检索结果-南通市图书馆

作者：谷耀光江苏大学

学位级别：硕士

由不健康生活方式和饮食营养失衡所引起的代谢疾病已经成为全球共同的挑战。肥胖大多为能量摄入远大于消耗,造成白色脂肪的大量堆积。然而,哺乳动物体内存在一种棕色脂肪,其细胞内线粒体含量很高,能够依赖解偶联蛋白1(UCP1)将脂肪转化... 详细信息

由不健康生活方式和饮食营养失衡所引起的代谢疾病已经成为全球共同的挑战。肥胖大多为能量摄入远大于消耗,造成白色脂肪的大量堆积。然而,哺乳动物体内存在一种棕色脂肪,其细胞内线粒体含量很高,能够依赖解偶联蛋白1(UCP1)将脂肪转化为热量,从而消耗脂肪。近年来有研究发现,白色脂肪在一定的环境和物质条件刺激下可发生棕色化反应,从而具有棕色脂肪的某些特征。本课题组前期研究发现,摄入乳酸菌发酵大麦提取物的肥胖大鼠,其血清甘油三酯和胆固醇显著下降,棕色脂肪增多,细胞试验表明抑制脂肪合成的主要成分是发酵产物中的蛋白质,但其是否能够引起白色脂肪棕色化反应及其作用机制尚不清楚。本论文以大麦为原料,采用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum dy-1)进行发酵,对发酵大麦提取物中的蛋白质(LFBE-P)进行分离纯化,研究其对3T3-L1前脂肪细胞棕色化反应的作用;选取特征评价指标,筛选LFBE-P中的活性成分,探讨其诱导3T3-L1前脂肪细胞棕色化的机制。主要研究内容和结果如下:1.研究LFBE-P的分离方法以及发酵前后的变化。采用考马斯亮蓝法和凯氏定氮法检测大麦发酵前后提取物中的蛋白质含量;采用SDS-PAGE分析大麦发酵后蛋白质的变化。结果表明,硫酸铵分级沉淀对LFBE-P和未发酵大麦分离蛋白(RBE-P)的回收率分别为84.6%和73.2%;RBE-P的相对分子质量分布在20kDa至120kDa之间,而LFBE-P的相对分子质量则主要集中在45kDa以下。2.研究LFBE-P对3T3-L1前脂肪细胞棕色化的影响。采用CCK-8法检测细胞活力;采用葡萄糖氧化酶(GOPOD)法检测葡萄糖的含量;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测mRNA的相对含量。结果表明,大于40μg/mL的LFBE-P作用于3T3-L1前脂肪细胞24h和48h其存活率分别为81%和69%,大于80μg/m L的RBE-P作用于3T3-L1前脂肪细胞24h和48h的存活率分别为93.3%和69.7%,即均有明显的抑制作用;LFBE-P能够提高3T3-L1前脂肪细胞对葡萄糖的消耗量,在24h时间内,20μg/m L的LFBE-P作用于细胞后其葡萄糖消耗量比对照组提高了80%;同时LFBE-P能够上调棕色化特征基因的表达,引起3T3-L1前脂肪细胞的棕色化,而RBE-P则未见明显作用。3.对LFBE-P进行分离纯化,筛选诱导3T3-L1前脂肪细胞棕色化的高活性组分,并验证其诱导细胞棕色化的作用。采用超滤、阴离子交换层析和凝胶层析对LFBE-P进行分离纯化,得到活性最高的LFBE-P4组分;采用实时荧光定量PCR分析细胞基因Ucp1、Pgc-1α、Prdm16、Bmp7和Fgf21的变化来筛选活性组分;采用油红O染色法研究LFBE-P4对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响;采用TG测定试剂盒检测细胞内游离脂肪酸含量;采用葡萄糖氧化酶(GOPOD)法检测葡萄糖的含量;采用实时荧光定量PCR研究LFBE-P4对细胞线粒体基因(Cytochrome B)调控的影响。结果表明,相对分子质量处于3-20kDa的蛋白质,诱导3T3-L1前脂肪细胞棕色化的效果最为明显;阴离子交换洗脱峰中P2和P3的活性最大;凝胶柱层析后,蛋白峰SP4为活性最高组分,即为LFBE-P4;LFBE-P4能够抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,其分化率仅为53.2%,同时抑制细胞脂肪的合成代谢,降低细胞内三油甘脂(TG)含量;LFBE-P4能够显著促进细胞的分解代谢,提高细胞的葡萄糖消耗量;LFBE-P4能够明显提高线粒体的相对含量,从而诱导3T3-L1前脂肪细胞的棕色化。4.研究LFBE-P4诱导白色脂肪棕色化的分子机制。采用实时荧光定量PCR分析LFBE-P4对3T3-L1前脂肪细胞分化不同阶段基因表达的影响;采用western blot分析细胞中UCP1蛋白的表达量。结果表明,LFBE-P4能够促进3T3-L1前脂肪细胞Pgc-1α和Ucp1基因的表达;在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中,LFBE-P4对大多数棕色化基因都有明显的上调作用,且能够明显下调白色脂肪细胞特征基因Cidea和C/ebpα的表达;对3T3-L1成熟脂肪细胞,LFBE-P4能够显著上调棕色化相关基因的表达,同时从蛋白质水平,15μg/m L时其UCP1表达量提高了5倍左右,并与之呈现呈量效关系。

