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橙色红曲菌As3.4384及其诱变体发酵产物中的桔霉素和色素的高效液相色谱研究

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分析化学 2007年第4期35卷 474-478页

作者：黄志兵李燕萍王延华许杨南昌330047 南昌大学中德联合研究院南昌大学中德联合研究院南昌大学食品科学教育部重点实验室

对橙色红曲菌As3.4384及其诱变菌株大米固态发酵物中桔霉素和色素的HPLC分离进行了优化,采用Symmetry C18(250mm×4.6mmi.d.,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水(磷酸调pH3.0,77∶23,V/V),分别采用紫外检测器(UV=254nm)、荧光检测器(λex=331... 详细信息

对橙色红曲菌As3.4384及其诱变菌株大米固态发酵物中桔霉素和色素的HPLC分离进行了优化,采用Symmetry C18(250mm×4.6mmi.d.,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水(磷酸调pH3.0,77∶23,V/V),分别采用紫外检测器(UV=254nm)、荧光检测器(λex=331nm,λem=500nm)及两者串联对桔霉素和色素进行了监测。通过ESI-MS对色素进行了鉴定,并测定了经橙色红曲菌As3.4384及其诱变菌株于30℃发酵14d后的大米、糯米、小黄米、燕麦米和红米中桔霉素含量。结果表明:ESI-MS鉴定的两种色素分别为红曲菌素和红曲黄素,橙色红曲菌As3.4384发酵后的大米、糯米、小黄米、燕麦米和红米中桔霉素含量分别为151.4、100.5、5.06、80.5和150.5mg/kg,而诱变菌株发酵后的大米、糯米、小黄米、燕麦米和红米中桔霉素含量分别为0.218、3.86、0.223、2.45和4.05mg/kg。

关键词：橙色红曲菌诱变菌株桔霉素色素大米高效液相色谱

橙色红曲菌As3.4384 orf7基因缺失株的构建及其功能分析

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中国生物工程杂志 2011年第7期31卷 79-84页

作者：邹乐花李燕萍黄志兵许杨南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌大学中德联合研究院南昌330047

红曲菌能产生多种有益的次级代谢产物,但红曲菌也产生一种对人和哺乳动物肝和肾有毒害的毒素,即桔霉素。因此控制毒素的产生是保障红曲产品安全性所必须的。故对桔霉素的合成途径及相关的基因做深入了解。6个桔霉素合成相关的基因成簇位... 详细信息

红曲菌能产生多种有益的次级代谢产物,但红曲菌也产生一种对人和哺乳动物肝和肾有毒害的毒素,即桔霉素。因此控制毒素的产生是保障红曲产品安全性所必须的。故对桔霉素的合成途径及相关的基因做深入了解。6个桔霉素合成相关的基因成簇位于21 kb的DNA片段上。克隆了一个新基因(orf7基因),其位于该基因簇的外侧。采用基因敲除技术,构建红曲菌orf7基因缺失菌株。并采用紫外分光光度法检测orf7基因缺失菌株的红曲色素产量,HPLC法检测其桔霉素产量。orf7缺失菌株产红曲色素能力与出发菌株As3.4384相比没有变化;产桔霉素培养13～19 d,桔霉素的产量与出发菌株As3.4384相比增加了142.4%。从而证实orf7基因与桔霉素代谢相关。

关键词：橙色红曲菌 orf7基因基因敲除桔霉素

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橙色红曲菌AS3.4384转化方法的建立

食品科学 2007年第10期28卷 317-322页

作者：李燕萍谭文辉许杨南昌大学中德联合研究院南昌大学食品科学教育部重点实验室江西南昌330047

本实验优化了橙色红曲菌AS3.4384原生质体制备及再生条件,将孢子接种在MPPY液体培养基中,30℃下,200r/min培养35h,以0.6mol/LMgSO4作为渗透压稳定剂,混合酶解液(0.3%裂解酶+4%纤维素酶+1%蜗牛酶)30℃,酶解3.5h,原生质体可达8×107个/ml... 详细信息

