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中国组织工程研究与临床康复 2009年第24期13卷 4791-4795页

作者：刘慧姝郝荣增宋小飞熊正方广州医学院第三附属医院产科广州妇产科研究所广东省广州市510150

背景:胎盘和胎膜在母胎液体平衡过程中起着重要作用,而水穿过胎盘和胎膜运输的分子和细胞机制目前尚不十分清楚,推测母胎液体交换可能通过胎盘和胎膜上的水通道进行。目的:观察人正常妊娠晚期胎盘与胎膜组织中水通道蛋白8蛋白质水平的... 详细信息

背景:胎盘和胎膜在母胎液体平衡过程中起着重要作用,而水穿过胎盘和胎膜运输的分子和细胞机制目前尚不十分清楚,推测母胎液体交换可能通过胎盘和胎膜上的水通道进行。目的:观察人正常妊娠晚期胎盘与胎膜组织中水通道蛋白8蛋白质水平的表达及其分布。设计、时间及地点:对比观察,于2005-07/12在广州医学院实验中心完成。材料:收集正常足月妊娠剖宫分娩的胎盘与胎膜组织样本各5例,产妇年龄(27±5)岁,实验方法获医院伦理委员会批准。方法:胎盘胎膜组织在分娩30min内取样,用无菌生理盐水漂洗干净去除血液,立即放入液氮中,转运至-80℃冰箱保存备用。主要观察指标:运用反转录-聚合酶链反应法、免疫组织化学法及Western印迹法检测水通道蛋白8在胎盘与胎膜组织中的表达与分布。结果:反转录-聚合酶链反应显示,水通道蛋白8mRNA在胎盘和胎膜组织中均有表达。水通道蛋白8 Western印迹检测胎盘和胎膜组织显示,一特异性条带在Mr45000左右。免疫组织化学结果显示,水通道蛋白8表达于胎盘合体滋养细胞、羊膜上皮细胞及平滑绒毛膜细胞滋养细胞。结论:在蛋白质水平显示,水通道蛋白8表达于胎盘的合体滋养细胞、羊膜上皮细胞及平滑绒毛膜细胞滋养细胞。

关键词：水通道蛋白8 基因表达胎盘胎膜母胎液体平衡

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siRNA特异性抑制水通道蛋白-1基因在人羊膜WISH细胞的表达

siRNA特异性抑制水通道蛋白-1基因在人羊膜WISH细胞的表达

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作者：郝荣增西北农林科技大学

学位级别：硕士

母胎液体交换及羊水循环平衡对于正常妊娠胎儿的生长、活动和发育至关重要。胎盘和胎膜是维持母胎液体平衡的重要器官。羊水量异常是临床上常见的母胎液体交换障碍疾病之一,临床上表现为羊水过多或羊水过少,其围产儿病率和死亡率显著升... 详细信息

