,从而实现在寄主细胞内的侵染,在世界范围内造成重大的经济损失。根据前期文献报道,对橡胶树白粉菌Oidium heveae进行基因组和转录组测序... 详细信息

白粉菌是子囊菌门白粉菌目的一种专性活体寄生真菌,通过在植物细胞内形成吸器,产生大量的效应蛋白,从而实现在寄主细胞内的侵染,在世界范围内造成重大的经济损失。根据前期文献报道,对橡胶树白粉菌Oidium heveae进行基因组和转录组测序分析,预测出133个潜在的效应蛋白。然而,这些效应蛋白的功能是什么,目前还了解的非常少。本研究克隆了其中的一个效应蛋白基因OhEF 2(Gene＿id:OH＿02339),该基因编码543个氨基酸,信号肽分析发现1-21个氨基酸为其信号肽序列。为了研究该效应蛋白在植物体内的作用机理,去除信号肽序列,设计引物,经过PCR扩增、酶切后连入雌激素诱导的转基因载体p ER8。利用潮霉素筛选,通过雌激素诱导和蛋白质印迹分析后,获得了在拟南芥Col-0背景下3个独立的OhEF 2转基因植株,分别命名为OhEF 2-1,OhEF 2-2和OhEF 2-3。通过接种发现,过量表达OhEF 2可以明显促进拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性,但不能提高假单胞菌DC 3000的毒性功能,表明OhEF 2可能只在白粉菌侵染的过程中发挥作用。通过分生孢子计数分析,橡胶树白粉菌不能在拟南芥野生型Col-0和空载体转基因植株上产生分生孢子,而在3个OhEF 2转基因植株上形成了大量的分生孢子,表明效应蛋白OhEF 2可以明显增强拟南芥对橡胶树白粉菌感病的表型。进一步研究发现,OhEF 2显著降低了橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的胼胝体沉积和PR1(Pathogen-Related Gene1)基因表达,表明效应蛋白OhEF 2有效地抑制了橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的抗病反应。这为进一步研究效应蛋白OhEF 2在植物体内的毒性作用机理奠定了基础。

关键词：橡胶树白粉菌拟南芥效应蛋白 OhEF2 毒性功能

大豆天冬氨酸蛋白酶GmAP1和大豆疫霉RxLR效应分子PsAvh109的功能分析

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大豆天冬氨酸蛋白酶GmAP1和大豆疫霉RxLR效应分子PsAvh109的功能...

作者：蒋文敬南京农业大学

学位级别：硕士

大豆是我国主要作物之一,而根腐病是大豆种植和生产中的一种毁灭性病害,会造成严重的经济损失,严重危害大豆生产安全。大豆疫霉Phytophthora sojae是引致大豆根腐病的主要病原菌,目前生产中筛选利用抗病品种是一种主要的病害防控方式。... 详细信息

大豆是我国主要作物之一,而根腐病是大豆种植和生产中的一种毁灭性病害,会造成严重的经济损失,严重危害大豆生产安全。大豆疫霉Phytophthora sojae是引致大豆根腐病的主要病原菌,目前生产中筛选利用抗病品种是一种主要的病害防控方式。因此,研究大豆在被侵染过程中的免疫反应,寻找稳定、广谱的抗性资源对病害防控具有重要意义。另一方面,效应分子是大豆疫霉的关键致病因子,相关基因快速变异,单一抗病品种很容易被疫霉菌克服,因此对于大豆疫霉效应分子致病机制的研究也至关重要。本研究通过分析大豆疫霉效应分子PsAvh240过表达后植物的质谱分析,发现了一个对植物抗病有重要作用的免疫相关蛋白,即大豆天冬氨酸蛋白酶GmAP1。此外,在预测了大豆疫霉所有效应分子的等电点后,发现一个较为特殊的低等电点效应分子PsAvh109。本研究就大豆天冬氨酸蛋白酶的功能和大豆疫霉效应分子PsAvh109在侵染过程中的毒性作用进行分析。大豆天冬氨酸蛋白酶GmAP1参与对疫霉菌抗病的功能分析:本研究在实验室前期研究的基础上发现过表达大豆疫霉效应分子PsAvh240提高了辣椒疫霉侵染本氏烟的能力,对过表达了 PsAvh240的烟草叶片进行质谱分析,发现了在大豆抗逆境胁迫过程中具有重要作用的蛋白大豆天冬氨酸蛋白酶GmAP1。本氏烟过表达GmAP1蛋白可以提高烟草叶片抵抗辣椒疫霉侵染的能力,利用原核蛋白表达系统表达GmAP1后检测酶活,发现其具有蛋白酶活性,而突变了 GmAP1的酶活位点后则丧失了这种作用。利用真核蛋白表达系统表达GmAP1后进行检测,前期能够检测到蛋白后期发现蛋白降解,结果表明GmAP1作为大豆外泌蛋白,在细胞内合成后进行加工形成蛋白酶前体,而后分泌到胞间两端降解留下关键酶活性位点发挥蛋白水解酶功能,促进细胞免疫反应。大豆疫霉RxLR效应分子PsAvh109的毒性功能分析:在对大豆疫霉所有效应分子的等电点进行统计后,发现一个较为特殊的低等电点效应分子PsAvh109。序列多态性分析显示Avh109在其他四个疫霉基因组中均含有同源基因,表明PsAvh109可能是疫霉基因组中一个高度保守的毒性因子。利用CRISPR/Cas9技术敲除了大豆疫霉中的PsAvh109基因后,发现大豆疫霉的致病力显著下降,表明Avh109是大豆疫霉发挥毒性所必需的效应分子。在烟草细胞中过表达PsAvh109能够促进辣椒疫霉侵染,在大豆毛状根中过表达PsAvh109基因也能够促进大豆疫霉侵染,进一步说明了 PsAvh109在大豆疫霉发挥毒性过程中具有重要作用。在进行大豆毛状根转化后,将受侵染根毛进行转录测序,通过RNA-seq技术分析差异表达基因。结果显示,过表达PsAvh109的根毛与对照组相比有819个基因发生差异表达,其中341个基因上调表达,478个基因下调表达,说明PsAvh109能够操纵寄主植物基因的表达。对差异基因进行KEGG富集分析,发现参与到植物抵抗病原菌侵染的防卫基因被大量富集。深入分析植物与病原微生物互作的所有差异表达基因,发现PsAvh109能够操控植物细胞防卫相关基因下调表达,降低植物免疫,从而发挥其毒性功能,达到成功侵染的目的。分析这些差异基因有助于深入研究病原微生物操控植物防卫基因表达的机制,为后续寻找PsAvh109的候选互作蛋白提供依据。

