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核心结合因子和Ⅱ型胶原在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化中的表达

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中华高血压杂志 2012年第9期20卷 847-851页

作者：余毅曹翠云南京军区福州总医院血液净化科福建福州350025

目的观察核心结合因子(Cbfα1)和Ⅱ型胶原在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化中的表达,探讨慢性肾脏病5期血管钙化发生的可能机制。方法 40只SD雄性大鼠随即分为4组:残肾+高磷组(n=10),残肾+正常磷组(n=10),假手术+正常磷组(n=10),假手术+高... 详细信息

目的观察核心结合因子(Cbfα1)和Ⅱ型胶原在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化中的表达,探讨慢性肾脏病5期血管钙化发生的可能机制。方法 40只SD雄性大鼠随即分为4组:残肾+高磷组(n=10),残肾+正常磷组(n=10),假手术+正常磷组(n=10),假手术+高磷组(n=10)。分别行5/6肾切除或假手术,术后开始给予高磷饮食或正常磷饮食16周。收集尿量检测24h尿蛋白,取血检测血清磷、肌酐、尿素氮,取胸主动组织,von kossa染色检测血管钙化,RT-PCR检测Cbfα1和Ⅱ型胶原mRNA表达,免疫组化或Western-Blot检测Cbfα1和Ⅱ型胶原蛋白表达。结果与其他3组比较,残肾+高磷组大鼠尿蛋白、血磷、尿素氮和肌酐明显增高(P残肾+高磷组大鼠主动脉呈现明显钙化,而残肾+正常磷组仅个别出现钙化,假手术+高磷组和假手术+正常磷组未见钙化。免疫组化显示,与其他3组比较,残肾+高磷组大鼠主动脉Cbfα1、Ⅱ型胶原的表达明显增多(P残肾+高磷组主动脉Cbfα1mRNA和蛋白的表达明显上调(P残肾+高磷组、残肾+正常磷组与另外2组相比,动脉Ⅱ型胶原mRNA表达明显上调(P残肾大鼠血管钙化的重要影响因素,血磷水平与Cbfα1和Ⅱ型胶原的表达呈正相关。Cbfα1、Ⅱ型胶原的表达增多可能是高磷诱导的残肾大鼠血管钙化的重要机制之一。

关键词：高血磷残肾大鼠核心结合因子 Ⅱ型胶原血管钙化

氯沙坦对残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞保护作用的研究

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氯沙坦对残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞保护作用的研究

作者：王琰福建医科大学

学位级别：硕士

【目的】本课题旨在探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)对残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞的保护作用及对相关促进/抑制血管生成因子表达的影响,为ARB类药物临床治疗慢性肾脏病(CKD)提供新的实验和理论依据。【方法】通过结扎左肾肾动脉... 详细信息

【目的】本课题旨在探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)对残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞的保护作用及对相关促进/抑制血管生成因子表达的影响,为ARB类药物临床治疗慢性肾脏病(CKD)提供新的实验和理论依据。【方法】通过结扎左肾肾动脉上支、中支和切除右肾建立残肾大鼠模型。32只8周龄雄性SD大鼠(体重为200-250g)随机分成三组:(1)氯沙坦组(n=12),给予氯沙坦25mg/kg/day灌胃;(2)残肾模型组(n=12),给予等量溶媒灌胃;(3)假手术组(n=8),给予等量溶媒灌胃。于实验15周末,收集尿量检测24h尿蛋白,取血检测白蛋白、尿素氮、肌酐和胆固醇、甘油三酯。取肾组织,用于组织病理(PASM染色)和免疫组化(CD31和大鼠内皮细胞抗原-1即RECA-1染色代表肾小球毛细血管内皮细胞密度),比较三组大鼠肾小球纤维化程度和毛细血管内皮细胞密度;另取肾组织,用于检测促进/抑制血管生成因子(VEGF/TSP-1)基因和蛋白表达水平。【结果】1.与假手术组比较,残肾模型组血尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯水平和24小时尿蛋白定量明显升高(P残肾模型组相比,氯沙坦组血尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯水平和24小时尿蛋白定量明显下降(P0.05)。2。肾组织病理显示,残肾模型组肾小球硬化指数(GSI)明显高于假手术组(0.89±0.12 vs 0.29±0.05)(P残肾大鼠肾小球硬化指数(0.34±0.02 vs 0.89±0.12)(P肾组织免疫组化显示,CD31标示的残肾模型组肾小球毛细血管内皮细胞密度明显低于假手术组(1.99±0.31 vs 7.21±0.57)(P残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞密度(5.93±0.70 vs 1.99±0.31)(P肾组织中VEGF,TSP-1基因和蛋白表达水平。氯沙坦显著增加了残肾大鼠VEGF(P残肾大鼠TSP-1(P残肾大鼠血胆固醇、甘油三酯和24小时尿蛋白水平,改善了肾功能。2.氯沙坦增加了残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞密度,减轻了肾小球纤维化。3.氯沙坦促进了残肾大鼠血管生成促进因子VEGF的表达,抑制了血管生成抑制因子TSP-1的表达4.氯沙坦对肾小球毛细血管内皮细胞损伤的修复作用,可能与其影响了血管生成的相关细胞因子的表达有关。

