检索结果-南通市图书馆

作者：蔺茂强兰州大学

学位级别：硕士

背景:椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IVDD)是椎间盘(Intervertebral disc,IVD)源性腰痛的重要病因,是现今社会的常见病之一,影响着数百万人的生活质量。脊柱融合术是一种广泛使用的经典术式,被认为是治疗IVDD的临床金标... 详细信息

背景:椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IVDD)是椎间盘(Intervertebral disc,IVD)源性腰痛的重要病因,是现今社会的常见病之一,影响着数百万人的生活质量。脊柱融合术是一种广泛使用的经典术式,被认为是治疗IVDD的临床金标准,但该术式常出现假关节、融合器移位、椎体塌陷和骨不融合等并发症。目前,以椎间盘组织工程(Disc Tissue Engineering,DTE)为基础的复合仿生支架有望消除上述现象而用于IVDD的临床治疗。目的:制备具有光交联能力的甲基丙烯酰化丝胶蛋白(Sericin Methacrloyl,SerMA)氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)仿生支架,初步探讨负载骨形态发生蛋白-9(Bone morphogenetic protein-9,BMP-9)的SerMA/GO复合仿生支架在体外诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的能力。方法:第一部分:SerMA/GO仿生支架的制备及性能表征。(1)构建具备光交联特性的SerMA/GO仿生支架;(2)扫描电镜(Scanning electron microcopy,SEM)观察仿生支架的微观结构;(3)傅里叶红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy,FTIR)分析仿生支架的二级结构;(4)利用电子万能试验机测试仿生支架的机械性能;(5)称重法测定仿生支架的溶胀率;(6)称重法测试仿生支架在磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS)中的降解率:(7)大鼠BMSCs的复苏、传代和冻存;(8)细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和活死细胞荧光染色检测仿生支架的细胞毒性。第二部分:构建负载BMP-9的SerMA/GO复合仿生支架及其体外成骨性能研究。(1)构建负载BMP-9的SerMA/GO复合仿生支架;(2)酶联免疫吸附测定负载BMP-9的仿生支架中BMP-9的缓释情况;(3)Transwell细胞迁移实验测试负载不同含量BMP-9的复合仿生支架对BMSCs迁移的影响;(4)碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和茜素红S(Alizarin red S,ARS)染色比较负载不同含量BMP-9的复合仿生支架的体外成骨诱导性能;(5)细胞计数计算BMSCs接种复合仿生支架后的细胞早期黏附率;(6)CCK-8和活死细胞荧光染色检测复合仿生支架对BMSCs的增殖和活性的影响;(7)ALP染色和ARS染色检测BMSCs接种复合仿生支架后ALP和矿化基质的生成,实时定量反转录聚合酶链式反应(Quantitative real time-PCR,q RT-PCR)检测BMSCs接种复合仿生支架后成骨相关基因的表达,免疫荧光检测BMSCs接种复合仿生支架后成骨相关蛋白的表达。结果:(1)SerMA/GO仿生支架内部为孔状结构,GO的加入并未影响SerMA的二级结构,两者之间未形成化学结构。GO的引入增强了仿生支架的机械性能,且随着GO含量的增多,仿生支架的机械性能逐渐增强。相反的是,仿生支架的溶胀率和降解率随着GO含量的增加出现逐渐减低的表现。体外生物相容性研究结果显示,高浓度的GO会抑制BMSCs的增殖并影响其活性,而低浓度组与对照组无明显差异,显现出较好的体外细胞生物相容性。(2)在BMP-9的释放检测中,GO的加入减缓了BMP-9的突释并延长了释放时长。细胞迁移结果显示,含400ng/m L BMP-9的仿生支架组中细胞迁移数量最多。ALP和ARS染色结果显示,400ng/m L和800ng/m L的仿生支架中ALP和矿化基质表达量显著多于其余两组,但该两组间并无显著差异。(3)复合仿生支架的体外实验结果如下:BMSCs接种后的细胞早期黏附率在对照组与复合仿生支架组中均表现为随培养时间的延长逐渐增高的现象,且复合仿生支架组高于对照组。CCK-8和活死细胞荧光染色结果显示,复合仿生支架组中BMSCs增殖情况明显强于Control组,且两组间细胞活性无明显差异,提示复合仿生支架具有较好的体外生物形容性。ALP和ARS结果显示,ALP和矿化基质在复合仿生支架组中的表达情况显著高于SerMA/GO1组和对照组。q RT-PCR结果中,在第7天的早期成骨阶段,复合仿生支架组中ALP、Runt相关转换因子-2(Runt-related transcription factor-2,RUNX2)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)的表达量高于Control组,尤

