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檀香醇对金黄色葡萄球菌CS株抑菌活性和机制的研究

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黑龙江畜牧兽医 2023年第23期 98-102,121页

作者：邵萌萌刘鑫王宇凤许文博李升黄复深湖南农业大学动物医学院长沙410128 湖南农业大学湖南兽药工程技术研究中心长沙410128

为了探讨檀香醇对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sa)的抑菌效果和机制,试验以Sa CS株为研究对象,采用倍比稀释法测定檀香醇对Sa CS株的50%最低抑菌浓度(50%minimum inhibitory concentration,MIC50);采用寇氏法计算Sa CS株对小... 详细信息

为了探讨檀香醇对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sa)的抑菌效果和机制,试验以Sa CS株为研究对象,采用倍比稀释法测定檀香醇对Sa CS株的50%最低抑菌浓度(50%minimum inhibitory concentration,MIC50);采用寇氏法计算Sa CS株对小鼠的半数致死量;将40只4周龄的昆明小鼠随机分为4组,先用半数致死量的细菌滴鼻攻毒,各组小鼠每只腹腔注射32,64,128μg/mL的檀香醇0.2 mL,以未经檀香醇处理的小鼠作为对照,正常饲喂4 d,观察小鼠存活情况,试验结束时处死全部小鼠,取肺部组织进行细菌计数,测定檀香醇的体内抑菌效果。以未经檀香醇处理的细菌作为对照,利用SDS-PAGE检测16,32,64,128μg/mL檀香醇对Sa CS株可溶性蛋白表达的影响;采用实时荧光定量PCR方法检测32μg/mL檀香醇对Sa CS株细胞分裂基因和核糖体基因表达的影响。结果表明:檀香醇对Sa CS株的MIC50为32μg/mL。对照小鼠4 d内全部死亡,经32,64,128μg/mL檀香醇处理的小鼠分别存活5,7,9只;檀香醇处理小鼠的肺部细菌数显著或极显著低于对照小鼠(P檀香醇处理6 h后菌体的可溶性蛋白表达量降低。与对照相比,经檀香醇处理的Sa CS株细胞分裂基因ftsZ相对表达量极显著降低(P0.05)。说明檀香醇对Sa CS株具有体内体外抑菌活性,其抑菌机制可能是通过降低Sa CS株的细胞分裂基因、扰乱核糖体基因的表达影响蛋白质表达实现的。

关键词：金黄色葡萄球菌CS株檀香醇抑菌活性基因抑菌机制

鸡粪肠球菌长沙株的分离和基因组特征分析及其对檀香醇的敏感性研究

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鸡粪肠球菌长沙株的分离和基因组特征分析及其对檀香醇的敏感性研...

作者：李升湖南农业大学

学位级别：硕士

粪肠球菌(Enterococcus faecalis,Ef)是一种条件致病菌,可引起畜禽等动物感染性心内膜炎、尿路感染和脓毒血症等。粪肠球菌还可以通过食物链和养殖环境传播给人,引起人粪肠球菌病。本研究从鸡肺部病灶分离粪肠球菌的基础上,对其致病性... 详细信息

