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基于正向遗传学策略解析水稻免疫相关性状分子机制

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基于正向遗传学策略解析水稻免疫相关性状分子机制

第三届“模式生物与人类健康”发育遗传学全国学术研讨会

作者：陈松彪福建省农业科学院生物技术研究所福建省农业遗传工程重点实验室

水稻抗病分子基础及其信号通路与拟南芥等双子叶模式植物的抗病分子途径相比有很大差异。许多拟南芥抗病通路中关键节点的同源蛋白在水稻中对抗病途径的影响并未象其在拟南芥中的影响那么显著。为了深入研究水稻抗病分子机制,本研究综... 详细信息

水稻抗病分子基础及其信号通路与拟南芥等双子叶模式植物的抗病分子途径相比有很大差异。许多拟南芥抗病通路中关键节点的同源蛋白在水稻中对抗病途径的影响并未象其在拟南芥中的影响那么显著。为了深入研究水稻抗病分子机制,本研究综合利用组培诱变、T-DNA插入、EMS诱变、辐射诱变等策略,大规模创制涉及水稻免疫相关性状的突变体,并结合高通量全基因组测序,建立高效图位克隆体系,对控制水稻免疫相关性状的遗传位点进行解析。基于正向遗传学策略,已鉴定了系列调控水稻PCD及抗病应答、以及基础抗性的关键节点基因,

关键词：水稻抗病机制正向遗传学图位克隆体系

来源： cnki会议评论

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林木基因组及功能基因克隆研究概述

遗传 2010年第7期32卷 677-684页

作者：尹佟明南京林业大学江苏省杨树品种改良与种质创新重点实验室南京210037

在美国能源部资助下,首个多年生木本植物——杨树的全基因组测序已经完成且序列信息已对公众开放。杨树全基因组测序的完成标志着林木基因组进入后基因组研究时代。克隆控制重要性状的主效基因是林木后基因组时代的主要研究内容。近年来... 详细信息

在美国能源部资助下,首个多年生木本植物——杨树的全基因组测序已经完成且序列信息已对公众开放。杨树全基因组测序的完成标志着林木基因组进入后基因组研究时代。克隆控制重要性状的主效基因是林木后基因组时代的主要研究内容。近年来,在一些重要作物,如水稻、蕃茄及玉米中,先后成功克隆了多个控制重要农艺性状的主效基因,分子育种在作物中已进入实用阶段。林木相对于这些重要作物而言,分子遗传学的研究起步较晚,同时,由于林木自身的一些生物学特性,在林木中精确定位与克隆未知基因一度被视为遗传学研究领域的难点。随着技术和研究手段的不断进步,以及林木基因组资源的快速积累,有望在这一领域取得突破,为在林木中开展分子育种创造条件。文章综述了国际上林木基因组与功能基因克隆研究的现状与新发展,并对后基因组时代的林木功能基因克隆研究的预期成果进行了展望,以期为从事该领域研究的科研人员提供参考。

关键词：基因克隆林木基因组反向遗传学正向遗传学连锁分析相关分析分子育种

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遗传学原理下的疾病基础研究新模式

空军军医大学学报 2024年第6期45卷 601-608页

作者：韩骅空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032

遗传学是研究生命体性状传递规律和机制的科学,其核心目标是确定性状和遗传信息的载体——基因之间的关系。迄今为止,人们在性状基因关系的探索方面取得了巨大的成就,在这一过程中也积累了系统的研究方法。其基本的研究逻辑可以概括为... 详细信息

遗传学是研究生命体性状传递规律和机制的科学,其核心目标是确定性状和遗传信息的载体——基因之间的关系。迄今为止,人们在性状基因关系的探索方面取得了巨大的成就,在这一过程中也积累了系统的研究方法。其基本的研究逻辑可以概括为两个思路,即正向遗传学思路——从性状的深入分析到发现控制该性状的基因,反向遗传学思路——从突变功能未知的基因观察基因突变产生的性状。然而,若将人类疾病也看作是人类性状,那么遗传学方法在疾病研究中的贡献还没有达到人们的期望。近年来,随着人类基因组计划的完成而建立起来的组学技术方法和数据库,给研究人类疾病性状带来了新的机遇,从而引发了疾病基础研究模式的转变。

关键词：正向遗传学反向遗传学基因组学

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真菌遗传学方法研究进展

菌物研究 2019年第3期17卷 173-179页

作者：龚玉林贺丹卫芸芸赵卜司王丽吉林大学基础医学院病原生物学系

真菌是一种数量种类庞大的真核生物,广泛存在于环境之中,在农业、工业和医学领域发挥着极其重要的作用。研究其遗传信息、解析相关基因功能及其通路,将更好地服务于人类发展需求。近年来,随着各种遗传学研究方法的不断改进与创新,各种... 详细信息