本实验优化了橙色红曲菌AS3.4384原生质体制备及再生条件,将孢子接种在MPPY液体培养基中,30℃下,200r/min培养35h,以0.6mol/LMgSO4作为渗透压稳定剂,混合酶解液(0.3%裂解酶+4%纤维素酶+1%蜗牛酶)30℃,酶解3.5h,原生质体可达8×107个/ml,再生率为18%。并建立了PEG8000介导的原生质体转化方法。

关键词：橙色红曲菌原生质体形成再生转化

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橙色红曲菌液体发酵产桔霉素特性的研究

食品科学 2004年第8期25卷 97-100页

作者：熊勇华谭文辉赖卫华许杨中德联合研究院食品科学教育部重点实验室(南昌大学) 江西南昌330047

本文测定了橙色红曲菌AS3.4384在酵母浸膏培养基中生长曲线以及碳源、氮源消耗量,并探讨了接种孢子量与桔霉素产生量的关系。

关键词：橙色红曲菌液体发酵桔霉素接种量孢子产量生长曲线

橙色红曲菌及其pksCT基因缺失株液态发酵产橘霉素及色素的变化

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食品科学 2013年第19期34卷 148-152页

作者：张淑云黄志兵许杨李燕萍南昌大学食品科学与技术国家重点实验室中德联合研究院江西南昌330047

以橙色红曲菌AS3.4384(原始菌株)及其pksCT基因缺失株(PHDS26)为发酵菌株,分别于酵母浸膏蔗糖(YES)、米粉、米粉无机盐培养基中进行液态发酵,采用高效液相色谱法(HPLC)和紫外分光光度法分别测定AS3.4384及PHDS26菌株于上述培养基中橘霉... 详细信息

以橙色红曲菌AS3.4384(原始菌株)及其pksCT基因缺失株(PHDS26)为发酵菌株,分别于酵母浸膏蔗糖(YES)、米粉、米粉无机盐培养基中进行液态发酵,采用高效液相色谱法(HPLC)和紫外分光光度法分别测定AS3.4384及PHDS26菌株于上述培养基中橘霉素和红曲色素的含量。结果表明:在酵母浸膏蔗糖(YES)、米粉、米粉无机盐培养基中,PHDS26橘霉素最高产量较橙色红曲菌AS3.4384橘霉素最高产量分别降低了97.24%、98.35%、39.18%。在米粉培养基中PHDS26红曲色素最高产量较橙色红曲菌AS3.4384红曲色素最高产量降低了71.0%,而在含无机盐的米粉培养基中PHDS26红曲色素最高产量较橙色红曲菌AS3.4384红曲色素最高产量却提高了60.2%。

关键词：橙色红曲菌 pksCT基因缺失菌株液态发酵橘霉素色素

橙色红曲菌乳清苷-5'-磷酸脱羧酶基因的克隆

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食品工业科技 2010年第11期31卷 172-174页

作者：王伯华许杨李燕萍南昌大学食品科学与技术国家重点实验室江西南昌330047 南昌大学中德联合研究院江西南昌330047

根据已报道的真菌乳清苷-5′-磷酸脱羧酶(pyrG)氨基酸序列,采用CODEHOP策略设计简并引物,从橙色红曲菌(Monascus aurantiacus)的基因组DNA中克隆得到pyrG基因片段。然后运用PCR法筛选橙色红曲菌Fosmid文库,获得了pyrG基因全长(GenBank... 详细信息

根据已报道的真菌乳清苷-5′-磷酸脱羧酶(pyrG)氨基酸序列,采用CODEHOP策略设计简并引物,从橙色红曲菌(Monascus aurantiacus)的基因组DNA中克隆得到pyrG基因片段。然后运用PCR法筛选橙色红曲菌Fosmid文库,获得了pyrG基因全长(GenBank登录号:GU723506)。经过blastx比较发现,橙色红曲菌pyrG基因与AspergillusflavusNRRL3357的氨基酸序列同源性最高,达到81%。该基因能够作为筛选标记应用于橙色红曲菌同源转化系统。