粪肠球菌(Enterococcus faecalis,Ef)是一种条件致病菌,可引起畜禽等动物感染性心内膜炎、尿路感染和脓毒血症等。粪肠球菌还可以通过食物链和养殖环境传播给人,引起人粪肠球菌病。本研究从鸡肺部病灶分离粪肠球菌的基础上,对其致病性、全基因组特性进行了研究。同时在此基础上探究檀香醇对粪肠球菌的抑菌机制。1.鸡粪肠球菌的分离和全基因组序列特征分析从病死鸡肺部按常规方法分离细菌。利用Illumina平台和生物信息学方法对一株粪肠球菌分离株的全基因组序列进行分析。结果表明,分离株全基因组大小为2511248 bp,GC含量为36.57%,共编码了2270个基因。其中编码基因中含有61个t RNA基因和5个r RNA基因。通过与NCBI数据库中可获得粪肠球菌分离株全基因组序列比较分析发现,本研究分离株的基因组大小和预测的基因数目数量明显偏小。系统进化分析表明,该分离株与中国本土的人源分离株同源性较高,猜测本研究分离株对人类具有潜在的致病威胁。经过测序与生物信息学分析发现,共预测到406个毒力基因,其中铁摄取系统和粘附系统等毒力因子占据重要的比例,在粪肠球菌的致病机制方面具发挥重要的作用。2.檀香醇对粪肠球菌抑制作用的研究本研究利用常规方法检测细菌对檀香醇的抑菌效果,q PCR方法鉴定与粪肠球菌的抑制作用相关基因表达。通过SDS-PAGE电泳检测檀香醇对粪肠球菌可溶性蛋白表达的影响。结果表明,檀香醇对粪肠球菌的MIC结果为156.25μg/m L,檀香醇作用于粪肠球菌后4小时即显示出显著的抑菌作用。体内实验发现,小鼠檀香醇治疗后肺部粪肠球菌数目显著降低。q PCR结果表明,粪肠球菌经过檀香醇处理后,粪肠球菌核糖体基因、细胞分裂相关基因fts Z、DNA修复基因rec N和转录终止基因nus G等基因表达显著降低。SDS-PAGE电泳结果表明,檀香醇处理后细菌的可溶性蛋白表达水平下降。综上所述,本研究分离株的基因组与其它粪肠球菌基因组一般特征相比具有差异。进化关系上与人源分离株亲缘关系较近。檀香醇对粪肠球菌具抑制作用。

关键词：粪肠球菌全基因组测序檀香醇抑菌作用

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檀香烯与檀香醇生物合成研究进展

生物工程学报 2018年第6期34卷 862-875页

作者：王雨辰文孟良李铭刚赵江源韩秀林云南大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室西南微生物多样性教育部重点实验室云南省微生物研究所云南昆明650091 云南省保山市中医药高等专科学校云南保山678000

檀香烯和檀香醇是名贵香料檀香精油的主要组成成分,具有较好的抗菌、抗氧化和抗肿瘤等药理活性。市售檀香精油主要从檀香树提取,但檀香树生长缓慢及培育难度大,檀香精油的提取率低,难以满足市场需求,导致檀香精油价格居高不下。利用基... 详细信息

檀香烯和檀香醇是名贵香料檀香精油的主要组成成分,具有较好的抗菌、抗氧化和抗肿瘤等药理活性。市售檀香精油主要从檀香树提取,但檀香树生长缓慢及培育难度大,檀香精油的提取率低,难以满足市场需求,导致檀香精油价格居高不下。利用基因工程及分子生物学手段,在微生物体内异源生物合成檀香烯和檀香醇是缓解这种供需矛盾的途径之一。文中对檀香烯和檀香醇合酶的研究现状,以及对宿主甲羟戊酸代谢路径的改造进行总结,并提出利用蛋白质工程技术对檀香烯合酶进行定向改造的思路,为檀香烯和檀香醇的生物合成优产研究提供参考。

关键词：萜烯檀香烯檀香醇檀香烯合酶生物合成

檀香醇对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300的抑制作用

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湖南农业大学学报（自然科学版） 2020年第5期46卷 594-600页

作者：谷可欣张天翼何泾正袁中伟范维尹立子四川农业大学动物医学院四川成都611130

采用倍比稀释法与菌落计数法,分别测定檀香醇对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus,MRSA)标准菌株USA300的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);通过测定菌液电导率与DNA外渗量,探究檀香醇对USA30... 详细信息