关键词：丝胶蛋白氧化石墨烯骨形态发生蛋白-9 骨髓间充质干细胞椎间盘组织工程

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Sox-9基因修饰BMSCs复合骨支架材料构建组织工程椎间盘的实验研究

Sox-9基因修饰BMSCs复合骨支架材料构建组织工程椎间盘的实验研究

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作者：朱勇暨南大学

学位级别：硕士

目的:本研究利用异种骨制备的脱细胞脱钙骨组织工程复合多孔支架,将传代培养的Sox-9基因修饰后SD大鼠骨髓间充质干细胞种植于其中,并在Balb/c裸鼠皮下进行移植,检测细胞支架复合物的理化性能和生物相容性,探讨其成为组织工程椎间盘的可... 详细信息

目的:本研究利用异种骨制备的脱细胞脱钙骨组织工程复合多孔支架,将传代培养的Sox-9基因修饰后SD大鼠骨髓间充质干细胞种植于其中,并在Balb/c裸鼠皮下进行移植,检测细胞支架复合物的理化性能和生物相容性,探讨其成为组织工程椎间盘的可行性,为椎间盘组织工程的研究提供实验依据。方法:(1)复苏Sox-9基因修饰的SD大鼠骨髓间充质干细胞,采用常规办法对其进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态。同时将已经制作成型的骨支架消毒,放入无菌的24孔板中,将已经进行过脱壁处理的基因修饰骨髓间充质干细胞接种于支架上,体外培养48小时,倒置显微镜、扫描电镜、组织学染色观察细胞在支架上的粘附情况。(2)细胞支架复合物体外培养2天后,分实验侧和对照侧将其植入Balb/c裸鼠背部皮下。体内培养2月后,肉眼观察裸鼠背部植入部位情况;处死裸鼠,取出细胞支架复合物,行冰冻切片,扫描电镜、组织学染色观察细胞在支架上的生长情况,行II型胶原免疫组化染色,qRT-PCR技术检测支架中骨髓间充质干细胞的Sox-9基因、II型胶原表达水平。结果:(1)镜下Sox-9基因修饰SD大鼠骨髓间充质干细胞呈长梭形,在第3代开始出现衰老的形态表现;细胞接种支架后,倒置相差显微镜下、扫描电镜、HE染色观察骨髓间充质干细胞在支架上粘附良好。(2)细胞支架复合物体内培养2月后,肉眼观察在裸鼠皮下植入部位周围无感染及炎症反应,细胞支架复合物呈楔形,与皮肤内面愈合,II型胶原免疫组化染色阳性,qRT-PCR检测实验侧支架复合物中骨髓间充质干细胞的Sox-9基因、II型胶原表达水平比对照侧高。P0.05,有统计学意义。结论:(1)使用静态接种技术构建骨支架材料与基因转染BMSCs的复合体,可以实现细胞黏附于骨支架并在骨支架内增殖;(2)体外构建的细胞支架复合物在裸鼠皮下培养的方法得到的产物,经检测证实细胞仍能够稳定表达Sox-9目的基因和II型胶原,支架材料仍大部分存在,产物较体外培养更接近类软骨组织。

关键词：基因修饰间充质干细胞 Sox-9基因骨支架椎间盘组织工程

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三维共培养对髓核细胞与骨髓间充质干细胞增殖的影响

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江苏医药 2011年第24期37卷 2881-2884,I0001页

作者：朱磊吴小涛王运涛东南大学附属中大医院骨科南京市210009

目的建立椎间盘髓核细胞(NPCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架三维共培养系统。方法分别培养乳兔NPCs和BMSCs至原代融合和第3代,将两种细胞按2∶1(BMSCs∶NPCs)比例混匀,以6×106/ml的终浓度分别接种于培... 详细信息

目的建立椎间盘髓核细胞(NPCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架三维共培养系统。方法分别培养乳兔NPCs和BMSCs至原代融合和第3代,将两种细胞按2∶1(BMSCs∶NPCs)比例混匀,以6×106/ml的终浓度分别接种于培养板作为平面共培养组(A组)和PLGA支架(直径10mm,厚3mm)作为三维共培养组(B组);每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液100μl,体外培养2周,利用倒置显微镜、扫描电镜进行细胞形态学观察;MTT法测定各组细胞增殖情况。结果细胞与材料支架黏附良好。经过2周的培养,A组和B组细胞均能够增殖;与A组相比,B组细胞增殖率增高(P<0.01)。结论共培养的NPCs和BMSCs均能够与PLGA支架很好地黏附并增殖;PLGA支架三维共培养NPCs和BMSCs较平面共培养更能促进细胞增殖。