关键词：血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂内皮细胞残肾大鼠血小板反应蛋白血管内皮细胞生长因子

Runx2、Co1Ⅱ在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化中的表达

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Runx2、Co1Ⅱ在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化中的表达

作者：曹翠云福建医科大学

学位级别：硕士

【目的】本课题旨在观察Runx2(runt-related transcription factor2)和ColⅡ(CollagenⅡ)在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化中的表达,从而探讨慢性肾衰竭血管钙化发生的可能机制。【方法】 40只SD雄性大鼠分别行5/6肾切除(n=20)或假手术(n... 详细信息

【目的】本课题旨在观察Runx2(runt-related transcription factor2)和ColⅡ(CollagenⅡ)在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化中的表达,从而探讨慢性肾衰竭血管钙化发生的可能机制。【方法】 40只SD雄性大鼠分别行5/6肾切除(n=20)或假手术(n=20),术后开始给予高磷饮食或正常磷饮食16周。动物分为4组:残肾大鼠+高磷饮食(残肾+高磷组,n=10),残肾大鼠+正常磷饮食(残肾+正常磷组,n=10),假手术大鼠+正常磷饮食(假手术+正常磷组,n=10),假手术大鼠+高磷饮食(假手术+高磷组,n=10)。高磷饮食配方为:磷(1.2%),钙(1.6%),正常磷饮食配方为:磷(0.9%),钙(1.2%)。大鼠处死前,收集尿量检测24h尿蛋白,取血检测血肌酐、尿素氮、胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)、磷。处死后,取胸主动组织,采用von kossa染色检测血管钙化程度,通过RT-PCR技术检测Runx2和ColⅡ的mRNA表达,采用免疫组织化学方法检测Runx2和ColⅡ的蛋白表达,Western-Blot方法检测Runx2的蛋白表达。【结果】 1.特定饮食16周后,与假手术大鼠相比,残肾大鼠血肌酐、尿素氮、血磷、和24小时尿蛋白定量明显升高(p残肾+高磷组大鼠血磷水平显著增高(p残肾+高磷组大鼠主动脉出现严重钙化,而残肾+正常磷组和假手术+高磷组仅有个别大鼠主动脉出现钙化,假手术+正常磷组大鼠主动脉未见钙化。 3.免疫组化结果显示,与另外三组相比,残肾+高磷组大鼠主动脉Runx2、ColⅡ的表达明显增多(p残肾+正常磷组、假手术+高磷组、假手术+正常磷组相比,残肾+高磷组Runx2 mRNA表达明显上调(P残肾+高磷组,残肾+正常磷组ColⅡmRNA表达明显上调(P残肾大鼠+高磷组主动脉Runx2表达明显增加(P残肾大鼠血管钙化模型,类似慢性肾衰竭血管钙化的发病机理,是很好的研究人类慢性肾衰竭血管钙化的动物模型。 2.高血磷是残肾大鼠血管钙化的重要影响因素,血磷水平与骨调节蛋白Runx2和ColⅡ的表达呈正相关。 3. Runx2、ColⅡ的表达增多可能是导致残肾大鼠血管钙化的重要机制之一。