采用倍比稀释法与菌落计数法,分别测定檀香醇对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus,MRSA)标准菌株USA300的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);通过测定菌液电导率与DNA外渗量,探究檀香醇对USA300细胞膜和细胞壁的影响;通过SDS–PAGE试验,探讨檀香醇对USA300可溶性蛋白代谢的作用;采用扫描电镜和透视电镜,观察经檀香醇处理后的USA300的超微结构;采用结晶紫染色法,研究檀香醇对USA300生物被膜的影响。结果表明:檀香醇能在一定程度上抑制USA300的生长繁殖,其MIC和MBC分别为32、64μg/m L;与对照组相比,经64μg/m L檀香醇处理1h后的USA300菌体电导率增加3.40%±0.54%,经64、32μg/mL檀香醇处理6 h后的菌体细胞内的DNA质量浓度显著增加(P檀香醇处理2、6 h后的菌体的可溶性蛋白均极显著降低(P檀香醇处理过的USA300菌体细胞膜和细胞壁变化不大,但是细胞的二分裂增殖出现明显的异常;亚抑菌浓度的檀香醇能明显抑制USA300生物被膜的形成。综上可知,檀香醇主要通过干扰细菌蛋白质代谢过程,可明显降低菌体内的可溶性蛋白质含量,进而影响细菌的生命活动,而对细胞膜和细胞壁的影响甚微。由此可见,檀香醇在新型抗MRSA药物的开发过程中具有较大的潜力。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌檀香醇 DNA外渗量可溶性蛋白质电导率超微形态生物被膜抑菌作用

酿酒酵母合成檀香醇的整合型菌株构建及其发酵优化

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酿酒酵母合成檀香醇的整合型菌株构建及其发酵优化

作者：林鎏坷浙江大学

学位级别：硕士

檀香醇(santalol)因其独特的香味和特性,在化妆品行业及医疗保健行业有着广泛的应用,且生物安全性良好。需求的增加导致檀香萜油的价格十分高昂,开发微生物生物炼制生产檀香醇是一条吸引研究者关注的新途径。本文的研究目标就是构建酿... 详细信息

檀香醇(santalol)因其独特的香味和特性,在化妆品行业及医疗保健行业有着广泛的应用,且生物安全性良好。需求的增加导致檀香萜油的价格十分高昂,开发微生物生物炼制生产檀香醇是一条吸引研究者关注的新途径。本文的研究目标就是构建酿酒酵母生产檀香醇的基因组整合型菌株,通过CRISPR/Cas9基因编辑手段,将檀香烯合酶基因、CYP736A167及其还原酶CPR2整合至酿酒酵母染色体的多拷贝位点,形成遗传特性稳定、高效生产檀香醇的菌株,最后在10L发酵罐中提高檀香醇产量。首先将诱导型表达和组成型表达的黄皮果树来源檀香烯合酶基因SaSSy及tHMG1的两种基因组件整合至酿酒酵母delta位点,并证明了诱导型檀香烯生产菌株产量高于组成型菌株,在YPD(Gal)培养基中,整合型诱导表达菌株的檀香烯产量达到128.0 mg/L,是质粒型诱导表达菌株的4.17倍。然后将CYP736A167及其还原酶基因CPR2诱导型表达组件整合至酿酒酵母rDNA位点,在YPD(Gal)中发酵,z-α-檀香醇产量达到119.2mg/L,添加甘油后发酵产量达到160.5mg/L。同时也确定了 10L罐发酵采用从头诱导的方式。最后对所构建菌株进行驯化,控制初始培养基碳源比例,采用反馈流加补料的方式,对所构建的整合型檀香醇生产菌株进行10 L罐放大发酵,最终菌体干重达到15 g/L,产量达到269.3 mg/L,初步达到了高产檀香醇的目的。总之,本项目工作对这一重要天然产物今后的异源生产奠定了良好基础。

关键词：酿酒酵母檀香醇代谢工程

多杀性巴氏杆菌全基因组特征及檀香醇对多杀性巴氏杆菌的转录组分析

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多杀性巴氏杆菌全基因组特征及檀香醇对多杀性巴氏杆菌的转录组分...