关键词：椎间盘组织工程髓核细胞骨髓间充质干细胞聚乳酸-乙醇酸共聚物支架

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KLD-12多肽/rhBMP-2纳米纤维凝胶诱导BMSCs成骨活性的实验研究

KLD-12多肽/rhBMP-2纳米纤维凝胶诱导BMSCs成骨活性的实验研究

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作者：吴彬石河子大学

学位级别：硕士

目的:利用KLD-12多肽缓释的特性,复合合适剂量的重组人骨形态发生蛋白-2(Recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2),构建具有生物活性的组织工程支架材料KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶复合骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨该纳... 详细信息

目的:利用KLD-12多肽缓释的特性,复合合适剂量的重组人骨形态发生蛋白-2(Recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2),构建具有生物活性的组织工程支架材料KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶复合骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨该纳米纤维凝胶材料诱导BMSCs成骨活性的实验研究。方法:取3月龄(雌雄不限)新西兰大白兔骨髓,采用密度梯度法分离并培养BMSCs。取第3代BMSCs分别采用适合浓度的rhBMP-2∕KLD-12多肽体外三维培养(实验组)和KLD-12多肽培养(对照组),诱导BMSCs成骨。培养2、5、7、10、14d细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8)法检测检测两组凝胶内细胞增殖活性;培养7、14d钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(PI)荧光染色观察实验组与对照组凝胶内活细胞与死细胞数量,计算活细胞比率;3、7、10、14、21 d检测两组细胞培养基中碱性磷酸酶(ALP)及骨钙蛋白(Osteocalcin,OCN)含量;培养14 d两组细胞行Ⅰ型胶原免疫荧光染色观察,实时荧光定量PCR(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)检测Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)和骨钙蛋白基因相对表达量。结果:(1)倒置显微镜下观察,培养第7d两组凝胶内的BMSCs呈圆形生长,分布均匀,部分细胞增殖,凝胶边缘BMSCs呈梭形生长,培养第14d凝胶内BMSCs细胞增殖更加明显;(2)CCK-8结果显示:随着培养时间的延长实验组与对照组细胞增殖活性不断增强,第5d实验组与对照组分别为0.631±0.073、0.542±0.061,两组差异有统计学意义(P0.05);(4)ALP检测结果显示:培养至第7d两组ALP表达量比较,分别为4.05±0.245、3.739±0.113,两组差异有统计学意义(P<0.05),7d1d实验组ALP表达量均明显高于对照组(P<0.05);(5)OC检测结果显示:培养至第10d起两组OC含量比较,分别为2.764±0.149、2.425±0.167差异有统计学意义(P<0.05),101d实验组OC含量均明显高于对照组(P<0.05);(6)培养14d,激光共聚焦显微镜下观察显示:实验组CollagenⅠ免疫荧光染色呈阳性,荧光强度较对照组强。(7)qRT-PCR结果证实,实时荧光定量PCR检测实验组与对照组相比较Ⅰ型胶原相对表达量分别为3.124±0.230、1.001±0.024;骨钙蛋白基因相对表达量分别为2.259±0.167、1.001±0.0167,各比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:BMSCs在KLD-12多肽/rhBMP-2内正常生长并快速增殖,KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶诱导BMSCs向成骨细胞分化的生物活性良好。

关键词： KLD-12多肽重组人骨形态发生蛋白-2 骨髓间充质干细胞成骨活性兔椎间盘组织工程

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KLD-12多肽/TGF-β1诱导MSCs向髓核样细胞分化的实验研究

KLD-12多肽/TGF-β1诱导MSCs向髓核样细胞分化的实验研究

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作者：卞正君石河子大学

学位级别：硕士

目的:利用KLD-12多肽药物缓释的特性,复合转化生长因子-β1(TGF-β1),筛选合适的复合浓度与比例,构建椎间盘组织工程支架材料KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶,探讨KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向髓核样细... 详细信息