关键词：高血磷残肾大鼠慢性肾衰竭血管钙化 Runx2 ColⅡ

氯沙坦对残肾大鼠内皮祖细胞和肾小球内皮损伤的影响

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氯沙坦对残肾大鼠内皮祖细胞和肾小球内皮损伤的影响

作者：周丽娜福建医科大学

学位级别：硕士

【目的】本课题旨在探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)对残肾大鼠外周血内皮祖细胞的影响及对肾小球微脉管系统损伤的逆转作用,为ARB类药物临床治疗慢性肾脏病提供新的实验和理论依据。【方法】通过结扎左肾肾动脉的上支、中支和切除右... 详细信息

【目的】本课题旨在探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)对残肾大鼠外周血内皮祖细胞的影响及对肾小球微脉管系统损伤的逆转作用,为ARB类药物临床治疗慢性肾脏病提供新的实验和理论依据。【方法】通过结扎左肾肾动脉的上支、中支和切除右肾建立残肾大鼠模型。32只8周龄雄性SD大鼠(体重为200-250g)随机分成三组:(1)氯沙坦组(n=12),给予氯沙坦25mg/kg/day灌胃;(2)残肾模型组(n=12),给予等量溶媒灌胃;(3)假手术组(n =8),给予等量溶媒灌胃。于实验15周末,收集尿液检测24h尿蛋白,取血检测白蛋白、尿素氮、肌酐和胆固醇、甘油三酯,分离大鼠外周血单个核细胞(MNC),用流式细胞仪检测MNC中CD34+细胞(假定为EPC)百分数,并将MNC接种于培养板,孵育24小时,收集非贴壁细胞,继续培养,观察EPC集落形成,显微镜下计数EPC集落。EPC集落进行免疫荧光检测,观察内皮细胞标志物CD31的表达。取肾组织,用于组织病理(PASM染色)和免疫组化(RECA-1即大鼠内皮细胞抗原-1染色),比较三组大鼠肾小球纤维化程度和毛细血管内皮细胞密度。【结果】1.与假手术组比较,残肾模型组血尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯水平和24小时尿蛋白定量明显升高(P残肾模型组相比,氯沙坦组血尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯水平和24小时尿蛋白定量明显下降(P0.05)。2.从大鼠外周血分离MNC,用流式细胞仪检测MNC中CD34+细胞,残肾模型组CD34+细胞百分数(%MNC)显著低于假手术组(0.35%±0.08% vs 1.29%±0.21%)(P残肾大鼠CD34+细胞百分数(1.03%±0.28% vs 0.35%±0.08%)(P残肾模型组EPC集落形成能力显著低于假手术组(2.50±0.65 vs 18.60±5.68)(P残肾大鼠EPC集落形成能力(14.60±3.65 vs 2.50±0.65)(P肾组织病理显示,残肾模型组肾小球硬化指数(GSI)明显高于假手术组(0.89±0.12 vs 0.29±0.05)(P残肾大鼠肾小球硬化指数(0.34±0.02 vs 0.89±0.12)(P肾组织免疫组化显示,残肾模型组毛细血管内皮细胞密度明显低于假手术组(1.99±0.31 vs 7.21±0.57)(P残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞密度(5.93±0.70 vs 1.99±0.31)(P残肾大鼠血胆固醇、甘油三酯和24小时尿蛋白水平,改善了肾功能。2.氯沙坦增加了残肾大鼠EPC数目,增强了EPC集落形成能力。3.氯沙坦增加了残肾大鼠肾小球毛细血管内皮细胞密度,减轻了肾小球纤维化。4.氯沙坦对肾小球毛细血管内皮细胞损伤的修复作用,可能与其促进外周血EPC的动员有关。

