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次乌头碱对东方黏虫几丁质脱乙酰酶2（MsCDA2）的影响

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次乌头碱对东方黏虫几丁质脱乙酰酶2（MsCDA2）的影响

作者：杨萌沈阳农业大学

学位级别：硕士

次乌头碱是从黄花乌头等乌头属植物的块根中分离得到的一种主要的有毒生物碱,有研究表明次乌头碱对甜菜夜蛾、菜青虫、淡色库蚊、桃蚜等均具有良好的杀虫作用,实验室先前的研究发现次乌头碱对东方黏虫及多种害虫具有较好的胃毒作用。为... 详细信息

次乌头碱是从黄花乌头等乌头属植物的块根中分离得到的一种主要的有毒生物碱,有研究表明次乌头碱对甜菜夜蛾、菜青虫、淡色库蚊、桃蚜等均具有良好的杀虫作用,实验室先前的研究发现次乌头碱对东方黏虫及多种害虫具有较好的胃毒作用。为进一步明确次乌头碱的杀虫作用机理,以东方黏虫为试虫,对次乌头碱的杀虫活性展开深入研究。结果发现低浓度的次乌头碱处理东方黏虫后会出现致死性蜕皮的现象,表现为蜕皮蜕一半或不完整。实验室构建的东方黏虫二代三代转录组测序结果表明与蜕皮相关的几丁质脱乙酰酶被显著影响,基于此本论文为探究次乌头碱对东方黏虫几丁质脱乙酰酶的影响,选择黏虫几丁质脱乙酰酶2基因(MsCDA2)的两个剪切子(MsCDA2a和MsCDA2b)为研究对象,通过对东方黏虫几丁质脱乙酰酶2基因的克隆鉴定及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR技术,以及测定酶活性等方法探究了次乌头碱对东方黏虫几丁质脱乙酰酶的作用,研究过程及结果如下:1.测定了次乌头碱对东方黏虫的毒力、生长发育影响以及对三种解毒酶的活性影响,结果表明用次乌头碱处理东方黏虫3龄幼虫24 h后出现症状,但死亡率均较低、48 h的LC为26.15 mg/L,毒力回归方程为y=2.5905x+1.3282、72 h的LC为24.75 mg/L,毒力回归方程为y=2.4347x+1.6071;次乌头碱对东方黏虫的生长发育具有显著的抑制作用,与对照相比,24 h、48 h和72 h抑制率最高的是8 mg/L的次乌头碱处理组,可达91%、89%和91%;次乌头碱可以激活羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、细胞色素P450这三种解毒酶的活性,浓度为50 mg/L的处理组三种酶活性最高,分别可达到对照的2.34倍、3.39倍和3.36倍。2.从实验室先前测定的东方黏虫二代三代转录组测序数据中筛选出MsCDA2a和MsCDA2b的序列,设计引物并利用PCR技术进行克隆验证。克隆成功后,采用生物信息学的方法对MsCDA2a和MsCDA2b的相关信息进行分析:将两个序列与NCBI上公开的东方黏虫基因组数据进行比对,结果发现MsCDA2a和MsCDA2b分布于Chr9染色体上,两个序列的总长度均为6196 bp、均有5段外显子和4段内含子;开放阅读框分别为1704 bp和1686 bp,编码542和536个氨基酸;预测出MsCDA2a和MsCDA2b蛋白均具有信号肽(SP)、几丁质结合域(Ch BD)、低密度脂蛋白受体(LDLa)和几丁质脱乙酰基催化域(CDA);构建系统发育树,分析出他们属于第I类CDA蛋白;利用软件将次乌头碱与东方黏虫几丁质脱乙酰酶2的可变剪切子进行分子对接,结果显示对接的位置大部分在几丁质脱乙酰基催化域(CDA)上,此功能域行使的功能是将几丁质转化为壳聚糖,从而影响蜕皮,推测与观察到的蜕皮异常的现象相关联。3.采用荧光定量PCR技术,检测次乌头碱对东方黏虫3龄幼虫MsCDA2a和MsCDA2b基因相对表达量的影响,结果表明:次乌头碱显著影响基因的相对表达量。与对照相比,10 mg/L的次乌头碱处理24 h后导致两个剪切子的相对表达量分别降低了18.1%和36.0%,随着次乌头碱浓度的增加,相对表达量逐步增加且均高于对照,其中40mg/L的次乌头碱处理后,两个剪切子的相对表达量最高,分别是对照的2.64倍和13.98倍。已有研究结果表明CDA2a可能存在于昆虫的表皮,CDA2b可能存在于肠道,推测MsCDA2a影响东方黏虫的蜕皮,MsCDA2b会影响东方黏虫的围食膜。酶活测定结果显示:次乌头碱可以激活表皮和肠道的几丁质脱乙酰酶活性,其中10 mg/L的次乌头碱处理24 h后的激活效果最好,分别是对照的1.53倍和1.69倍。基于上述结果,次乌头碱对东方黏虫具有显著的胃毒活性和生长发育抑制作用,对解毒酶具有激活作用。荧光定量PCR和几丁质脱乙酰酶活性测定结果显示,低浓度的次乌头碱会使MsCDA2a和MsCDA2b基因表达量降低,而几丁质脱乙酰酶活性增加,推测次乌头碱诱发东方黏虫的致死性蜕皮,可能是由于次乌头碱影响MsCDA2a导致的,次乌头碱影响东方黏虫围食膜而产生反吐现象,可能是由于次乌头碱影响MsCDA2b。