目的:利用KLD-12多肽药物缓释的特性,复合转化生长因子-β1(TGF-β1),筛选合适的复合浓度与比例,构建椎间盘组织工程支架材料KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶,探讨KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向髓核样细胞分化的生物活性。方法:采用不同浓度的TGF-β1与KLD-12多肽复合,Elisa法检测TGF-β1的缓释量。密度梯度离心法分离MSCs,分别采用KLD-12多肽?TGF-β1纳米纤维凝胶三维培养(实验组)和KLD-12多肽培养(对照组),诱导MSCs向髓核样细胞特性方向分化。利用阿尔新蓝法(Alcian blue)、实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、免疫组化染色等方法测定其向髓核样细胞特性方向分化过程中特异性细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、葡糖胺聚糖(Glycosalninoglycan,GAG)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)表达的情况。结果:(1)倒置显微镜下观察,体外培养的MSCs贴壁生长,呈长梭形。(2)Elisa结果显示,KLD-12多肽/TGF-β1凝胶可缓释出TGF-β1,并呈现先快后慢的趋势。随着时间的延长,凝胶释放的TGF-β1含量逐渐减少。(3)细胞增殖实验结果表明,实验组与对照组细胞数随着培养时间的延长而增加,且实验组增殖速度要高于对照组。(4)Calcein-AM/PI荧光染色显示,凝胶内细胞生长良好,大量活细胞存在,维持圆形的细胞形态,凝胶边缘细胞呈梭形及纺锤形,部分细胞出现增殖。(5)细胞存活率显示,第14d,实验组存活率为89.14±2.468%,对照组存活率为87.53±4.201%,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。(6)GAG检测结果显示,实验组与对照组细胞液中GAG含量都随着时间的增加而呈非直线型增加。第4、7d实验组GAG含量表达要高于对照组(P组织化学染色阳性,表达量较对照组高。结论:KLD-12多肽?TGF-β1纳米纤维凝胶诱导的MSCs可向髓核样细胞分化,髓核样细胞特异性细胞外基质GAG、CollagenⅡ和Aggrecan表达明显增高,为进一步研究应用KLD-12多肽?TGF-β1/MSCs移植治疗椎间盘退行性变奠定了基础。

关键词： KLD-12多肽转化生长因子-β1 间充质干细胞髓核样细胞椎间盘组织工程

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KLD-12多肽/rhBMP-2纤维凝胶植入诱导椎体间融合的实验研究

KLD-12多肽/rhBMP-2纤维凝胶植入诱导椎体间融合的实验研究

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作者：李相晨石河子大学

学位级别：硕士

目的:探讨具有生物活性的组织工程支架材料KLD-2多肽/rhBMP-2凝胶诱导椎体间融合的效果,为治疗腰椎不稳定寻找新方案。方法:试验分组:新西兰白兔24只,4-6周龄,体重2.0-2.5kg,雌雄不限,随机分为A、B、C三组,每组8只。A组为试验组:KLD-12... 详细信息

目的:探讨具有生物活性的组织工程支架材料KLD-2多肽/rhBMP-2凝胶诱导椎体间融合的效果,为治疗腰椎不稳定寻找新方案。方法:试验分组:新西兰白兔24只,4-6周龄,体重2.0-2.5kg,雌雄不限,随机分为A、B、C三组,每组8只。A组为试验组:KLD-12多肽/rh BMP-2组;B组为rh BMP-2组(阳性对照组);C组为KLD-12多肽组(阴性对照组)。纤维环穿刺髓核抽吸、刮除法构建腰椎不稳定模型,将KLD-12多肽/rh BMP-2、rh BMP-2、KLD-12多肽各100μl分别注射植入椎间盘,移植术后2周、4周、8周、12周行X线及Micro-CT检查,观察是否成骨,计算骨小梁数量、密度、分离度、骨体积分数;收集兔椎间盘标本行大体观察、HE染色。结果:(1)X线检查:A、B两组:有成骨迹象,各时间点骨质呈增多趋势;B组椎体边缘有更多不规则成骨;C组:椎体有退变表现,椎体间无明显成骨。(2)CT结果:术后4周,A组骨小梁数量(1/mm)0.453±0.062、骨小梁厚度(mm)0.068±0.018、骨小梁分离度(mm)0.143±0.018、骨体积分数(%)2.274±0.117;B组骨小梁数量(1/mm)0.534±0.031、骨小梁厚度(mm)0.078±0.009、骨小梁分离度(mm)0.112±0.017、骨体积分数(%)3.231±0.127。术后12周,A组骨小梁数量(1/mm)0.712±0.047、骨小梁厚度(mm)0.104±0.022、骨小梁分离度(mm)0.084±0.011、骨体积分数(%)4.274±0.134;B组骨小梁数量(1/mm)0.616±0.032、骨小梁厚度(mm)0.092±0.013、骨小梁分离度(mm)0.097±0.012、骨体积分数(%)3.841±0.131。(3)肉眼大体观察,A组椎间隙无明显狭窄,椎体间周围有少量突出骨质形成;B组椎间隙无明显狭窄,椎体间周围有较多骨质形成;C组椎间隙明显狭窄,椎体间周围无骨质形成,有明显退变。(4)HE染色:400X,A组术后8周可见纤维环内细胞向骨细胞分化;B组术后8周可见成熟编织骨;C组术后8周可见成纤维细胞呈梭形排列。结论:KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶可诱导椎体间融合并减少大量异位成骨。

关键词： KLD-12多肽人骨形态发生蛋白-2 椎间盘组织工程椎体间融合

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负载双重药物缓释微球的水凝胶通过调节巨噬细胞极化治疗椎间盘退变

负载双重药物缓释微球的水凝胶通过调节巨噬细胞极化治疗椎间盘退...