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Leptin通过Hedgehog信号通路对前体脂肪细胞分化及棕色化的作用研究

Leptin通过Hedgehog信号通路对前体脂肪细胞分化及棕色化的作用研...

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作者：葛静西北农林科技大学

学位级别：硕士

瘦素（Leptin）是由脂肪细胞分泌的蛋白质类激素,具有广泛的生物学效应,可促进机体的能量消耗,因此,对白色脂肪组织棕色化有一定影响。而白色脂肪组织棕色化是近年来的研究热点,其具有调节机体代谢和能量平衡的作用,这能为治疗肥胖、糖... 详细信息

瘦素（Leptin）是由脂肪细胞分泌的蛋白质类激素,具有广泛的生物学效应,可促进机体的能量消耗,因此,对白色脂肪组织棕色化有一定影响。而白色脂肪组织棕色化是近年来的研究热点,其具有调节机体代谢和能量平衡的作用,这能为治疗肥胖、糖尿病等代谢性疾病提供新思路,因此,探究Leptin对白色脂肪组织棕色化的作用具有重要意义。另外,Hedgehog（Hh）信号通路对胚胎发育起重要作用,但其对白色脂肪组织棕色化的作用尚存在争议,因此,探究其对白色脂肪组织棕色化的作用具有重要意义。本研究在细胞水平上,对小鼠前体脂肪细胞进行Hh抑制剂环巴胺（Cyclopamine,Cy）与激活剂Purmorphamine（Pu）以及Leptin处理,染色观察细胞中的脂滴大小,RT-qPCR与WB检测细胞成脂分化标志基因、棕脂及线粒体标志基因以及Hh信号通路关键基因Gli的表达;在活体水平上,对高脂诱导肥胖鼠进行Leptin注射,检测小鼠各项生化指标,HE染色观察各组织中的细胞大小,RT-qPCR与WB检测细胞成脂分化标志基因、棕脂及线粒体标志基因以及Hh信号通路关键基因Gli的表达,获得了以下主要创新性结果:***能增加细胞内小脂滴的数目,且RT-qPCR与WB结果显示细胞成脂分化标志基因、棕脂及线粒体标志基因的表达均呈显著或极显著上升趋势（P＜0.05,P＜0.01）;而Pu则可抑制细胞内脂滴的生成,抑制白脂分化与棕色化。2.浓度为100 nmol/L的Leptin可使细胞内小脂滴数目增多,RT-qPCR与WB结果显示细胞成脂分化标志基因、棕脂及线粒体标志基因的表达均呈显著或极显著上升趋势（P＜0.05,P＜0.01）,且Leptin能极显著抑制Hh通路的标志基因Gli1的表达（P＜0.01）。3.高脂肥胖鼠活体注射Leptin（5mg/kg/d）7 d后,发现Leptin显著降低了iWAT、eWAT、BAT的重量（P＜0.05）;HE染色结果显示,细胞脂滴明显变小,且成脂分化、脂解以及棕脂标志基因在iWAT、eWAT、BAT中的表达均显著或极显著减少（P＜0.05,P＜0.01）。此外,iWAT中,Leptin极显著抑制Gli的表达（P＜0.01）。但肝脏（Liver）中,成脂、脂解以及棕色化标志基因的表达均显著增加（P＜0.01）。综上所述,Hh信号通路抑制小鼠前体脂肪细胞分化及棕色化;Leptin通过抑制Hh信号通路促进小鼠前体脂肪细胞分化及棕色化;Leptin能抑制脂肪组织成脂、脂解以及棕色化现象,改善食源性肥胖的发生。以上研究结果为进一步探究Leptin调控白色脂肪组织棕色化机制提供基础。