关键词：血管紧张素II受体拮抗剂内皮祖细胞内皮细胞残肾大鼠血管紧张素II 肾小球硬化

硫代硫酸钠对高磷诱导的残肾大鼠血管钙化早期干预作用的观察

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中国血液净化 2012年第5期11卷 263-267页

作者：余毅黄恬福建医科大学福州总医院临床医学院(南京军区福州总医院)血液净化科福州350025

目的探讨硫代硫酸钠对高磷诱导的残肾大鼠血管钙化的早期干预作用。方法 5/6肾切除大鼠,术后给予高磷或正常磷饮食16周,以高磷饮食制作血管钙化模型。分为5组:假手术+正常磷组(SNP,n=7),假手术+高磷组(SHP,n=7),残肾+正常磷组(NNP,n=7)... 详细信息

目的探讨硫代硫酸钠对高磷诱导的残肾大鼠血管钙化的早期干预作用。方法 5/6肾切除大鼠,术后给予高磷或正常磷饮食16周,以高磷饮食制作血管钙化模型。分为5组:假手术+正常磷组(SNP,n=7),假手术+高磷组(SHP,n=7),残肾+正常磷组(NNP,n=7),残肾+高磷组(NHP,n=7),残肾+高磷+硫代硫酸钠治疗组(THP,n=7),治疗组以硫代硫酸钠腹腔注射16周。收集尿量检测24h尿蛋白,取血检测血清钙、磷、肌酐、尿素氮。取胸主动脉,HE和vonkossa染色检测血管钙化,免疫组化分析大鼠胸主动脉III型钠磷转运体亚型(Pit-1)、核心结合因子(Cbfα1)的表达。结果各组大鼠尿蛋白、尿素氮、肌酐、尿酸和血磷浓度均有明显差别(F值分别为19.057、43.527、26.688、40.324和7.676,P值均大鼠呈现明显钙化,SNP和SHP组未见明显变化,MP和THP组见散在的钙化点。免疫组化显示,主动脉Pit-1和Cbfα1表达各组有明显差异(F值为8.259和5.91,P残肾大鼠,可成功制作血管钙化模型,硫代硫酸钠早期干预,可明显改善其肾功能,降低血磷,下调动脉Pit-1和Cbfα1表达,减轻血管钙化。

关键词：血管钙化磷残肾大鼠硫代硫酸钠

DMP-1、E11、Sclerostin在高磷诱导的血管钙化中的表达及硫代硫酸钠的干预作用

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DMP-1、E11、Sclerostin在高磷诱导的血管钙化中的表达及硫代硫酸...

作者：霍苗苗福建医科大学

学位级别：硕士

【目的】本课题旨在观察DMP-1、E11、Sclerostin在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化模型及高磷诱导的钙化血管平滑肌细胞中的表达，试图阐明CKD血管钙化的可能机制。通过硫代硫酸钠对高磷诱导的残肾大鼠的早期干预，探讨硫代硫酸钠对CKD... 详细信息