母胎液体交换及羊水循环平衡对于正常妊娠胎儿的生长、活动和发育至关重要。胎盘和胎膜是维持母胎液体平衡的重要器官。羊水量异常是临床上常见的母胎液体交换障碍疾病之一,临床上表现为羊水过多或羊水过少,其围产儿病率和死亡率显著升高。但羊水平衡的分子机制仍不清楚。目前研究认为羊水膜内转运吸收是维持羊水稳态平衡的重要方式,但其分子机制尚不清楚。水通道蛋白(Aquanproin, AQP)是一族介导水跨膜转运的膜孔蛋白,在机体内器官的液体平衡中发挥着关键作用,但其在羊水平衡中的作用机理还不清楚。RNA干扰技术是近年来用于哺乳动物细胞培养研究的新方法,用以使目的基因表达沉默,进而分析其功能。人羊膜WISH细胞株源于正常足月妊娠的人羊膜上皮细胞。为了研究AQP在母胎液体平衡的作用,建立研究羊膜AQPs在羊水量平衡中作用及其调节机制的细胞模型,本研究应用RNA干扰技术研究特异性siRNA(small interference RNA)对细胞AQP1 mRNA表达的抑制作用。结果如下: 1.本研究运用RT-PCR和细胞免疫荧光化学技术,检测人羊膜WISH细胞中AQP1, 3, 8, 9的表达,结果表明AQP1, 3, 8, 9在人羊膜上皮WISH细胞均有表达,AQP1, 3, 8, 9 mRNA的表达水平分别约为0.489±0.103, 0.594±0.093, 0.474±0.136, 0.425±0.150( x±S)。细胞免疫荧光技术在蛋白水平显示AQP1, 3, 8, 9在人羊膜WISH细胞表达。结论认为,WISH细胞可以作为研究羊膜水通道蛋白对水转运及调控机制的细胞模型。 2.本研究运用0 nmol/L, 5 nmol/L, 10 nmol/L, 20 nmol/L和30 nmol/L CY3-Negative siRNA转染人羊膜上皮WISH细胞,以确定其转染效率。转染后24 h,荧光显微镜观察细胞内可见红色荧光,而对照组未见到荧光信号,说明化学合成siRNA可以被有效转入细胞,荧光为特异性荧光信号。流式细胞仪检测转染效率分别为:0, 7.7%, 39.35%, 87.27%和95.78%;20 nmol/L和30 nmol/L转染组的转染效率显著高于5 nmol/L和10 nmol/L组(P0.05)。运用20 nmol/L的Negative siRNA转染细胞24 h后,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测转染对细胞凋亡的影响,结果转染组和对照组细胞早期凋亡率分别为1.96%和2.36%,两组之间细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)。结论认为,20 nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果;转染效率随siRNA浓度增加而升高;化学合成siRNA转染对细胞凋亡无明显影响。 3.本研究应用化学合成的3条不同序列AQP1-siRNA,终浓度均为20 nmol/L,分别转染细胞24 h,筛选抑制效率最高的siRNA,结果表明AQP1-siRNA-1抑制作用最强;然后分别应用20 nmol/L, 40 nmol/L, 60 nmol/L和80 nmol/L的AQP1-siRNA-1转染细胞,研究不同浓度的siRNA对细胞AQP1 mRNA表达的抑制作用;转染24 h后荧光定量PCR检测,结果各组AQP1 mRNA的表达水平分别降低20.42%, 39.86%, 60.34%和65.81%;阴性对照组AQP1 mRNA表达为空白组的95.7%,与空白对照组无显著性差异(P>0.05)。 4.本研究运用60 nmol/L AQP1-siRNA-1转染细胞,转染分别培养24 h, 48 h和72 h,研究siRNA的有效作用时间。荧光定量PCR检测结果发现,各组AQP1 mRNA分别较空白组下调60.24%, 90.57%, 87.68%。以48 h转染组AQP1 mRNA表达降低最为显著(P0.05)。结论认为,siRNA对AQP1 mRNA表达的抑制作用在24 h2 h呈时间依赖性升高,最大抑制作用在48 h,有效抑制时间达72 h。总之,本研究检测了AQP1, 3, 8, 9在人羊膜WISH细胞的表达,优化了siRNA转染WISH细胞的条件,筛选出有效抑制AQP1 mRNA表达的siRNA序列;最后应用AQP1-siRNA成功抑制了WISH细胞AQP1 mRNA表达,建立了AQP1基因沉默的羊膜上皮细胞模型。

关键词：水通道蛋白小干扰RNA WISH细胞转染母胎液体平衡

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AQP1在CD-1纯系野生型孕鼠胎盘组织的表达

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现代生物医学进展 2011年第14期11卷 2647-2649页

作者：吴颖怡许文静谢静颖廖宝平吴学诗广州市妇女儿童医疗中心广东广州510180 广州医学院附属第三医院广东广州510000

目的:研究水通道蛋白1(Aquaporin 1,AQP1)在小鼠胎盘组织的分布及表达,初步探讨AQP1在羊水循环及母胎液体平衡中的作用。方法:各取四只雌雄成年健康野生型CD1小鼠(wild type,AQP1+/+)及AQP1基因敲除小鼠(AQP1-KO,AQP1-/)-,将纯合子AQP1... 详细信息

目的:研究水通道蛋白1(Aquaporin 1,AQP1)在小鼠胎盘组织的分布及表达,初步探讨AQP1在羊水循环及母胎液体平衡中的作用。方法:各取四只雌雄成年健康野生型CD1小鼠(wild type,AQP1+/+)及AQP1基因敲除小鼠(AQP1-KO,AQP1-/)-,将纯合子AQP1基因敲除雌雄小鼠等数量合笼交配,第二日检出阴道栓者记为妊娠第1天(1 gestational day,1GD);野生型小鼠同样合笼记录。分别取两组13GD孕鼠的胎盘组织各一个,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术及免疫组织化学技术检测AQP1胎盘组织中的表达,并确定AQP1在小鼠胎盘组织的定位。结果:***-PCR结果表明AQP1在CD-1野生型孕鼠胎盘组织表达,AQP1基因敲除鼠无表达;2.免疫组织化学方法发现AQP1表达于小鼠胎盘血管内皮细胞和滋养细胞,AQP1基因敲除鼠无表达。结论:在mRNA水平和蛋白水平均发现AQP1在CD-1纯系野生型孕鼠胎盘组织的表达,提示AQP1可能在羊水循环及母胎液体平衡中发挥作用。

关键词：水通道蛋白1 胎盘母胎液体平衡

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