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植物免疫反应研究进展概述

中国林业产业 2017年第1期 170-171页

作者：陈俊达北京161中学

植物为抵御外界病原微生物侵袭产生的保护机制被称为植物免疫反应。这一反应主要分为两种途径。一种是病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI),一种是病原效应因子触发的免疫反应(ETI)。前者是植物识别微生物的早期免疫反应,后者是植物产... 详细信息

植物为抵御外界病原微生物侵袭产生的保护机制被称为植物免疫反应。这一反应主要分为两种途径。一种是病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI),一种是病原效应因子触发的免疫反应(ETI)。前者是植物识别微生物的早期免疫反应,后者是植物产生特异性的抗性(R)蛋白识别病原效应因子的免疫反应。同时,小RNA也在这两种途径中起到了调控免疫强弱的作用。深入研究植物免疫反应机制将有助于改良植物抗性,对作物增产有重要意义。

关键词：植物免疫反应早期免疫反应效应因子抗病蛋白

核盘菌木聚糖酶SsXyl2激发植物免疫反应研究

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核盘菌木聚糖酶SsXyl2激发植物免疫反应研究

作者：王娅波西南大学

学位级别：硕士

核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一种重要的植物病原真菌,可侵染油菜、大豆、向日葵和众多蔬菜,严重影响了这些作物的产量和品质。植物和病原菌在长期的进化过程中,形成两层防御系统,第一层是由病原相关分子模式PAMP(P... 详细信息

核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一种重要的植物病原真菌,可侵染油菜、大豆、向日葵和众多蔬菜,严重影响了这些作物的产量和品质。植物和病原菌在长期的进化过程中,形成两层防御系统,第一层是由病原相关分子模式PAMP(Pathogen associated molecular immunity)激发的PTI(PAMP-triggeredimmunty)免疫反应,第二层是病原物分泌的效应子激发的ETI(effector-triggered immunty)免疫反应。本研究前期通过农杆菌介导的瞬时表达技术,发现核盘菌SsXyl2可引起本氏烟叶片的坏死,推测其能激发植物免疫反应。为揭示该蛋白激发植物免疫反应的相关特性和作用机理,以及在核盘菌致病过程中的功能,本研究对核盘菌SsXyl2蛋白进行了深入的研究。生物信息学分析发现SsXyl2编码区共846bp,编码281个氨基酸,保守结构域分析表明SsXyl2含有两个保守结构域,分别是N端的糖基水解酶第11家族(Glycoside Hydrolase,GH11)和C端的纤维素结合域(Cellulose-binding domain,CBD)。氨基酸序列的多重比对分析发现,SsXyl2与Bc Xyn11A、Tr XYN2和SsXyl1蛋白中的编码木聚糖酶的氨基酸序列的相似性较高,分别是63.9%、60.1%和42.9%,系统进化树显示SsXyl2与灰葡萄孢菌中的Bc Xyn11A聚为一个小的分支,说明二者的亲缘关系较近。利用定点突变技术将SsXyl2的116位谷氨酸(E)突变为谷氨酰胺(Q)获得SsXyl2突变体,通过DNS法测定其木聚糖酶的活性,结果显示与SsXyl2相比,该突变体的木聚糖酶活性几乎全丧失,通过在本氏烟中瞬时表达SsXyl2和SsXyl2突变体,结果显示二者均可诱导植物细胞死亡,表明SsXyl2诱导植物细胞死亡的活性与木聚糖酶的活性无关。Signal P 5.0预测分析显示SsXyl2蛋白的N端有一个典型的信号肽结构,酵母信号陷阱试验显示携带信号肽序列的重组载体p SUC2-SsXyl2sp的酵母菌株可在YPRRA培养基上生长,而携带p SUC2和YTK12的酵母菌株均不能生长,表明SsXyl2蛋白的信号肽具有分泌功能。PR1 SP-SsXyl2突变体可诱导植物细胞死亡,而SsXyl2突变体却不能,表明SsXyl2蛋白在质外体具有诱导细胞坏死的活性。进一步研究发现,来自GH11结构域中的124-219aa足以诱导植物细胞死亡。此外,DAB染色显示SsXyl2处理的本氏烟叶片含有大量金黄色沉淀,表明SsXyl2蛋白可诱导活性氧的积累。本研究通过免疫共沉淀和蛋白质的LC-MS/MS分析获得了可能与SsXyl2互作的本氏烟蛋白库,利用酵母双杂交和荧光双分子互补技术筛选了SsXyl2的互作蛋白,结果显示SsXyl2与本氏烟中的Nb HIR1蛋白互作。利用VIGS技术对Nb HIR1基因进行了沉默,结果显示与对照组TRV:GFP相比,处理组TRV:Nb HIR1接种核盘菌后病斑显著下降,表明Nb HIR1基因的沉默不利于核盘菌的入侵。本研究通过实时荧光RT-q PCR分析了SsXyl2基因的表达模式,发现该基因在致病后期的表达量显著升高,表明该基因的表达受寄主植物的诱导。此外,本研究构建了SsXyl2的敲除载体和互补载体,并通过PEG介导的原生质体转化法成功获得了SsXyl2的敲除转化子KO12和互补转化子KOC1,在离体油菜叶片和活体拟南芥叶片上测定各转化子的致病力,结果显示KO12的致病力显著降低,而KOC1的致病力则恢复至野生型水平,表明SsXyl2参与了核盘菌的致病过程。