真菌是一种数量种类庞大的真核生物,广泛存在于环境之中,在农业、工业和医学领域发挥着极其重要的作用。研究其遗传信息、解析相关基因功能及其通路,将更好地服务于人类发展需求。近年来,随着各种遗传学研究方法的不断改进与创新,各种方法技术逐步成熟。根据机制的不同,可分为正向遗传学与反向遗传学两类。正向遗传学是由表及里的研究方法,通过其表型的改变进而研究其基因变化。反向遗传学是由里及表的研究方法,通过基因分析后进行基因的定向敲除,然后研究其表型变化。真菌种类繁多,各种研究方法的原理也不尽相同,综合各种利弊,选择适当的研究方法有利于提高研究效率。文中根据正向遗传学与反向遗传学的研究状况进行了综述。

关键词：真菌遗传方法转化正向遗传学反向遗传学

农杆菌介导转化水稻纹枯病菌原生质体体系的构建及优化

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农杆菌介导转化水稻纹枯病菌原生质体体系的构建及优化

作者：孙志光四川农业大学

学位级别：硕士

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一,超过1/3的世界人口将其作为主要食物来源,是中国产量最大的粮食作物,年产1.9亿t左右。水稻纹枯病、白叶枯病、稻瘟病是水稻的三大主要病害,对水稻产量造成严重的影响。关于白叶枯... 详细信息

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一,超过1/3的世界人口将其作为主要食物来源,是中国产量最大的粮食作物,年产1.9亿t左右。水稻纹枯病、白叶枯病、稻瘟病是水稻的三大主要病害,对水稻产量造成严重的影响。关于白叶枯病、稻瘟病的研究已经展开的很多,而且很深入。而对于纹枯病的研究不多——纹枯病的致病机理不清楚,而且关于致病基因克隆的报道也很少。本研究通过构建双元质粒pCAMBIA1300sGFP,用农杆菌介导转化水稻纹枯病菌原生质体、菌丝,以潮霉素磷酸转移酶为筛选标记,将外源基因绿色荧光蛋白（GFP）基因导入水稻纹枯病菌基因组。为了制备水稻纹枯病菌原生质体,我们建立了水稻纹枯病菌原生质体制备、再生的最优体系;最佳的原生质体制备条件：通过纤维素酶和崩溃酶的组合对菌龄为12h的菌丝,35℃条件下,以pH5.2,0.6mol/L的硫酸镁为渗透压稳定剂,酶解3h,此条件下得到的原生质体产率高达16.7×108个/g;原生质体再生的最优条件为：在再生培养基RM上,酶解2.5h,菌龄为16h的原生质体,以0.6mol/L硫酸镁为渗透压稳定剂,26℃条件下培养时,再生效果最佳,同时比较了几种再生培养基对再生的影响,其中RM再生率最高,再生率最高可达39%,而IM再生效果相当,但是再生时间要长20h。PSA培养基再生效果不理想,再生效率仅为12%。通过农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝和原生质体,获得了6000株转化子;同时对农杆菌转化原生质体、菌丝的转化体系进行了优化,获得了稳定、有效的转化体系,最优转化体系为：农杆菌/原生质体比为200：1,预诱导和共转化同时以200μmol/乙酰丁香酮诱导,24℃下预诱导10h、共转化36h时,获得的转化效率最高,每106个原生质体可以获得600个转化子;通过比较农杆菌介导转化（ATMT）、限制性酶切插入（REMI）、PEG介导转化在转化效率方面的差异,可以得知,三种方法都能获得转化子,但是农杆菌转化效率更高、更为稳定。获得转化子之后,通过正向遗传学分析突变子的表型——菌落形态、菌丝显微观察、生理生化、致病性,为探索控制表型、性状的基因提供丰富的材料。在生长速率方面,大部分突变子的平均生长速率都小于1.00mm/h（标准菌株的平均生长速率为1.34mm/h）,其中突变子267的平均生长速率明显变缓,只有0.46mm/h;在致病性方面,276、130、115等突变子的致病性明显减弱,突变子267基本上不致病,而突变子340的致病性较标准菌株明显增强。以双元载体T-DNA的边界序列设计引物,已经获得2个突变子的右边界序列,通过与立枯丝核菌IG1-IA基因组序列进行比对,目前扩增的序列长度有限,无法预测基因功能,但是也为进一步克隆完整的基因序列奠定了基础。另外,将含有GFP基因的突变株侵染水稻,进行荧光显微观察,从亚细胞结构上观察水稻纹枯病菌侵染水稻的过程,与标准菌株侵染水稻相比,突变子的菌丝在荧光显微下可以清楚的看到菌丝发出绿色荧光,为之后观察纹枯病病菌-水稻互作提供了一个可靠的工具。