作者：吴丽梅湖南农业大学

学位级别：硕士

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)能引起多种动物和人产生巴氏杆菌病。对巴氏杆菌病的防治仍然是一个难题。本研究为探究多杀性巴氏杆菌的致病机制,比较了PmA和PmD在基因组上的差异。同时,在此基础之上利用转录组的方法研究了... 详细信息

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)能引起多种动物和人产生巴氏杆菌病。对巴氏杆菌病的防治仍然是一个难题。本研究为探究多杀性巴氏杆菌的致病机制,比较了PmA和PmD在基因组上的差异。同时,在此基础之上利用转录组的方法研究了檀香醇对Pm抑菌的机制,为揭示多杀性巴氏杆菌致病机制和抗生素替代研发奠定基础。1.多杀性巴氏杆菌强弱毒株分裂差异基因分析通过Illumina对PmA、PmD进行全基因组测序。结果表明,PmA和PmD的基因组大小和组成基本相同:PmA为2599048bp,G+C含量为39.932%,编码2580个基因。PmD为227 4155 bp,G+C含量为40.26%,编码2130个基因。PmA和PmD具有相同的代谢途径。PmD、PmA二个基因组的差异体现在基因的拷贝数和种类上。进化分析发现,Pm的进化共分为2支,即PmF单独1支,其它4个血清型为另一支,具有较近的亲缘关系;不同的血清型(包括分子分型)的进化群未见明显的宿主特异性,但具有一定的地域性。2.檀香醇抗多杀性巴氏杆菌机制的转录组分析抑菌实验发现,檀香醇对PmA有很好的抑菌效果。转录组分析结果表明,多杀性巴氏杆菌经檀香醇处理后,共有2864个基因的表达出现变化,其中有43个基因的表达出差异现显著:23个基因为显著上调,20个基因为显著下调。这些基因中,核糖体蛋白基因受影响的有13个,细胞分裂相关基因fts Z、复制体起始基因pri B、转录起始相关基因rpo E、转录终止相关基因nus G显著下调。可见,檀香醇的抑菌作用主要是通过影响基因的复制、翻译和转录多个环节,同时也影响Pm的细胞分裂。综上所述,PmA和PmD在基因组上的差异较小,包括基因的拷贝数和种类。进化上PmF与PmA、B、D、E亲缘关系较远。檀香醇通过影响基因的复制、翻译和转录以及Pm的细胞分裂来进行的。

关键词：多杀性巴氏杆菌基因组学檀香醇转录组学抑菌机制

檀香单倍型基因组组装和萜类合成酶基因家族分析

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檀香单倍型基因组组装和萜类合成酶基因家族分析

作者：韩婉欣华中农业大学

学位级别：硕士

檀香(Santalum album L.)是一种生长缓慢、具有半寄生性根的热带树种,其心材和檀香油具有极高的经济价值和医用价值。檀香油中主要芳香物质是α-檀香醇和β-檀香醇,属于倍半萜物质,萜类合成酶(TPS)是其合成通路中的关键酶。本研究结合... 详细信息

檀香(Santalum album L.)是一种生长缓慢、具有半寄生性根的热带树种,其心材和檀香油具有极高的经济价值和医用价值。檀香油中主要芳香物质是α-檀香醇和β-檀香醇,属于倍半萜物质,萜类合成酶(TPS)是其合成通路中的关键酶。本研究结合多种测序技术构建檀香染色体级别的单倍型基因组,探究檀香基因组的序列特征,并着重对檀香TPS基因家族进行生物信息学分析。(1)基于对檀香样品进行全基因组测序得到的Pac Bio CCS数据、Hi-C数据和Illumina数据进行分型组装,成功构建了檀香高质量的两个单倍型基因组。单倍型1/2基因组的大小分别为223.94 Mb和219.63 Mb,各自挂载到10条染色体上,scaffold N50分别为26.74 Mb和25.75 Mb。质量评估结果表明,单倍型1/2基因组具有较高的完整性,分别为98.10%、98.00%。(2)基因组从头注释结果表明,单倍型1/2基因组的重复序列占比分别为35.69%和34.21%,其以长末端重复(LTR)元件为主,GC含量分别为38.02%、34.83%。此外,串联重复序列(TR)分析结果表明,Cent S(单体为150 bp的TR)是檀香着丝粒区域的特征序列。同时结合LTR元件的密度分布发现,Copia型LTR的富集区域与Cent S在染色体上的位置相吻合,辅助验证了这一结果。(3)基于已报道檀香TPS基因,分别在单倍型1/2基因组中同源搜索到50个同源基因。并结合纯/杂合区域分布地图发现,其多数属于杂合基因型。系统发育分析表明,檀香TPS基因分为两个亚组,其中TPS-a亚家族是檀香最大的TPS基因家族。保守基序分析表明,Motif1和Motif6分别是hap1＿TPS和hap2＿TPS中最保守的基序。同时结合进化关系发现,TPS-a家族成员在檀香中是相对保守的。染色体定位分析表明,檀香TPS基因集中分布在基因组的少数位点,并呈现大量复制现象,说明其在进化过程中发生了扩张,助力了檀香香气物质的形成。综上,本研究首次构建檀香染色体级别基因组,为檀香科物种提供了良好的基因组资源;初次探究檀香着丝粒特征序列,为深入研究功能着丝粒提供了明确方向;系统解析檀香TPS基因家族特征,为未来设计体外合成檀香醇工艺提供了重要参考,为解析檀香醇生物合成机制提供了有用信息。