关键词：核盘菌木聚糖酶植物免疫反应致病力

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RNase P的功能研究进展

分子植物育种 2023年

作者：胡彩林李志宇潘素君罗茜李魏湖南省临湘市云湖街道农业综合服务中心湖南农业大学植物保护学院

核糖核酸酶P (ribonuclease P， RNase P)最初被鉴定为核糖核酸内切酶，用于切割前体tRNA的5’末端以产生成熟的tRNA。本研究主要对RNase P的生理功能进行了综述：RNase P可通过改变叶绿体基因的表达调控叶绿体和线粒体形态及叶肉细胞... 详细信息

核糖核酸酶P (ribonuclease P， RNase P)最初被鉴定为核糖核酸内切酶，用于切割前体tRNA的5’末端以产生成熟的tRNA。本研究主要对RNase P的生理功能进行了综述：RNase P可通过改变叶绿体基因的表达调控叶绿体和线粒体形态及叶肉细胞的分化；RNase P调控动物与植物的有性生殖与发育；RNase P的脯氨酰寡肽酶(prolyl oligopeptidase， Pop)蛋白亚基稳定端粒酶；RNase P可通过调控组蛋白变体H3.3来调节染色质的结构和功能，且RNase P可靶向降解mRNA；此外，RNase P通过调控防御反应基因的表达及活性氧的积累促进植物免疫反应。通过本研究综述，旨在为RNase P功能及作用机制的更深入研究提供参考。

关键词：核糖核酸酶P (RNase P) tRNA 叶绿体靶向降解植物免疫反应

玉米根际短体线虫的种类鉴定及咖啡短体线虫两个基因的功能研究

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玉米根际短体线虫的种类鉴定及咖啡短体线虫两个基因的功能研究

作者：胡瑶君河南农业大学

学位级别：硕士

短体属线虫(Pratylenchus Filipjev,1936)又称根腐线虫,是一类迁移性植物内寄生线虫,寄主十分广泛,它同孢囊线虫(Heterodera spp.)和根结线虫(Meloidogyne spp.)是作物上危害最严重的三大病原线虫,其体型微小,侵染植物根部,具有一定的... 详细信息

