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伯氏致病杆菌SN269菌株的筛选及次生代谢产物研究

伯氏致病杆菌SN269菌株的筛选及次生代谢产物研究

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作者：张春珍沈阳农业大学

学位级别：硕士

在昆虫病原线虫中寄生的共生菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性细菌;其中与异小杆线虫科(Heterothabditidae)共生的发光杆菌(Phothrabdus),与斯氏线虫科(Steinernematidae)共生的致病杆菌(Xenohrabdus),是共生菌中仅有的的两类菌,他们寄生于3期侵染线虫的肠道内,随着寄主线虫一同进入到昆虫体内,并被释放到昆虫的血腔中,通过释放一系列的对昆虫有抑制分解作用的代谢产物,来杀死昆虫,为共生菌本身和线虫的生长发育和繁殖提供了充足的养分和养料。由于具有广泛的杀虫和抑菌效果,携带共生菌的线虫和线虫-共生菌复合体已经成为具有高效生物活性的新型的生物制剂,在农业上病虫害的生物防治中发挥着重要作用。特别是其中起到关键致病作用的共生菌,能够在发酵过程中合成和分泌多种具有高效抑菌活性和调节作用的代谢产物,对其进行分离纯化及结构鉴定在农业领域具有巨大的挖掘潜力,也将为新生物农药的研发奠定基础。本实验针对共生菌的主要研究方法和结果如下:1.共生菌菌株的分离纯化:本文通过对辽宁省内(抚顺市,丹东市凤城,铁岭市龙首山,铁岭市西丰等)以及省外周边(内蒙古牙克石市博克图,呼伦贝尔市扎兰屯;吉林省白山市长白山等)部分地区的土样进行采集,共得到102个土样;采用white-trap法分离获得了 38株初生型和4株次生型菌株,共计42株。2.目标菌株的筛选:对分离纯化得到的42株共生菌进行小发酵,用大孔树脂吸附法获取共生菌的粗提物。采用TLC检测技术对菌株发酵粗提物进行分析检测,结果表明SN231具有不同于其他所有粗提物的组分。分别采用菌丝生长速率法和菌块移置法测定候选菌株及其粗提物对植物病原真菌的抑制作用。结果表明,SN231菌株及其发酵粗提物均对辣椒疫霉病菌有一定的抑制作用。所以选定其为目标菌株,列入实验室的菌种库给予新的命名SN269,进行下一步实验。***269菌株的鉴定:对SN269菌株进行16SrRNA序列分析。PCR扩增SN269菌株的16S rRNA序列,选择同源序列进行Clustal比对,采用Mega 6.0软件构建系统发育树,结果显示SN269菌株与Xenorhabdus bovienii聚在一起,同源性为100%,所以SN269 菌株属于 Xenorhabdus bovienii,命名为Xenorhabdus bovieniiSN269。***269菌株次生代谢产物分离纯化:对SN269菌株进行液体发酵得到粗提物。然后利用柱层析技术与半制备高效液色谱技术相结合的方法对SN269菌株的次生代谢产物进行分离纯化,获得目标化合物D3。5.D3化合物的结构鉴定及活性研究:经核磁共振波谱及高分辨质谱分析,并结合相关文献,将D3鉴定为madumycin Ⅱ,是Streptogramin中具有高效抑菌活性的抗生素。通过菌丝生长速率法和微量肉汤稀释法测定化合物D3的抑真菌及细菌活性,结果表明化合物D3对辣椒疫霉和番茄灰霉的抑制效果尤为突出(EC50值分别为35.32和35.40μg/mL),并且对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果IC50值为分别为0.13±0.02μg/mL。

关键词：伯氏致病杆菌菌株分离次生代谢产物分离纯化结构鉴定抑菌作用

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