【目的】本课题旨在观察DMP-1、E11、Sclerostin在高磷诱导的残肾大鼠血管钙化模型及高磷诱导的钙化血管平滑肌细胞中的表达，试图阐明CKD血管钙化的可能机制。通过硫代硫酸钠对高磷诱导的残肾大鼠的早期干预，探讨硫代硫酸钠对CKD血管钙化的防治作用及其可能机制。【方法】 1.35只SD雄性大鼠分别行5/6肾切除（n=21）或假手术（n=14）,术后开始给予高磷或正常磷饮食16周。动物分为5组：（1）假手术+正常磷饮食（SNP）;（2）假手术+高磷饮食（SHP）;（3）残肾+正常磷饮食（NNP）;（4）残肾+高磷饮食，即血管钙化模型组（NHP）;（5）残肾+高磷饮食+硫代硫酸钠治疗组（THP）。正常磷饮食配方为：磷（0.9%），钙（1.2%），高磷饮食配方为：磷（1.2%），钙（1.6%），硫代硫酸钠予以腹腔注射，每周三次，对照组予以同等体积无菌注射用水腹腔注射。16周后，大鼠处死前测量尾动脉血压，收集尿量检测24h尿蛋白，取血检测血肌酐、尿素氮、血钙、血磷，ELISA法检测血清iPTH。处死后，取胸主动脉，采用HE、Vonkossa和茜素红染色检测血管钙化程度，采用免疫组织化学方法和Western blot检测血管E11蛋白表达。RT-PCR方法检测DMP-1、E11、Sclerostin mRNA表达，Real-time PCR方法检测血管DMP-1mRNA表达。2.组织块贴壁法原代培养VSMC,倒置相差显微镜观察细胞形态及α-SMA免疫组化鉴定;3～8代VSMC用于实验，分为空白对照组（0.9mmol/L）、正常磷（1.3mmol/L）组、高磷（2.6mmol/L）组，培养第6天，通过茜素红染色检测钙沉积情况， RT-PCR和Real-time PCR技术检测DMP-1、E11、Sclerostin mRNA表达情况、Western Blot检测E11蛋白表达情况，所有实验至少重复3次。【结果】 1.高磷饮食16周后，与SNP大鼠相比，NHP组大鼠血肌酐、尿素氮、血磷、尿蛋白、iPTH以及动脉血压明显升高（P＜0.05）。经硫代硫酸钠治疗后，THP组大鼠血清肌酐、尿素氮、均较钙化组明显下降（P＜0.05）、血磷浓度、尿蛋白、iPTH以及血压均下降（P＜0.05）。 Von kossa染色显示，16周后SNP和SHP组大鼠主动脉未见明显的黑色钙盐沉积物， NNP组仅出现散在点状黑色钙盐沉积物，而NHP组大鼠主动脉出现明显的点状及线状的黑色钙盐沉积物，经硫代硫酸钠治疗后，THP组血管黑色钙盐沉积物明显减少。茜素红染色与Von kossa染色结果一致，阳性结果为橘红色钙盐沉积物。 RT-PCR显示，与SNP组相比，NHP组血管DMP-1、E11、Sclerostin的mRNA表达明显升高（P＜0.05），经硫代硫酸钠治疗后THP组血管DMP-1、E11、Sclerostin的mRNA表达较NHP组降低（P＜0.05）。Real-time PCR显示，与SNP组相比，NHP组血管DMP1mRNA表达明显升高（P＜0.05），经硫代硫酸钠治疗后THP组血管DMP1mRNA表达较NHP组降低（P＜0.05）。免疫组化染色显示，与SNP组相比，NHP组血管E11表达明显增加（P＜0.05），经硫代硫酸钠治疗后，THP组血管E11表达较NHP组明显减少（P＜0.05）。Westernblot显示，与SNP组相比，NHP组血管E11蛋白表达明显升高（P＜0.05），经硫代硫酸钠治疗后THP组血管E11蛋白表达较NHP组降低（P＜0.05）。 2.在高磷诱导的VSMC中，茜素红染色结果显示，与空白对照组和正常磷组相比，高磷组钙盐沉积明显升高（P﹤0.05）。RT-PCR和Real-Time PCR结果同样显示，高磷组VSMC DMP-1、E11、Sclerostin mRNA表达明显增加（P﹤0.05）。Western Blot检测VSMC E11蛋白表达,高磷组较空白对照组和正常磷组明显增加（P﹤0.05）。【结论】 1.5/6肾切除手术加高磷饮食喂养16周，可成功建立残肾大鼠血管钙化模型;高磷条件可在体外成功诱导大鼠VSMC钙化。骨细胞标志性蛋白DMP-1、E11、Sclerostin在钙化的血管和VSMC中表达增加，提示血管钙化过程中血管平滑肌细胞最终向骨细胞样细胞转分化。 2.硫代硫酸钠早期干预组DMP-1、E11、Sclerostin的表达降低，提示硫代硫酸钠可能通过下调来DMP-1、E11、Sclerostin的表达来减轻血管钙化。

关键词：残肾大鼠血管钙化血管平滑肌细胞DMP-1 E11 Sclerostin慢性肾脏病硫代硫酸钠治疗