关键词：橙色红曲菌简并引物 pyrG基因基因克隆

橙色红曲菌AS3.4384产孢及原生质体制备和再生条件的优化

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橙色红曲菌AS3.4384产孢及原生质体制备和再生条件的优化

作者：谭文辉南昌大学

学位级别：硕士

红曲菌(Monascus)是一种典型的丝状真菌，早在一千年前的中国古籍中就有记载。红曲菌能产生多种具有重要生理活性的次级代谢产物，具有多重功效。但有研究发现，大部分红曲菌株在发酵过程中会产生一种对人畜有害的真菌毒素—桔霉素，仅... 详细信息

红曲菌(Monascus)是一种典型的丝状真菌，早在一千年前的中国古籍中就有记载。红曲菌能产生多种具有重要生理活性的次级代谢产物，具有多重功效。但有研究发现，大部分红曲菌株在发酵过程中会产生一种对人畜有害的真菌毒素—桔霉素，仅通过改变发酵条件以及传统的菌株筛选方法很难完全抑制桔霉素的产生。如若能从分子水平分析红曲菌产桔霉素的情况，利用基因工程手段构建不产桔霉素菌株，则可从根本上解决红曲菌生产过程中桔霉素产生的问题。原生质体是丝状真菌进行细胞融合和遗传转化的重要工具，是进行分子遗传研究的基础。因此，本论文研究了橙色红曲菌AS3.4384产孢条件及其原生质体形成、再生条件的优化，为进行橙色红曲菌基因敲除打下良好的基础。具体研究内容和结果如下： 1 优化了橙色红曲菌AS3.4384的产孢条件，结果表明，接种1.2mL橙色红曲菌AS3.4384种子培养物在6°Bé、pH7的MES琼脂固体培养基，28℃，光照培养25天，用含0.05％Tween 80的灭菌生理盐水洗脱孢子，得到了孢子悬液最高浓度为1.91x10个／mL。 2 优化了橙色红曲菌AS3.4384原生质体的制备条件，结果表明，将—20℃冻存的橙色红曲菌孢子液接种在MPPY液体培养基中，30℃，200rpm培养35h，用0.6mol／L MgSO配制1％蜗牛酶，0.3％裂解酶和4％纤维素酶的酶解液，将茵丝体放入pH调节为6的酶解液中，30℃恒温水浴，60rmp酶解3.5h，获得原生质体8.0x10个／mL。 3 优化了橙色红曲菌AS3.4384原生质体的再生条件，结果表明，将菌龄为40h的菌丝体酶解3h，获得的原生质体悬液浓度调节到5x10个／mL，取200μL涂布在双层再生培养基(上层为含有0.6mol／L蔗糖的MES培养基，底层为普通MES培养基)上，28℃黑暗培养4—5天，原生质体再生率为18％。

关键词：橙色红曲菌产孢原生质体制备再生

橙色红曲菌ctnG基因和ctnH基因缺失菌株的构建及其功能分析

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橙色红曲菌ctnG基因和ctnH基因缺失菌株的构建及其功能分析

作者：吴伟南昌大学

学位级别：硕士

红曲菌是我国传统的食品发酵用菌,可以产生多种生物活性物质,被应用于食品、保健品和医药工业等领域。但由于红曲菌会产生桔霉素,使红曲产品的安全性受到质疑。本文采用基因敲除技术,构建了ctnG基因红曲菌缺失菌株,为阐明桔霉素代谢途... 详细信息