短体属线虫(Pratylenchus Filipjev,1936)又称根腐线虫,是一类迁移性植物内寄生线虫,寄主十分广泛,它同孢囊线虫(Heterodera spp.)和根结线虫(Meloidogyne spp.)是作物上危害最严重的三大病原线虫,其体型微小,侵染植物根部,具有一定的隐蔽性,这些特点导致它在农业生产中造成的危害常常被人们忽视。短体属中的咖啡短体线虫(P.coffeae)可危害玉米、大豆、烟草等多种粮食和经济作物,对我国作物安全生产构成巨大威胁。目前,咖啡短体线虫广泛分布于全球各地,防治已成为一个世界性难题。鉴别并研究咖啡短体线虫的致病相关基因及其功能是筛选安全有效防治靶标的最新突破点。为明确黄淮地区玉米种植区短体线虫的种类及其分布情况,笔者对黄淮(河南、山东、江苏和安徽)4省18个地市玉米田采集的274份根际土壤样品中的短体线虫进行了分离鉴定,发现短体线虫的分离率达62.8%,咖啡短体线虫是黄淮地区玉米根腐线虫的优势种。为进一步了解咖啡短体线虫侵染致病的机制,本研究通过多种分子生物学技术,研究了该线虫食道腺特异表达的组织蛋白酶B和L基因(Pc-CB和Pc-CL)的功能。利用q PCR技术检测了靶基因在咖啡短体线虫不同虫态中的表达特性,通过in vitro RNAi诱导靶基因沉默来探究其在线虫侵染致病等过程中的功能;利用根癌农杆菌介导等方法明确了靶蛋白Pc-CB和Pc-CL在植物中的亚细胞定位及其参与调控寄主防御反应的分子机制。具体研究结果如下:1、线虫的分离、鉴定与纯化采用改良的贝尔曼漏斗法对黄淮4省18个地市采集的274份玉米根际土壤样品中的短体线虫进行了分离,并通过形态学和分子生物学相结合的方法对其种类进行了鉴定。鉴定结果表明,274份样品中有172个样品分离到短体线虫,分离率为62.8%,共分离到咖啡短体线虫、斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)、玉米短体线虫(P.zeae)、落选短体线虫(P.neglectus)和桑尼短体线虫(P.thornei)5个种。在172个短体线虫样品中,咖啡短体线虫分离率达39.5%,斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)分离率达32.6%,玉米短体线虫、落选短体线虫和桑尼短体线虫分离率分别为12.8%、5.8%和9.3%,咖啡短体线虫是黄淮地区玉米根腐线虫的优势种。室内纯化培养后,获得了26个纯化种群。研究发现,18个地市均分离到咖啡短体线虫和斯克里布纳短体线虫,其中江苏省徐州市和山东省济南市存在这两种线虫复合侵染的现象。首次在河南和江苏省的玉米根际发现玉米短体线虫的侵染危害,该线虫是河南和江苏省的新纪录种。首次在江苏和安徽省发现咖啡短体线虫侵染危害玉米,首次在安徽省发现斯克里布纳短体线虫和落选短体线虫侵染危害玉米,首次在山东省发现桑尼短体线虫侵染危害玉米。2、咖啡短体线虫Pc-CB和Pc-CL基因的序列分析本课题组通过高通量测序获得咖啡短体线虫的全长转录组数据,通过PCR扩增获得了Pc-CB基因3370 bp的全长序列,ORF长度为1116 bp,编码337个aa,DNA编码区包含6个内含子,蛋白质理论分子量(MW)为41.68 k Da,等电位点p I为4.50。Pc-CL基因全长为2013 bp,ORF长度为1269 bp,编码422个aa,DNA编码区包含12个内含子,蛋白质理论分子量(MW)为48.30 k Da,等电位点p I为4.50。通过实时荧光定量PCR检测Pc-CB和Pc-CL在咖啡短体线虫4种虫态(雌虫、雄虫、幼虫和卵)的转录差异水平,发现Pc-CB和Pc-CL在咖啡短体线虫4种虫态中都有表达,且均在雌虫中表达量最高,雄虫中表达量最低。以线虫c DNA为模板,体外合成含地高辛标记的Pc-CB和Pc-CL正反义链m RNA探针,通过原位杂交技术,明确了Pc-CB和Pc-CL均在咖啡短体线虫食道腺细胞中特异性表达。4、Pc-CB和Pc-CL基因在咖啡短体线虫侵染、致病等过程中的功能研究利用in vitro RNAi沉默靶基因,在一定时间范围内,目的基因沉默效率随着其ds RNA浸泡时间的延长而不断增加,浸泡36 h时,Pc-CB和Pc-CL在咖啡短体线虫中表达量均最低。相对外源基因e GFP沉默36 h,Pc-CB表达量下降了63.6%,Pc-CL表达量下降了64.3%。经Pc-CB和Pc-CL ds RNA处理36 h的咖啡短体线虫,其在胡萝卜愈伤组织上的繁殖率与清水对照组相比分别下降了47.7%和51.4%,差异显著(P<0.05)。将不同处理组的咖啡短体线虫分别接种于长势一致的玉米幼苗根系,60 d后的结果表明:Pc-CB和Pc-CL RNAi 36h组咖啡短体线虫对寄主玉米的侵染力和致病力均显著下降(P<0.05)。将不同处理组咖啡短体线虫接种于玉米幼苗根系72 h,品红染色结果显示,Pc-CB和Pc-CL RNAi 36 h处

关键词：玉米短体线虫种类鉴定组织蛋白酶 RNAi 植物免疫反应

本氏烟NbHIR2调控核盘菌木聚糖酶SsXyl2诱导寄主细胞死亡的分子机制研究

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本氏烟NbHIR2调控核盘菌木聚糖酶SsXyl2诱导寄主细胞死亡的分子机...