关键词：次乌头碱东方黏虫杀虫活性几丁质脱乙酰酶2 基因表达

次乌头碱、甘草苷及甘草次酸配伍对慢性心力衰竭大鼠的心肾保护作用研究

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中国中西医结合杂志 2018年第8期38卷 974-978页

作者：付楠周惠芬何昱万浩芳万海同虞立王利勤杨洁红浙江中医药大学心脑血管病研究所杭州310053 浙江中医药大学药学院杭州310053 浙江中医药大学基础医学院杭州310053

目的研究附子、甘草三种有效成分次乌头碱、甘草次酸、甘草苷配伍对慢性心力衰竭大鼠的心肾保护作用。方法应用主动脉弓缩窄术(TAC)建立慢性心力衰竭模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(1mg/kg,地高辛组)、次乌头碱组(2.0... 详细信息

目的研究附子、甘草三种有效成分次乌头碱、甘草次酸、甘草苷配伍对慢性心力衰竭大鼠的心肾保护作用。方法应用主动脉弓缩窄术(TAC)建立慢性心力衰竭模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(1mg/kg,地高辛组)、次乌头碱组(2.07mg/kg)、次乌头碱(2.07mg/kg)+甘草苷(20mg/kg)+甘草次酸(25mg/kg)配伍组(三药合用组),每组8只,各治疗组连续灌胃给药1周。干预结束6h后检测各组大鼠的超声心动图指标室间隔的厚度(IVSd)、左室后壁厚度(LVPWd)、左心室质量(LVMass)、左室短轴缩短率(FS)、左室射血分数(EF);腹主动脉取血后,取心、肾称重。酶联免疫法检测血浆中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的含量变化;全自动生化检测仪检测血清BUN、SCr含量变化;HE染色评估心脏病理损伤情况;HE染色和Masson染色评估肾小球肾小管损伤情况以及肾间质纤维化程度。结果与模型组比较,三药合用组超声心动图指标IVSd、LVPWd、LVMass、FS、EF降低(P次乌头碱组比较,三药合用组FS、EF、BUN、SCr、AngⅡ浓度降低(P次乌头碱、甘草次酸、甘草苷配伍对慢性心力衰竭引起的左心室肥大、心功能障碍以及肾功能损伤有拮抗作用,三药合用的保护作用显著强于次乌头碱。

关键词：慢性心力衰竭次乌头碱甘草苷甘草次酸配伍

次乌头碱和甘草苷及甘草次酸配伍对急性心力衰竭大鼠的动态保护研究

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中华中医药杂志 2019年第2期34卷 746-750页

作者：万嘉洋付楠曹雪滨杨洁红万浩芳何昱万海同王利勤周惠芬浙江中医药大学杭州310053 中国人民解放军252医院保定071000 南昌大学第一附属医院南昌330006

目的:研究附子甘草3种有效成分次乌头碱、甘草次酸、甘草苷对急性心力衰竭大鼠的保护作用,为深入探讨附子甘草配伍"强心减毒"的作用机制奠定药效学实验基础。方法:建立稳定的急性心力衰竭模型,随机将大鼠分为模型组,地高辛组,次乌头碱组... 详细信息