红曲菌是我国传统的食品发酵用菌,可以产生多种生物活性物质,被应用于食品、保健品和医药工业等领域。但由于红曲菌会产生桔霉素,使红曲产品的安全性受到质疑。本文采用基因敲除技术,构建了ctnG基因红曲菌缺失菌株,为阐明桔霉素代谢途径提供理论依据。主要研究内容如下：1、通过生物信息学分析,推测ctnG基因编码β型碳酸酐酶,ctnH基因编码短链脱氢酶,并预测ctnG和ctnH基因可能参与桔霉素的PKS后修饰过程。2、成功构建了两端含目的基因同源臂序列、中间为潮霉素抗性基因的置换型打靶载体pCTNG-HPH和pCTNH-HPH。3、采用原生质体PEG介导转化将置换型打靶载体pCTNG-HPH和pCTNH-HPH分别转入红曲菌AS3.4384原生质体中,采用潮霉素抗性筛选、打点杂交初筛和Southern杂交验证,最终获得3株ctnG红曲菌缺失菌株,ctnH红曲菌缺失株正在验证中。4、采用HPLC法检测ctnG缺失菌株中桔霉素的产量,采用紫外分光光度法检测红曲色素的含量。发现3个缺失株桔霉素产量分别降低了50.3%、49.2%和50.8%,从而验证ctnG基因与桔霉素合成相关,预测ctnG基因参与桔霉素的PKS后修饰过程。

关键词：橙色红曲菌 AS3.4384 基因敲除 β型碳酸酐酶短链脱氢酶

橙色红曲菌AS3.4384泛素基因及其侧翼序列的分析

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橙色红曲菌AS3.4384泛素基因及其侧翼序列的分析

作者：王金昌南昌大学

学位级别：硕士

泛素(ubiquitin)广泛存在于真核生物中，含有76个极其保守的氨基酸残基。泛素基因有泛素融合基因和多聚泛素基因两种形式。在真菌中发现泛素基因与蛋白翻译后修饰、蛋白降解、基因转录、信号传导和次级代谢产物形成有关。红曲菌(Mo... 详细信息

泛素(ubiquitin)广泛存在于真核生物中，含有76个极其保守的氨基酸残基。泛素基因有泛素融合基因和多聚泛素基因两种形式。在真菌中发现泛素基因与蛋白翻译后修饰、蛋白降解、基因转录、信号传导和次级代谢产物形成有关。红曲菌(Monascus)是一种典型的丝状真菌，早在一千年前的中国古籍中就有记载。红曲菌能产生多种具有重要生理活性的次级代谢产物。但有研究发现，大部分红曲菌株在发酵过程中会产生一种对人畜有害的真菌毒素—桔霉素。如若能分析清楚红曲菌产桔霉素相关的基因，利用基因工程手段构建不产桔霉素菌株，则可从根本上解决红曲菌生产过程中桔霉素产生的问题。泛素基因可能与红曲菌产桔霉素有关。因此，本论文研究了橙色红曲菌AS3.4384泛素基因及其侧翼序列，具体研究内容和结果如下： 1 采用Southern杂交技术，用橙色红曲菌AS3.4384 cDNA消减文库Y中的泛素基因EST片段作为探针，与橙色红曲菌AS3.4384基因组DNA酶切片段进Southern杂交，割胶回收目的片段进行克隆、测序与分析。研究结果表明橙色红曲菌AS3.4384含有多聚泛素基因和泛素融合基因。 2 分析橙色红曲菌AS3.4384泛素基因的侧翼序列。用Blast x程序分析本实验中得到的含有泛素基因的U2、U3、U6三个克隆子，结果表明U2中的泛素基因下游是一个与细胞有丝分裂过程中纺锤体与染色体着丝点结合有关的检验点蛋白激酶基因;U3中的泛素基因下游是一个与细胞极性化生长有关的细胞极性蛋白基因;U6中的泛素基因下游是一个与DNA复制与修复有关的姐妹染色单体结合蛋白基因。 3 采用Sau3AI酶切橙色红曲菌AS3.4384基因组，回收2-4 Kb片段，利用pUC119作为载体，构建橙色红曲菌AS3.4384基因组文库，得到25000多个克隆子，筛选到含有泛素基因的阳性克隆子3个，为分析橙色红曲菌AS3.4384泛素基因及其它基因提供一个技术平台。

关键词：橙色红曲菌泛素基因基因组文库克隆