作者：王培西南大学

学位级别：硕士

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种全世界分布的重要植物真菌,其可以侵染数百种植物,引起包括油菜、大豆、向日葵和多种蔬菜的菌核病。到目前为止,高抗菌核病的作物种质资源仍匮乏,菌核病的控制主要依赖于化学杀菌剂,但在世界范... 详细信息

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种全世界分布的重要植物真菌,其可以侵染数百种植物,引起包括油菜、大豆、向日葵和多种蔬菜的菌核病。到目前为止,高抗菌核病的作物种质资源仍匮乏,菌核病的控制主要依赖于化学杀菌剂,但在世界范围内经常发现抗杀菌剂核盘菌菌株。深入揭示核盘菌与寄主互作的分子机制将为开发绿色可持续的作物菌核病防控策略提供重要线索。本实验室前期证实糖苷水解酶蛋白SsXyl2与核盘菌致病性密切相关,其靶向寄主植物的质外体诱导细胞死亡,而不依赖于其木聚糖酶活性。本氏烟过敏诱导反应蛋白NbHIR2能与SsXyl2直接相互作用,但关于其互作机制及其对核盘菌侵染的影响尚不清楚。多重序列比对分析显示,NbHIR2与辣椒CaHIR1最为相似,相似度达91.58%。蛋白结构预测显示,NbHIR2含有典型的SPFH结构域,在该结构域内部含有假定的跨膜基序。通过构建NbHIR2与GFP融合蛋白并在本氏烟中进行瞬时表达发现NbHIR2定位于质膜。利用RT-q PCR技术检测NbHIR2基因在不同组织中的表达情况发现NbHIR2在叶中表达量最高。NbHIR2在核盘菌侵染时显示出高水平的表达量,且48 hpi达到最大表达水平。利用农杆菌介导的瞬时表达技术发现在本氏烟中过表达NbHIR2不能诱导细胞坏死,DAB染色显示其能诱导寄主组织HO积累。沉默NbHIR2导致SA信号通路相关基因NPR1、PR1、PR2的表达量显著下调,瞬时表达NbHIR2造成PR1、PR2表达水平显著上调,表明NbHIR2参与植物免疫反应。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除本氏烟NbHIR2基因,共得到了6种不同突变类型的基因敲除植株。接种核盘菌菌株发现NbHIR2基因敲除突变体对核盘菌抗性增强,表明NbHIR2作为一个负调控因子调控本氏烟对核盘菌的抗性。在NbHIR2基因敲除突变体叶片中瞬时表达SsXyl2,其诱导的细胞死亡减弱。进一步将SsXyl2与NbHIR2共表达,发现SsXyl2诱导的细胞死亡程度与表达NbHIR2的农杆菌浓度成正比,表明NbHIR2增强了SsXyl2诱导的细胞死亡。通过在本氏烟叶片中共表达NbHIR2GFP与SsXyl2m Cherry发现NbHIR2与SsXyl2共定位于细胞膜。在NbHIR2基因敲除突变体和野生型本氏烟中瞬时表达SsXyl2GFP,SsXyl2主要富集在野生型本氏烟的细胞膜中,而在NbHIR2基因敲除突变体中主要富集在细胞质。利用蛋白免疫印迹检测SsXyl2蛋白的表达量,结果显示SsXyl2主要在野生型本氏烟叶片的细胞膜中被检测到,而突变体的SsXyl2主要存在于细胞质中,表明NbHIR2促进SsXyl2在细胞膜上的定位。综上所述,本研究发现本氏烟细胞膜蛋白NbHIR2参与了植物免疫反应,其负调控本氏烟对核盘菌的抗性,证实其作用机制与帮助核盘菌木聚糖酶SsXyl2在细胞膜上的聚集,进而促进该蛋白诱导的细胞死亡相关,研究结果为探究HIR蛋白在植物与死体营养型病原菌互作过程中的功能奠定了基础。