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作者：程浩哲华中科技大学

学位级别：硕士

目的:椎间盘退变(Intervertebral Disc Degeneration,IVD)与免疫和炎症反应密切相关。本研究制备并优化了一种OPF/SMA水凝胶,通过负载用微流控技术制备的不同规格的IL-4-PLGA微球与KGN-PLGA微球,以达到对药物的程序性释放作用。IL-4早... 详细信息

目的:椎间盘退变(Intervertebral Disc Degeneration,IVD)与免疫和炎症反应密切相关。本研究制备并优化了一种OPF/SMA水凝胶,通过负载用微流控技术制备的不同规格的IL-4-PLGA微球与KGN-PLGA微球,以达到对药物的程序性释放作用。IL-4早期诱导巨噬细胞向抗炎型M2极化,提高抗炎细胞因子的水平,KGN慢速释放对髓核细胞进行长期的抗炎修复,以实现对退变椎间盘组织的早期免疫调控与长期抗炎作用。这项研究可能为未来椎间盘退变的微创免疫联合治疗提供新的策略。方法:本研究通过调节低聚乙烯延胡索酸酯(OPF)接枝甲基丙烯酸钠(SMA)的浓度,采用扫描电子显微镜检测、傅里叶红外光谱检测、机械性能检测、孔径分析以及溶胀率的检测,对改性后的OPF/SMA水凝胶进行表征。通过微流控技术制备两种粒径均一的PLGA微球,分别包埋IL-4以及Kartogenin(KGN)。扫描电子显微镜检测并进行粒径分析。采用elisa试剂盒和紫外分光光度计检测PLGA微球的包封率和药物缓释效应。对包埋PLGA微球的OPF/SMA进行粘弹性性能测试。采用CCK-8试剂盒和大鼠髓核细胞3D培养筛选出生物相容性最佳的OPF/SMA水凝胶。在体外通过流式细胞技术、免疫荧光、q PCR检测IL-4-PLGA微球对小鼠巨噬细胞raw264.7极化的调节作用。TNF-α诱导髓核细胞炎症模型,通过western blot、q PCR检测aggrecan、collagen II与MMP13的表达水平,验证共培养体系中水凝胶对退变髓核细胞的抗炎效应。建立针刺SD大鼠尾椎椎间盘退变模型,治疗2周后通过elisa试剂盒检测椎间盘组织中巨噬细胞以及相关细胞因子的水平。在治疗4周、8周后,通过影像学检查如X-ray、micro-CT、MRI计算椎间高度变化(DHI)并对椎间盘退变以及再生情况进行Pfirrman分级评分。进一步通过组织免疫荧光与免疫组织化学检测,评估治疗后各组大鼠尾椎椎间盘的退变情况与治疗效果。结果:OPF/SMA水凝胶有着良好的机械性能以及细胞相容性,负载IL-4-PLGA与KGN-PLGA双微球后具有良好的药物缓释性能。体外实验表明,脂多糖(LPS)可诱导炎症反应使巨噬细胞趋向M1型极化,负载PLGA微球的OPF/SMA水凝胶早期快速释放IL-4使巨噬细胞趋向M2型极化,使抗炎细胞因子水平升高,并能长期释放KGN达到长效的抗炎效应,使髓核细胞的细胞外基质含量增加。体内实验表明,原位注射负载PLGA双微球的OPF/SMA水凝胶并原位光交联成胶,可以通过调控巨噬细胞的极化以及联合抗炎作用有效地改善椎间盘退变,缓解大鼠尾椎间盘退变。结论:负载有IL-4-PLGA和KGN-PLGA双微球的OPF/SMA水凝胶不仅可以在早期快速释放IL-4实现巨噬细胞向抗炎型M2极化,实现早期免疫调节,降低材料的免疫原性,建立良好的免疫微环境,还可以通过慢速释放KGN实现长期抗炎的联合治疗作用,有效改善椎间盘内的免疫微环境与炎症环境,为椎间盘退变的联合免疫治疗提供了一种有潜力的策略。

关键词：椎间盘退变椎间盘组织工程药物缓释免疫调控水凝胶

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