关键词：水稻纹枯病水稻纹枯病菌正向遗传学 T-DNA 双元载体 GFP

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拟南芥硝态氮调控突变体的筛选与鉴定

拟南芥硝态氮调控突变体的筛选与鉴定

作者：雷钊山东农业大学

学位级别：硕士

氮素是植物生长发育所必需的大量元素,参与了蛋白质、核酸、叶绿体及各类含氮物质的合成。氮肥的广泛使用促进了全球农业生产的提高,但是施用的氮素无法被植物完全吸收,大量流入环境中,造成了严重的资源浪费和环境污染,这一问题已十分突... 详细信息

氮素是植物生长发育所必需的大量元素,参与了蛋白质、核酸、叶绿体及各类含氮物质的合成。氮肥的广泛使用促进了全球农业生产的提高,但是施用的氮素无法被植物完全吸收,大量流入环境中,造成了严重的资源浪费和环境污染,这一问题已十分突出,亟待解决。因而加强对氮素的研究,培育高氮效作物新品种,提高作物对氮肥的吸收利用效率,对于减少环境污染、实现农业的可持续发展意义重大。大多数植物吸收氮素以土壤中的硝态氮为主,植物体通过高/低亲和转运系统从土壤中吸收N03-,并将其运输到根或叶,在硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的作用下同化为谷氨酸,参与蛋白质等的合成。N03-不仅是一种营养成分,也是一种信号分子,植物体可通过感知外界N03-信号并作出响应,进而调控根系发育等各类生命活动以适应复杂多变的环境。硝态氮调控基因在响应过程中起重要作用,理清硝态氮的调控网络是解决上述问题的基础与关键。近年来,数个硝态氮调控基因被鉴定出来,如CHL1、NLP7、CIPK8/23、LBD37/38/39等。Crawford实验室通过多年努力,发现了一个N03-顺式元件,并与一个单一的增强子片段和YFP相连接,开发合成了一个响应N03-的启动子(NRP),利用其设计了一套硝态氮调控突变体筛选系统。通过该系统已筛选出两个拟南芥突变体,并将相关基因成功地克隆出来,经鉴定这两个基因都参与了硝态氮的调控。本实验利用上述突变体筛选系统筛选出一个突变基因,并鉴定其为一个新的硝态氮调控基因：(1)对转入N03-响应启动子的株系(SS204-9)种子进行EMS诱变,并在琥珀酸铵(NH4-Su)条件下培养M2代,筛选出两个发强烈荧光的突变株(C9、E7)。(2)通过图位克隆将C9、E7突变位点定位于4号染色前端,结合全基因组测序技术,确定二者突变基因都为AtBNRG1。(3)将C9、E7进行杂交,后代在NH4-Su培养条件下(无N03-)同样发亮荧光,进一步证明二者为等位基因突变体。(4)测定C9、E7体内硝态氮含量,均高于野生型,表明AtBNRGl调控了硝态氮的体内积累。(5)测定无氮培养基上生长的幼苗体内N03-响应基因的表达量,发现C9、E7突变体中NIA1、NIR的表达量均高于野生型,表明AtBNRG1是硝态氮调控基因。(6)将C9、E7在不同氮源(KNO3、NH4NO3、NH4-Su)条件下培养,发现各条件下荧光都较强,且都强于SS204-9,推测AtBNRG1可能为一个N03-响应基因抑制子。(7)将C9、E7原始突变体在不同氮源(KNO3、NH4NO3、NH4-Su)条件下培养,检测发现与野生型相比,突变体主根较短,侧根密度较大,推测AtBNRG1可能参与了根系生长发育的调控。

关键词：硝态氮硝态氮调控基因正向遗传学突变体筛选根系调控

斑马鱼造血缺陷突变体smu1347的表型分析以及定位克隆

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斑马鱼造血缺陷突变体smu1347的表型分析以及定位克隆

作者：廖文甲南方医科大学

学位级别：硕士

生物的造血过程是一个有序而复杂的动态过程,从胚胎发育开始,贯穿生物体一生不断产生并补充血液系统。在这个过程中每个血液细胞受到不同转录因子的调控从而发育成不同的成熟血细胞。其中任何一个环节的出错都有可能引起造血异常造成血... 详细信息