关键词：植物免疫反应过敏诱导反应蛋白核盘菌木聚糖酶

苹果黑腐皮壳Nep1-like蛋白的鉴定及功能研究

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苹果黑腐皮壳Nep1-like蛋白的鉴定及功能研究

作者：刘建英西北农林科技大学

学位级别：硕士

由苹果黑腐皮壳Valsa mali(Vm)引起的腐烂病(Apple Valsa canker)造成苹果树皮溃烂坏死、树势衰弱、果品下降,严重时导致树死园毁,是苹果生产中最具毁灭性的病害。近几十年来,尽管国内外在该病原生物学研究中取得了一系列进展,然而对于... 详细信息

由苹果黑腐皮壳Valsa mali(Vm)引起的腐烂病(Apple Valsa canker)造成苹果树皮溃烂坏死、树势衰弱、果品下降,严重时导致树死园毁,是苹果生产中最具毁灭性的病害。近几十年来,尽管国内外在该病原生物学研究中取得了一系列进展,然而对于其关键致病因子仍缺乏深入认识。鉴于该病菌能够引起树皮腐烂坏死,推测毒素及毒素蛋白在其侵染过程中发挥关键作用。目前为止,国内外已从Vm中陆续分离、鉴定到一些小分子毒素物质,但尚无任何致病相关毒素蛋白的报道。Nep1(Necrosis and ethylene-inducing peptide 1)-Like Protein(NLP)是广泛存在于细菌、真菌和卵菌中的一类毒素蛋白,其能够诱导双子叶植物细胞坏死,是多种植物病原菌中的重要致病因子。为此,本研究对Vm的NLP蛋白进行了分析、鉴定,并对其生物学功能进行研究。获得的主要结果如下:(1)Vm编码两个NLP蛋白(Vm NLP1和Vm NLP2),其中Vm NLP2能够诱导植物细胞坏死本研究以最早发现于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)中的Fo Nep1为基本序列,利用BLAST＿P从Vm基因组中鉴定到两个NLP蛋白,分别命名为Vm NLP1和Vm NLP2。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中瞬时表达发现,Vm NLP2能够诱发细胞坏死,而Vm NLP1不能诱导坏死。进一步经原核表达获得Vm NLP2纯化蛋白并滴加至苹果(Malus domestica)叶片发现,该蛋白也能诱导苹果细胞坏死。NLP蛋白存在高度保守的七肽基序(GHRHDWE),然而Vm NLP2七肽基序中的第二个组氨酸突变为了酪氨酸(GHRYDWE)。将该酪氨酸替换为保守组氨酸(Vm NLP2)后,其在本氏烟上诱导的细胞坏死较Vm NLP2增强。以上结果表明Vm NLP2是一个具有诱导细胞坏死的毒素蛋白,且其七肽基序中酪氨酸位点影响毒素活性。(2)Vm NLP2是一个重要致病因子为明确Vm NLP1和Vm NLP2是否参与病菌致病,本研究利用PEG介导的遗传转化体系分别获得两个基因的敲除突变体并接种至苹果叶片和枝条进行致病力测定。结果发现,与野生型(WT)相比,Vm NLP1敲除突变体致病力无明显变化,而Vm NLP2敲除突变体ΔVm NLP2-36在苹果叶片和枝条上的致病力分别下降了约16%和27%。为探究Vm NLP2致病力与其诱导坏死活性的可能关系,将Vm NLP2点突变序列回补至ΔVm NLP2-36并进行致病力检测,发现该回补突变体在叶片上的致病力较Vm NLP2回补菌株增强约18%。该部分结果说明Vm NLP2是Vm的一个重要致病因子,且其坏死活性有利于病菌侵染致病。(3)Vm NLP1和Vm NLP2参与维持细胞膜稳定性及对盐和渗透胁迫的响应为进探究Vm NLP1和Vm NLP2是否参与Vm对非生物胁迫的响应,将其敲除突变体分别接种至含有不同抑制剂的PDA平板上并观察菌落生长情况。结果发现,与WT相比,Vm NLP1及Vm NLP2敲除突变体在含SDS、刚果红和山梨醇的平板上营养生长受到不同程度的抑制或促进作用,表明Vm NLP1和Vm NLP2在维持Vm细胞膜完整性,以及在病菌对盐胁迫和渗透胁迫的响应中发挥不同的作用。(4)Vm NLP2中的保守多肽能够被非寄主拟南芥识别研究表明,NLP蛋白中的保守多肽可被拟南芥(Arabidopsis thaliana)识别并激发免疫反应。为探究Vm NLP1和Vm NLP2中相应保守多肽是否具有免疫诱抗性,本研究合成获得多肽nlp20(Vm NLP1)和nlp25(Vm NLP2)。用1μM多肽处理拟南芥叶片并对免疫反应相关指标进行检测发现,只有nlp25(Vm NLP2)能显著激发活性氧迸发以及免疫标志基因(At PR1、At WRKY33、At FRK1)的上调表达,并显著诱导拟南芥对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抗性。然而,nlp25(Vm NLP2)不能诱导苹果活性氧迸发及免疫标志基因表达。该结果说明Vm NLP2中的保守多肽能够被拟南芥识别,但是不能被寄主苹果识别。综上所述,本研究从Vm中鉴定到Vm NLP1和Vm NLP2两个NLP蛋白,并揭示了Vm NLP2是一个毒素蛋白和腐烂病菌的重要致病因子。此外,分析了Vm NLP1和Vm NLP2调控腐烂病菌响应多种非生物胁迫的功能,探索到Vm NLP2保守多肽在拟南芥上的免疫诱抗功能。本研究为NLP蛋白功能多样性提供了证据,更重要的是,Vm NLP2作为一个重要致病因子可作为苹果树腐烂病防治中的一个潜在靶标,从而为靶向药剂的研发提供科学依据。