目的:研究附子甘草3种有效成分次乌头碱、甘草次酸、甘草苷对急性心力衰竭大鼠的保护作用,为深入探讨附子甘草配伍"强心减毒"的作用机制奠定药效学实验基础。方法:建立稳定的急性心力衰竭模型,随机将大鼠分为模型组,地高辛组,次乌头碱组,次乌头碱和甘草苷、甘草次酸配伍组(三药合用组)。十二指肠一次性给药,在造模后、给药后0、2、5、10、15、20、30、45、60min同步测定血流动力学指标,计算其变化率。结果:与模型组比较,三药合用组给药后2～20min显著改善急性心力衰竭大鼠的左心室舒张压(LVDP)、左心室内压下降最大速率(-dp/dtmax)(P次乌头碱组,三药合用组能显著拮抗次乌头碱导致的心律失常现象,10～15min显著改善LVDP(P次乌头碱、甘草次酸和甘草苷配伍对急性心力衰竭大鼠有时效持久的强心作用,对次乌头碱产生的心率失常有拮抗作用。

关键词：次乌头碱甘草次酸甘草苷配伍急性心力衰竭血流动力学动态

次乌头碱对脑梗死大鼠神经功能与血清中t-PA,PAI-I含量水平的影响

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中风与神经疾病杂志 2017年第7期34卷 625-627页

作者：梁华峰谢靖申婧田凤耿玉荣唐娟刘春红张惠丽新疆石河子大学医学院第一附属医院神经内科新疆石河子832000

目的通过建立脑梗死大鼠模型,探讨次乌头碱对神经功能与脑梗死大鼠血清中t-PA,PAI-I含量水平的影响。方法大鼠随机分为假手术组(Sham),脑梗死组(CI),次乌头碱低剂量组(HA-L)、中剂量组(HA-M)和高剂量组(HA-H),采用线栓法建立大鼠脑动脉... 详细信息

目的通过建立脑梗死大鼠模型,探讨次乌头碱对神经功能与脑梗死大鼠血清中t-PA,PAI-I含量水平的影响。方法大鼠随机分为假手术组(Sham),脑梗死组(CI),次乌头碱低剂量组(HA-L)、中剂量组(HA-M)和高剂量组(HA-H),采用线栓法建立大鼠脑动脉闭塞模型,建模成功后,次乌头碱低剂量组、中剂量组和高剂量组分别给予次乌头碱灌胃0.25 mg/kg,0.75 mg/kg与2.25 mg/kg,每天1次,共给药3 d。给药完成后,对各组大鼠进行神经功能缺损评分,ELISA检测血清中组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和纤溶酶原激活抑制物(PAI-I)的含量水平,TTC染色检测脑梗死体积,免疫印迹法检测ICAM-1与VCAM-1蛋白表达水平。结果与脑梗死组相比,采用次乌头碱给药后,脑梗死大鼠的神经功能缺损评分显著降低,血清中t-PA与PAI-I的含量水平明显下降,脑梗死面积降低,脑组织中ICAM-1与VCAM-1蛋白表达明显下降。结论次乌头碱能够改善脑梗死大鼠的神经功能缺损状态,可能与其影响纤溶系统以及ICAM-1与VCAM-1因子表达有关。

关键词：次乌头碱脑梗死纤溶酶原 ICAM-1 VCAM-1

次乌头碱配伍甘草次酸对缺氧缺糖损伤H9c2心肌细胞的保护作用及其分子机制（英文）

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Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology) 2017年第7期18卷 586-596页

作者： Li-qin WANG Yu HE Hao-fang WAN Hui-fen ZHOU Jie-hong YANG Hai-tong WAN Cardio-Cerebro Vascular Research Institute Zhejiang Chinese Medical University Hangzhou 310053 China

目的:探讨次乌头碱(HA)配伍甘草次酸(GA)对缺氧缺糖(OGD)损伤H9c2心肌细胞的保护作用及其作用机制。创新点:首次在OGD模型中证明HA+GA对H9c2心肌细胞有明显的保护作用。此作用与减少细胞坏死和凋亡有关系,且其作用机制与磷脂酰肌醇-3-激... 详细信息

目的:探讨次乌头碱(HA)配伍甘草次酸(GA)对缺氧缺糖(OGD)损伤H9c2心肌细胞的保护作用及其作用机制。创新点:首次在OGD模型中证明HA+GA对H9c2心肌细胞有明显的保护作用。此作用与减少细胞坏死和凋亡有关系,且其作用机制与磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路有关。方法:采用H9c2心肌细胞为研究对象,将其分为七组:正常组、OGD模型组、OGD+HA组、OGD+GA组、OGD+HA+GA组、OGD+LY294002组、OGD+HA+GA+LY294002组。采用Hoechst 33342染色荧光显微镜及透射电镜观察前五组的H9c2心肌细胞的形态学改变;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测前五组细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的释放量的改变;采用异硫氰酸荧光素-磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(FITC-AV/PI)双染色法检测前五组细胞凋亡率的情况;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测加入抑制剂LY294002前后丝苏氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化丝苏氨酸蛋白激酶(p-Akt)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关x蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)等细胞作用信号通路PI3K/Akt相关蛋白的情况。结论:(1)Hoechst 33342染色荧光显微镜显示OGD+HA+GA组抗凋亡作用最明显;(2)透射电镜观察OGD+HA+GA组凋亡现象改善最多;(3)LDH、CK-MB及AST的含量变化显示OGD+HA+GA组心肌细胞损伤指标降低最多(P<0.05);(4)Western blot法检测结果显示HA+GA可以减少OGD对H9c2心肌细胞的损伤,其作用机制与PI3K/Akt信号通路有关。