关键词：单倍型基因组组装着丝粒 TPS基因檀香醇檀香

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檀香挥发油GC-MS指纹图谱研究

药物分析杂志 2016年第10期36卷 1753-1759页

作者：杜海芳吴泽青林励祁龙凯刘红菊闫冲李静叶耀祥中国科学院华南植物园广州510650 新乡医学院新乡453003 广州中医药大学广州510006 广东医学院东莞523808 广东中檀实业有限公司台山529200

目的:建立檀香挥发油的指纹图谱分析方法,为檀香药材的质量评价提供方法与依据。方法:采用乙醚冷浸法提取檀香挥发油,应用GC-MS联用技术,采用HP-5弹性石英毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25μm),程序升温(柱温90℃,以5℃·min^(-1)升至160℃... 详细信息

目的:建立檀香挥发油的指纹图谱分析方法,为檀香药材的质量评价提供方法与依据。方法:采用乙醚冷浸法提取檀香挥发油,应用GC-MS联用技术,采用HP-5弹性石英毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25μm),程序升温(柱温90℃,以5℃·min^(-1)升至160℃,再以0.5℃·min^(-1)升至165℃,然后再以1℃·min^(-1)升至180℃,最后10℃·min^(-1)升至230℃),建立挥发油的共有峰指纹图谱,采用中南大学指纹图谱相似度评价软件和SPSS 20.0软件对不同来源的檀香油对照品及14批样品挥发油分别进行相似度评价和聚类分析。结果:所建立的檀香挥发油GC-MS指纹图谱有较好的重复性、精密度和稳定性(RSD均小于5%)。檀香油对照品及14批样品挥发油中α-檀香醇、β-檀香醇相对百分含量分别为34.225%~51.156%、20.897%~26.857%。以檀香油对照品为参照,14批样品挥发油相关系数为0.622~0.984,相合系数为0.628~0.984,但同一基地采集的5批檀香样品挥发油相关系数为0.924~0.984,相合系数为0.934~0.984,市购檀香样品挥发油相关系数为0.622~0.868,相合系数为0.628~0.838。通过聚类分析,在类间距离=15时,檀香油对照品及14批样品可以分为两类,檀香油对照品及S2~S9号样品为一类,S10~S15号样品为一类。结论:所建立的檀香挥发油GC-MS指纹图谱法为中药檀香的质量控制提供了一种有效手段。同一种植基地檀香样品的指纹图谱相似度较高,质量较均一;市售檀香样品的指纹图谱相似度较低,质量参差不齐。

关键词：檀香挥发油指纹图谱莰烯姜黄烯檀香醇反式-香柠檬醇顺式,檀香醇 β-檀香醇气相色谱质谱联用仪

檀香外源体系筛选及促进倍半萜组分合成措施的研究

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檀香外源体系筛选及促进倍半萜组分合成措施的研究

作者：程庆伟仲恺农业工程学院

学位级别：硕士

华南植物园自1962年引种檀香以来,已解决了种子贮藏、发芽、育苗和寄主选择等技术问题,目前已在广东、海南、广西等地大面积推广种植。檀香的经济价值取决于其心材,一般檀香在6龄之后才开始陆续形成心材（俗称“结香”）,国内大规模种... 详细信息