关键词：苹果树腐烂病 Nep1-like蛋白致病性非生物胁迫植物免疫反应

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植物识别脂多糖的分子机制研究进展

植物生理学报 2019年第4期55卷 387-392页

作者：李秋颍王敏吴斌琰梁岩浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所杭州310058

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分,它作为一种典型的微生物相关分子模式,被动植物识别后可以诱导产生免疫反应。相对于LPS在动物中的研究, LPS引起的植物免疫反应以及植物识别LPS的分子机制还很不清楚,但近几年也取得了一些... 详细信息

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分,它作为一种典型的微生物相关分子模式,被动植物识别后可以诱导产生免疫反应。相对于LPS在动物中的研究, LPS引起的植物免疫反应以及植物识别LPS的分子机制还很不清楚,但近几年也取得了一些重要进展。因此,本文将从LPS的复杂结构和LPS引起的独特的植物免疫反应等方面出发,综述研究植物识别LPS分子机制的复杂性以及取得的研究进展。

关键词：脂多糖植物免疫反应微生物相关分子模式模式识别受体

苹果树腐烂病菌两个NIS1-like蛋白鉴定及功能研究

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苹果树腐烂病菌两个NIS1-like蛋白鉴定及功能研究

作者：周文静西北农林科技大学

学位级别：硕士

由子囊菌黑腐皮壳属真菌Valsa mali（Cytospora sacculus（Schwein.）Gvrit.）导致的苹果树腐烂病（apple Valsa canker）在我国危害严重,每年造成巨大经济损失,是苹果生产中的重点防治对象。解析该病菌致病机制对腐烂病的科学防治有着... 详细信息