关键词：次乌头碱甘草次酸 H9c2心肌细胞凋亡 PI3K/Akt

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次乌头碱与甘草苷、甘草次酸配伍的减毒作用

中华中医药杂志 2013年第9期28卷 2601-2604,I0001页

作者：刘巧云张宇燕万海同杨洁红周天梅浙江中医药大学杭州310053

目的:探讨次乌头碱(HA)与甘草苷、甘草次酸配伍对心肌细胞的减毒作用。方法:以新生SD乳鼠心肌细胞为研究对象,观察甘草苷、甘草次酸对HA引起心肌细胞的形态变化和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性的影响。结果:与12... 详细信息

目的:探讨次乌头碱(HA)与甘草苷、甘草次酸配伍对心肌细胞的减毒作用。方法:以新生SD乳鼠心肌细胞为研究对象,观察甘草苷、甘草次酸对HA引起心肌细胞的形态变化和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性的影响。结果:与120μmol/L HA组比较,120μmol/L甘草次酸、480μmol/L甘草苷与120μmol/L HA配伍可使SOD、GSH-PX的活性由(56.38±0.41)U/mL和(81.89±3.67)U/mgprot分别增加到(65.39±0.25)U/mL、(101.69±7.17)U/mgprot和(62.69±0.54)U/mL、(100.85±7.32)U/mgprot(P次酸和120μmol/L HA配伍作用更显著(P次酸与120μmol/L HA配伍可以降低HA对心肌细胞的毒性作用,增强其活力,这与甘草苷、甘草次酸减少了HA对心肌细胞的氧化损伤有关。

关键词：次乌头碱甘草苷甘草次酸减毒超氧化物歧化酶谷胱甘肽过氧化物酶

次乌头碱与甘草苷合用对大鼠心肌兴奋-收缩偶联相关基因mRNA表达的影响

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中华中医药杂志 2013年第1期28卷 117-120页

作者：彭微易明晶王俊俊孟沫然陈勇湖北大学中药生物技术省重点实验室武汉430062

目的:研究次乌头碱与甘草苷合用对心肌兴奋-收缩偶联相关离子通道基因mRNA表达的影响。方法:成年Wistar大鼠分别灌胃次乌头碱(0.23、0.69、2.***.kg-1.d-1),甘草苷(20mg.kg-1.d-1),以及次乌头碱(2.***.kg-1.d-1)与甘草苷(20mg.kg-1.d-... 详细信息

目的:研究次乌头碱与甘草苷合用对心肌兴奋-收缩偶联相关离子通道基因mRNA表达的影响。方法:成年Wistar大鼠分别灌胃次乌头碱(0.23、0.69、2.***.kg-1.d-1),甘草苷(20mg.kg-1.d-1),以及次乌头碱(2.***.kg-1.d-1)与甘草苷(20mg.kg-1.d-1)7d后,应用实时荧光定量PCR检测各给药组心肌组织中Cav1.2、NCX、SCN5A和RyR2mRNA的表达水平。结果:次乌头碱灌胃给药后能显著抑制NCX mRNA的表达与显著诱导RyR2mRNA的表达;甘草苷仅对NCX mRNA的表达有显著抑制作用;甘草苷与次乌头碱合用不仅能显著抑制SCN5A mRNA的表达与显著诱导RyR2mRNA的表达,也能显著拮抗高剂量次乌头碱对NCX mRNA表达的抑制作用。结论:甘草苷可通过干预次乌头碱对大鼠心肌SCN5A、NCX和RyR2mRNA表达的影响,从而影响次乌头碱导致的心律失常。

关键词：次乌头碱甘草苷心肌离子通道 mRNA表达

次乌头碱对乳大鼠原代培养心肌细胞的毒性作用

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中国药理学与毒理学杂志 2010年第4期24卷 261-265页