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芹菜素通过激活PI3K-Akt-mTOR通路抑制自噬促进白色脂肪棕色化

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作者：熊绍风南昌大学

学位级别：硕士

目的:随着人们生活条件的改善和上班族久坐不动生活方式的盛行,肥胖人数呈现指数级逐年增加。白色脂肪棕色化已被证实在治疗肥胖及其相关代谢性疾病中具有积极意义,且具有黄酮类结构的化合物对白色脂肪棕色化的作用也渐渐进入研究者们... 详细信息

目的:随着人们生活条件的改善和上班族久坐不动生活方式的盛行,肥胖人数呈现指数级逐年增加。白色脂肪棕色化已被证实在治疗肥胖及其相关代谢性疾病中具有积极意义,且具有黄酮类结构的化合物对白色脂肪棕色化的作用也渐渐进入研究者们的视野。本研究通过探究黄酮类化合物芹菜素(Apigenin,AP)在动物水平(肥胖C57BL/6小鼠)和细胞水平(3T3-L1和肥胖SD大鼠原代脂肪细胞)对白色脂肪棕色化的影响及其可能的作用机制,为临床治疗肥胖及相关疾病提供重要实验依据。方法:1、动物实验:首先,取30只6周龄健康雄性C57BL/6小鼠,适应环境一周之后,随机分为两组。一组(20只)以高脂饲料(HFD)喂养,另一组(10只)则以正常饲料(Ctrl)喂养作为对照,喂养12周后,HFD组体重比Ctrl组体重大于20%,显示肥胖模型成功建立;肥胖模型建立成功之后,又将HFD组随机分为两组,每组10只并继续以HFD喂养,其中一组以AP(0.3mg/g·d)分3次灌胃,另一组以芹菜素的溶剂(PBS,0.03 ml/g·d)分3次灌胃,Ctrl组继续以普通饲料喂养。动物实验最后的分组为Ctrl组、HFD组、AP组。4周之后,检测以下指标:(1)体重(Weight)、身长(Length)、Lee’s指数(Lee’s Index)和Fat Index(FI);(2)葡萄糖耐量(GTT)和胰岛素耐量(ITT)实验;(3)称量附睾白色脂肪(eWAT)、肩胛区棕色脂肪(BAT)、皮下腹股沟白色脂肪(iWAT)、肾周白色脂肪(pWAT)、大网膜白色脂肪(oWAT)以及心、肝、脾、肾和肺的重量;(4)检测各组小鼠的各项生化指标(血甘油三脂TG、血胰岛素INS、血胆固醇TC、空腹血糖FPG、胰岛素抵抗指数HOMA-IR和血抵抗素Resistin);(5)寒冷耐受实验;(6)Western blotting法检测iWAT中PGC-1α、PRDM16、UCP-1、LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1和p62的蛋白表达水平。2、细胞实验:首先,分离和培养HFD喂养12周的SD大鼠iWAT、BAT、oWAT三个部位的原代前脂肪细胞,并同时与3T3-L1前脂肪细胞用鸡尾酒诱导法进行诱导,诱导8天后,Western blotting和油红O结果显示成功诱导为成熟脂肪细胞;接着采用不同浓度的AP(5,25,50,100,200μM)处理这四种脂肪细胞,同时设立Ctrl组,得到最佳浓度,同时检测AP对这四种脂肪细胞甘油三酯积聚的作用;得到最佳浓度之后,将实验分为Ctrl组和AP组测定自噬相关蛋白的表达情况;确定AP对自噬的作用之后,利用药理性的自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,RP)同步作用,分组为Ctrl组、RP组、AP组和AP+RP,探究RP能否逆转AP对棕色化过程的影响;实验的最后采用药理性抑制剂,探究AP对自噬经典通路PI3K-Akt-mTOR的影响。细胞实验中测定的指标:(1)MTS法检测AP处理四种脂肪细胞时的细胞活力;(2)油红O染色观察诱导后及AP作用后四种细胞内脂滴聚集情况;(3)免疫荧光法探究3T3-L1细胞的UCP-1的表达情况;(4)qRT-PCR法检测棕色化相关基因UCP-1、PGC-1α、PRDM16、PPAR-γ、CEBP/β、COX-8P和ATP5B等mRNA表达情况;(5)MDC染色观察自噬小体数目;(6)Western blotting法分别检测UCP-1、PRDM16、PGC-1α、LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR和mTOR等蛋白表达水平。结果:1、动物实验:(1)被AP处理后的小鼠体形和4个部位白色脂肪组织的形态大小较HFD组更小,而BAT形态大小较HFD组略微变大(2)被AP处理后的小鼠体重及Lee’s指数和FI较HFD组显著性降低(P化指标(TG、INS、TC、FPG、HOMA-IR和Resistin)较HFD组呈现降低(P棕色化标志蛋白(PGC-1α、PRDM16和UCP-1)表达水平升高,自噬标志蛋白(LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、p62)表达降低(P<0.01或P<0.05);(8)GTT和ITT实验显示:AP处理之后,小鼠对葡萄糖和胰岛素的耐受性较HFD组显