由子囊菌黑腐皮壳属真菌Valsa mali（Cytospora sacculus（Schwein.）Gvrit.）导致的苹果树腐烂病（apple Valsa canker）在我国危害严重,每年造成巨大经济损失,是苹果生产中的重点防治对象。解析该病菌致病机制对腐烂病的科学防治有着重要的指导意义,而挖掘关键致病因子是其基础工作之一。近年来,尽管国内外在V.mali的致病机制研究中取得了一系列进展,该病菌与苹果互作过程中的关键致病因子仍有待深入挖掘和解析。研究发现,NIS1蛋白（Necrosis-inducing secreted protein 1）是一类广泛分布于真菌的保守效应分子,在病菌与寄主互作过程中发挥多种作用。因此,为挖掘V.mali中的关键致病因子,本研究从NIS1蛋白切入,对V.mali中NIS1同源蛋白进行了鉴定以及功能分析。主要研究结果与结论如下:（1）VmNIS1和VmNIS2的鉴定为鉴定V.mali中的NIS1同源蛋白,本研究分别以功能解析较为清楚的Co NIS1（黄瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare中NIS1蛋白）和Mo NIS1（稻瘟病菌Magnaporthe oryzae中NIS1蛋白）为蛋白基础序列,成功鉴定到V.mali中两条序列VM1G＿07228和VM1G＿03758并分别命名为VmNIS1和VmNIS2。保守结构域分析显示,VmNIS1、VmNIS2、Co NIS1和Mo NIS1类似,均没有已知结构域。蛋白序列分析发现,Co NIS1、Mo NIS1、VmNIS1和VmNIS2相似度在20%～45%之间。系统发育分析发现,VmNIS1与Co NIS1的亲缘关系更接近,而VmNIS2与Mo NIS1更接近。（2）VmNIS1是一个免疫激发子,但不是V.mali的致病因子在本氏烟（Nicotiana benthamiana）上瞬时表达VmNIS1发现,VmNIS1能诱导细胞坏死,但不能抑制激发子INF1诱发的细胞坏死。为探究VmNIS1是否激发植物免疫反应,我们首先利用大肠杆菌（Escherichia coli）进行原核表达获得了VmNIS1重组蛋白。用1μM VmNIS1纯化蛋白处理本氏烟后发现,VmNIS1能够在本氏烟中激发强烈的活性氧（ROS）以及本氏烟过敏性坏死（HR）标志基因（Nb HIN1和Nb HSR203J）、水杨酸通路标志基因（Nb PR1a、Nb PR2）和茉莉酸免疫通路标志基因（Nb PR4和Nb LOX）以及PTI标志基因（Nb PTI5、Nb Acre31、Nb WRKY7及Nb CYP71D20）均上调表达,其中Nb PR1a和Nb CYP71D20上调倍数较大,分别为139.1倍和138.8倍;病菌侵染结果显示,VmNIS1处理本氏烟后,辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的侵染程度显著下降,病菌的相对生物量下降72.4%。这些结果表明,VmNIS1是一个激发子,能够被本氏烟识别并激发免疫反应。为探究VmNIS1对V.mali致病力的影响,本研究利用PEG介导的遗传转化体系得到VmNIS1的缺失突变体ΔVmNIS1-50。接种苹果树枝条发现,ΔVmNIS1-50侵染程度与野生型相比无明显变化,表明VmNIS1不是V.mali的重要致病因子。（3）VmNIS2是一个免疫抑制子和V.mali的重要毒性因子在本氏烟进行瞬时表达发现,VmNIS2不能诱导细胞坏死,但是能够抑制INF1诱发的细胞坏死。进一步研究发现,VmNIS2能够显著降低细菌模式分子flg22诱导的活性氧迸发及本氏烟免疫标志基因Nb PR1a和Nb PR4的表达水平,并促进辣椒疫霉在本氏烟上的侵染。其中Nb PR1a和Nb PR4分别下降了63.4%和78.3%,辣椒疫霉相对生物量提高91.0%。以上结果表明VmNIS2是一个免疫抑制子。为探究VmNIS1对V.mali致病力的影响,我们通过PEG介导的遗传转化体系成功得到VmNIS2的缺失突变体△VmNIS2-13和△VmNIS2-87。致病力测定显示,△VmNIS2-13和△VmNIS2-87较野生型分别下降了13.2%和16.9%,基因回补后致病力恢复至与野生型相当水平,表明VmNIS2是V.mali的重要毒性因子。综上,本研究从V.mali中鉴定到两个NIS1-like蛋白VmNIS1和VmNIS2并明确了其基本生物学功能。其中,VmNIS1是一个免疫激发子,能够被植物识别并诱导免疫反应,对病菌致病力无明显影响;VmNIS2是一个免疫抑制子,能够抑制植物免疫反应,是病菌的重要毒性因子。本研究揭示了保守型效应分子NIS1蛋白在V.mali中的基本功能,也为腐烂病菌与苹果的互作研究奠定了重要理论基础。

关键词：苹果树腐烂病致病因子 NIS1-like蛋白病原相关分子模式植物免疫反应

褪黑素和水杨酸信号互作调控拟南芥免疫反应的机理

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褪黑素和水杨酸信号互作调控拟南芥免疫反应的机理

作者：肖林昆明理工大学

学位级别：硕士

植物病害严重限制作物生长和产量,给粮食安全带来挑战。水杨酸是植物重要的抗病激素,在局部防御和系统获得性抗性中起重要作用。褪黑素是植物体重要的信号分子,通过其受体PMTR1(Phytomelatonin Receptor 1)调控GPA1/NADPH氧化酶介导的RO... 详细信息