作者：李志勇孙建宁张硕峰北京中医药大学中药学院中药药理系北京100102 中央民族大学中国少数民族传统医学研究院北京100081

目的探讨次乌头碱(HA)对心肌细胞的毒性作用。方法制备乳大鼠原代心肌细胞,用锥虫蓝染色法检测心肌细胞存活率,用小鼠抗大鼠α横纹肌肌动蛋白和兔抗大鼠纤连蛋白多克隆抗体免疫化学染色法鉴定心肌细胞。制备的原代细胞培养3～4d,分别加... 详细信息

目的探讨次乌头碱(HA)对心肌细胞的毒性作用。方法制备乳大鼠原代心肌细胞,用锥虫蓝染色法检测心肌细胞存活率,用小鼠抗大鼠α横纹肌肌动蛋白和兔抗大鼠纤连蛋白多克隆抗体免疫化学染色法鉴定心肌细胞。制备的原代细胞培养3～4d,分别加入HA0,3,6,30,60和120μmol·L-1培养5,15,30和60min,记录每组细胞搏动频率;以HA体外引起心肌细胞搏动消失的浓度及作用时间为依据,将心肌细胞分为培养基对照,二甲亚砜(DMSO)对照,HA30,60和120μmol·L-1组,分别连续培养5,15,30和60min,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,倒置显微镜下观察细胞形态的变化。结果与HA0μmol·L-1组比较,HA30μmol·L-1与心肌细胞作用5,15,30和60min时细胞搏动频率增加,由40±26,42±27,38±19和(20±10)min-1分别增加到114±27,98±32,100±32和(49±13)min-1(n=12,P<0.01);HA120μmol·L-1立即导致心肌细胞停搏。不同浓度的HA随着作用时间的延长,导致LDH漏出率不同程度的增加,其中HA30,60和120μmol·L-1作用60min时细胞LDH漏出率分别为(29±8)%,(42±10)%和(57±9)%与同一时间点DMSO组比较有明显差异(P<0.01)。倒置显微镜观察发现,随着HA浓度的增加和作用时间的延长,心肌细胞有死亡现象。结论 HA对心肌细胞有毒性作用,主要表现为细胞搏动频率加快,细胞膜稳定性破坏;HA120μmol·L-1与心肌细胞作用超过120min会引起少量心肌细胞死亡。

关键词：次乌头碱心肌细胞毒性

次乌头碱、甘草苷单用与合用对大鼠肝脏CYP450酶mRNA表达与活性的影响

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中华中医药杂志 2016年第1期31卷 313-316页

作者：苗潇磊王俊俊孟沫然陈勇湖北大学中药生物技术省重点实验室湖北省生物资源绿色转化协同创新中心武汉430062

目的:探讨次乌头碱(HA)及甘草苷(LQ)分别及合并给药对大鼠肝脏细胞色素P450(CYP450)酶m RNA表达及活性的影响。方法:雄性Wistar大鼠随机分为对照组、HA组(2.1mg/kg)、LQ组(20mg/kg)、HA+LQ配伍组,每组3只,每天灌胃给药1次,连续给药7d。... 详细信息

目的:探讨次乌头碱(HA)及甘草苷(LQ)分别及合并给药对大鼠肝脏细胞色素P450(CYP450)酶m RNA表达及活性的影响。方法:雄性Wistar大鼠随机分为对照组、HA组(2.1mg/kg)、LQ组(20mg/kg)、HA+LQ配伍组,每组3只,每天灌胃给药1次,连续给药7d。取肝组织一部分用于提取总RNA,其余肝组织用于制备大鼠肝微粒体(RLM)。应用实时定量PCR检测肝脏CYP 3A1、3A2、1A2、2E1、2C7和2C11 m RNA表达量,探针底物经RLM温孵后检测CYP3A、1A2、2E1和2C活性。结果:HA组、LQ组和HA+LQ配伍组对CYP3A活性有一定抑制作用,对CYP2E1活性有较强诱导作用;LQ抑制了CYP1A2活性,HA诱导了CYP2C活性,但合用后对CYP1A2、2C活性无显著影响。此外,HA组、LQ组及HA+LQ配伍组对CYP2E1、1A2 m RNA表达无显著影响;HA组、LQ组对CYP3A1、3A2、2C7和2C11 m RNA表达有一定影响,但合用后能显著拮抗HA对上述基因表达的影响。结论:HA与LQ合用在一定程度上会抑制HA与LQ的代谢清除。此外,研究结果也提示临床上附子甘草药对与CYP3A、2E1和2C底物药物共用时,可能会发生代谢相互作用。

关键词：次乌头碱甘草苷大鼠肝微粒体细胞色素P450酶