生物的造血过程是一个有序而复杂的动态过程,从胚胎发育开始,贯穿生物体一生不断产生并补充血液系统。在这个过程中每个血液细胞受到不同转录因子的调控从而发育成不同的成熟血细胞。其中任何一个环节的出错都有可能引起造血异常造成血液疾病的发生。目前造血过程的分子调控机制依然不明确。因此深入研究造血过程中各种血细胞生成的细胞分子遗传学特征,对临床治疗和诊断血液系统疾病具有重要意义。斑马鱼作为新兴的模式生物在血液疾病模型研究中具有体型小、在体外受精发育、繁殖周期短且数量多、生长发育速度快、躯体透明易于观察、生存能力强等优势很适合用于N-乙基-N-亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea,ENU）化学诱变的大规模正向遗传学突变体的筛选。正向遗传学筛选是我们通过表型变化研究基因变化的重要手段之一,其优点是可以根据目的挑选突变表型,寻找到相应的突变基因从而揭示该基因的功能。获得理想的突变模型之后可以通过定位克隆技术找到相应的突变基因进行下一步研究。本文对通过ENU诱变获得的斑马鱼造血缺陷突变体smu1347进行了血液相关的表型分析,并利用定位克隆技术去寻找突变位点所在的位置。目的本文的研究目的是对由ENU诱变获得的斑马鱼突变体smu1347在造血发育上各个谱系的表型进行分析,并利用定位克隆技术去寻找突变体smu1347突变位点并验证突变体表型与突变基因之间的联系。方法1)通过原位杂交的方法来检测smu1347突变体的原始造血和定向造血中各谱系标记基因的表达情况。2)利用吖啶橙染色,TUNEL实验和抗体染色检测smu1347突变体在发育过程中的造血干细胞（HSCs）凋亡是否有变化。3)采用常规的斑马鱼定位克隆方法,去寻找突变基因及其突变位点。结果1)原位杂交结果显示smu1347的原始造血未受到明显的影响,而定向造血出现缺陷。2)利用吖啶橙染色以及TUNEL实验我们发现smu1347在3dpf时期在头部,尾部造血组织以及尾部脊髓出现细胞凋亡增加的表型。3)初始定位的结果将突变体smu1347的突变基因定位于25号染色体上,精确定位进一步将其定位于ZH66D24和ZC11122这两个SSLPs（simple sequence length polymorphisms）之间。该范围内有15个候选基因,对突变体在15个候选基因的CDS序列进行测序,未发现突变位点。结论1)本文对通过ENU诱变获得的斑马鱼造血缺陷突变体smu1347进行了血液相关的表型分析,发现该突变体存在定向造血的发育缺陷,且该缺陷很有可能是造血干细胞缺陷所引起的。2)利用定位克隆技术将突变位点定位至25号染色体上的一段范围内,该范围内有15个候选基因,经过对突变体在15个候选基因的CDS序列的测序,未有发现突变位点,突变位点很有可能位于内含子上的某个基因的调控区内。

关键词：斑马鱼正向遗传学突变体造血发育

Revealing the Molecular Mechanism Controlling Barley（Hordeum Vulgare L.）Spike Development

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Revealing the Molecular Mechanism Controlling Barley（Hordeu...

作者： Vinh Trieu To 上海交通大学

学位级别：硕士

大麦（Hordeum vulgare L.）是一种重要的谷类作物,许多国家都有种植,主要用来作为人类的食物、牲畜和酿造啤酒。大麦花序由三朵小花组成,包括一个中间小花和两个侧小花。根据侧小穗的育性大麦可分为三种常见的棱型花序。然而,大麦花序... 详细信息

大麦（Hordeum vulgare L.）是一种重要的谷类作物,许多国家都有种植,主要用来作为人类的食物、牲畜和酿造啤酒。大麦花序由三朵小花组成,包括一个中间小花和两个侧小花。根据侧小穗的育性大麦可分为三种常见的棱型花序。然而,大麦花序发育的分子机制还不清楚。为了更好地理解棱型决定机制,本研究采用了不同的方法对一个假定的大麦花序调节转录因子家族进行正向遗传学、反向遗传学和全基因组分析,来更好地了解大麦穗发育过程。具体包括:1)多棱、短节间、短穗等突变体表型,经过自交、杂交、回交多代收集。2)为了找到控制突变体表型的基因,我们开发了Hua30和Golden Promise品种之间的Indel（insert-delete）分子标记。3)此外,我们用CRISPR/Cas9系统敲除了玉米中调控腋生分生组织分化的RA-3在大麦中的同源基因。然而,在大麦转基因株系中没有观察到花序相关表型。4)为探究赤霉素（GA）对花序结构的影响,我们进行了系统发育分析和GRAS基因家族在不同组织的表达分析。通过进化树分析将62个GRAS基因分为12个亚组。值得注意的是,通过q RT-PCR实验检测到18个GRAS基因在穗发育过程中有表达。这些结果为大麦花序结构的进一步研究提供了线索。。

关键词：穗正向遗传学反向遗传学全基因组 Indel分子标记