关键词： GmAP1 PsAvh109 防卫反应毒性功能

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）RxLR效应分子筛选及RxLR23的功能研究

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辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）RxLR效应分子筛选及RxLR23的...

作者：姜海滨山东农业大学

学位级别：硕士

在辣椒疫霉侵染寄主的过程中,病原菌能够分泌大量的Rx LR效应分子协同互作来干扰和破坏寄主植物的抗病反应。因此,研究RxLR效应分子基因的功能和蛋白结构,对了解辣椒疫霉的致病机制,有效控制辣椒疫霉的侵染具有重要意义。本项研究以高... 详细信息

在辣椒疫霉侵染寄主的过程中,病原菌能够分泌大量的Rx LR效应分子协同互作来干扰和破坏寄主植物的抗病反应。因此,研究RxLR效应分子基因的功能和蛋白结构,对了解辣椒疫霉的致病机制,有效控制辣椒疫霉的侵染具有重要意义。本项研究以高致病性辣椒疫霉菌株SD33为实验材料,结合相关的研究基础,对辣椒疫霉菌株SD33中RxLR效应分子进行研究,实验结果如下:1、根据JGI辣椒疫霉菌基因组数据库中筛选得到Rx LR效应分子基因核苷酸及氨基酸序列,通过NCBI进行序列比对,确定所要筛选的基因序列。从辣椒疫霉菌株SD33中克隆这些Rx LR效应分子并进行生物信息学分析。2、利用pBIN-GFP2表达载体对辣椒疫霉Rx LR效应分子进行功能研究,在本氏烟中瞬时表达4个候选效应分子,发现其中Rx LR23基因可以诱导本氏烟发生细胞死亡,Rx LR129759可以抑制Bax诱导的细胞死亡。3、为了进一步研究RxLR效应分子的功能,分别将4个RxLR效应分子在本氏烟叶片中瞬时表达并用共聚焦显微镜观察各效应分子的亚细胞定位,发现Rx LR23、Rx LR97196、Rx LR129759均定位在细胞核和细胞质中,Rx LR101012定位在细胞核中。4、根据本实验室之前所得到的效应分子Rx LR23的蛋白质三维结构,对其C末端3个保守W结构域进行不同程度的截短,利用pBIN-GFP2表达载体在本氏烟叶片中瞬时表达各Rx LR23截短体,发现3个W结构域对触发ETI的作用无明显区别。5、效应分子RxLR23在辣椒疫霉菌SD33内的基因敲除。为了进一步研究效应分子Rx LR23在辣椒疫霉SD33中的功能,利用CRISPR/Cas9技术对辣椒疫霉SD33内的Rx LR23进行敲除实验,获得效应分子RxLR23的敲除转化子。对效应分子Rx LR23的敲除转化子进行生物学性状分析和致病性测定。结果表明,敲除Rx LR23使得辣椒疫霉致病能力减弱但其对辣椒疫霉的生长及细胞核在菌丝中的分布没有产生明显的影响。通过本研究,我们发现RxLR效应分子功能具有多样性特点,其中包括诱导细胞死亡及抑制Bax诱导的细胞死亡的功能。不同的效应分子定位在寄主细胞内的不同位置发挥作用。Rx LR23 C末端的3个保守W结构域对于触发ETI没有明显的区别。通过对Rx LR23敲除转化子的致病性测定,转化子致病力下降,这表明在侵染过程中,RxLR23具有毒性功能。这为进一步认识效应分子在病菌侵染过程中的作用提供了理论基础。

关键词：辣椒疫霉 RxLR效应分子毒性功能基因敲除致病性测定