华南植物园自1962年引种檀香以来,已解决了种子贮藏、发芽、育苗和寄主选择等技术问题,目前已在广东、海南、广西等地大面积推广种植。檀香的经济价值取决于其心材,一般檀香在6龄之后才开始陆续形成心材（俗称“结香”）,国内大规模种植檀香的时间不长,目前国外檀香的轮伐期为13-15年,这么长的投资回收期,一般林场和生产单位无此长期投资能力,在不能近期获得直接经济利益的情况下,不易被接受,所以探究人工促成檀香心材形成的有效方法意义重大;檀香树极其珍贵,若直接以檀香树为材料,则需耗费大量檀香植株,探究替代性的研究体系可以为开展树体试验提供指导,而且替代性的研究体系（如愈伤组织）将会利于檀香“结香”的分子机理研究。所以,本研究定位于外源物对檀香关键倍半萜成分形成的影响,主要目的包括:（1）建立促进檀香主要倍半萜成分形成的外源物筛选体系,（2）获得有效的促进檀香“结香”的技术方法。主要结果如下:1.檀香茎段可望作为替代性的研究材料。以容易获取且易处理的叶片、茎段（直径约1 cm,2年生）和愈伤组织为材料,利用石油醚浸渍法提取叶片、茎段和胚性组织的挥发油,同时也采用水蒸馏法提取叶片的挥发油,提取的挥发油（石油醚浸渍法和水蒸馏法）用气相色谱-质谱联用仪进行检测。GC-MS结果表明:檀香叶片的挥发油（石油醚浸渍法和水蒸馏法）不含檀香心材主要倍半萜成分,且叶片含有较多的色素及其他物质,不利于进样检测,不宜用作替代性材料;檀香茎段含有主要的心材倍半萜烯醇,有望作为替代性研究材料;愈伤组织受微生物污染后表现出檀香烯和没药烯的合成和积累,可为进一步研究檀香烯醇合成的信号通路提供基础。2.确定了高效可靠的愈伤组织诱导和增殖培养基。MS+0.2-1.0 mg/l噻苯隆（TDZ）能有效诱导檀香茎段形成愈伤组织,在此诱导培养基上,愈伤组织的诱导达82-89%,愈伤组织呈亮黄色、结节状,致密,不易分散。当以继代7-10 d的愈伤组织进行液体培养（培养基为MS+TDZ 1.0 mg/l,不加琼脂）时,接种量为0.3 g/25 ml,每7-10 d继代一次,一个月后愈伤组织的鲜重可达6-10 g,足够用于检测檀香关键成分的存在与否。3.胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）（Genebank accession number:MF070491）可以促进檀香愈伤组织内关键倍半萜组分的合成和积累。正常愈伤组织不含心材主要倍半萜成分,但受感染的（或接种胶孢炭疽菌的）愈伤组织挥发油成分中检测到主要的倍半萜烯（未检测到檀香醇类）,这表明,愈伤组织可以被某种真菌诱导而产生关键倍半萜烯,表明这些关键倍半萜成分可能在防御方面起重要作用。4.BA和过氧化氢能诱导幼龄檀香关键倍半萜组分的合成。供试5种物质（6-苄基腺嘌呤、乙烯利、茉莉酸甲酯、过氧化氢、氯化钙）的2种处理浓度（2 m M和4 m M）中,4 m M BA能有效促进心材的纵向扩展,年施药四次心材纵向扩展可达150 cm,远高于其他处理和对照;经4 m M BA和4 m M过氧化氢处理形成的心材,精油含量较高,分别为2.75%和2.85%,为对照（0.65%）的4.2倍和4.4倍;在精油质量方面,2 m M乙烯利、4 m M氯化钙和两个浓度的过氧化氢处理所得檀香油符合国际标准,4m M BA和2 m M茉莉酸甲酯处理所得檀香油中α-santalol也比较接近国际标准。综合考虑心材的纵向扩展以及檀香油含量和质量,4 m M BA可用于人工促进檀香“结香”技术。

关键词：檀香诱导心材形成檀香油檀香醇气相色谱质谱联用仪