植物病害严重限制作物生长和产量,给粮食安全带来挑战。水杨酸是植物重要的抗病激素,在局部防御和系统获得性抗性中起重要作用。褪黑素是植物体重要的信号分子,通过其受体PMTR1(Phytomelatonin Receptor 1)调控GPA1/NADPH氧化酶介导的ROS信号途径和激活MAPK信号途径调控气孔关闭和抗病基因的表达。然而,褪黑素和水杨酸信号互作的调控机理还不清楚。本研究以拟南芥为材料,在分子和生理水平上分析了褪黑素和水杨酸互作调控植物免疫反应的机理,研究结果如下:1.水杨酸通过褪黑素受体PMTR1调控植物气孔关闭和局部防御。与Col-0相比,水杨酸受体基因npr1-1突变体对褪黑素诱导的气孔关闭的敏感性减弱,表明褪黑素诱导的气孔关闭可能部分依赖于水杨酸受体NPR1;然而,水杨酸不能诱导pmtr1的气孔关闭和ROS产生,表明水杨酸诱导的气孔关闭和ROS产生依赖于PMTR1。外源褪黑素处理降低了Col-0、snat1和npr1-1等植物叶片病原菌Pst DC3000菌落数,然而褪黑素和水杨酸均不能降低pmtr1中病原菌含量。药理学和遗传学结果表明,NADPH氧化酶抑制剂DPI和细胞壁过氧化物酶抑制剂SHAM分别抑制了褪黑素和水杨酸诱导的气孔关闭,且褪黑素诱导了对水杨酸不敏感的prx33和prx34气孔关闭,而水杨酸诱导了对褪黑素不敏感的rboh D/F气孔关闭,表明褪黑素和水杨酸分别通过NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物酶介导的ROS产生诱导气孔关闭。RT-q PCR分析发现,褪黑素和水杨酸并不能诱导pmtr1中PRX33和PRX34表明,表明PMTR1介导的信号途径通过调控细胞壁过氧化物酶基因的表达参与水杨酸诱导的气孔关闭。以上研究结果表明,PMTR1介导的信号途径通过调控PRX33和PRX34基因表达参与水杨酸诱导的气孔关闭和叶片防御。2.PMTR1和NPR1整合了褪黑素和水杨酸信号调控水杨酸信号途径基因表达,且褪黑素通过NO信号途径诱导NPR1进入细胞核。10μM外源褪黑素和100μM外源水杨酸处理2 h即显著诱导了Col-0中水杨酸合成基因ICS1、EPS1、PBS3,水杨酸受体基因NPR1以及下游水杨酸依赖的抗病基因PR1、PR2和PR5的表达,并且几乎都在8 h时诱导水平达到最大,但在pmtr1和npr1-1中这些水杨酸相关基因的表达明显低于Col-0,且褪黑素不能促进pmtr1和npr1-1中水杨酸合成和受体基因的表达,表明PMTR1和NPR1整合了褪黑素和水杨酸信号调控水杨酸信号途径基因表达。进一步分析发现,褪黑素处理8 h才能诱导NPR1进入细胞核,并且NO清除剂c PTIO会抑制褪黑素诱导的NPR1入核,而水杨酸2 h就诱导NPR1进入细胞核,且NO清除剂c PTIO不会抑制SA诱导的NPR1入核,表明褪黑素诱导的NPR1入核是通过NO信号介导的,且SA在NO下游诱导NPR1进入细胞核。这些结果表明,褪黑素可能通过PMTR1介导的信号途径调控水杨酸合成基因的表达,进一步诱导SA水平升高,从而促进NPR1进入细胞核并与转录因子结合,启动下游抗病基因PRs的表达。3.褪黑素和水杨酸通过NPR1和TGA1调控PMTR1表达。在褪黑素和水杨酸相关突变体拟南芥中检测褪黑素合成和受体基因的表达水平,发现水杨酸不影响褪黑素合成基因的表达,但能诱导Col-0中褪黑素受体基因PMTR1的表达,且褪黑素和水杨酸不能促进npr1-1和tga1中PMTR1的表达。此外,双荧光素酶报告基因检测分析发现,TGA1可以与PMTR1启动子互作,且NPR1促进了TGA1对PMTR1表达的调控。

关键词：褪黑素水杨酸气孔关闭植物免疫反应