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Irisin通过AMPKα1调控小鼠脂肪细胞棕色化

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作者：李经纬山西农业大学

学位级别：硕士

【目的】哺乳动物体内摄入过多的热量会以白色脂肪的形式存储起来。过多的能量摄入是引起肥胖最主要的原因,肥胖是目前国际上最多发的代谢性疾病之一,由肥胖引起的II型糖尿病、心血管疾病等的发病率也逐年升高,因此肥胖是威胁人类健康... 详细信息

【目的】哺乳动物体内摄入过多的热量会以白色脂肪的形式存储起来。过多的能量摄入是引起肥胖最主要的原因,肥胖是目前国际上最多发的代谢性疾病之一,由肥胖引起的II型糖尿病、心血管疾病等的发病率也逐年升高,因此肥胖是威胁人类健康的一大隐患,如何健康有效的限制体内过多的白色脂肪从而治疗肥胖是当下研究的热点。另外在养猪业中过多的白色脂肪组织也严重影响着猪肉品质和经济效益。有研究证明动物体内的白色脂肪在一些特定的条件下(运动,寒冷等)有向棕色脂肪转化的良性趋势。鸢尾素(Irisin)是由骨骼肌分泌的一种小分子蛋白,对脂肪细胞的棕色化有着极其重要的作用,但其促进棕色化的信号通路还有待进一步的研究。本研究旨在探讨Irisin促进白色脂肪棕色化的信号通路。【方法】通过体外培养3T3-L1细胞以及小鼠原代脂肪细胞,采用鸡尾酒法使其分化成熟,之后转染AMPKα1-siRNA并添加20nmol/L Irisin蛋白处理,使用油红O染色鉴定脂肪细胞,采用RT-PCR、Western Blotting检测棕色脂肪标记基因解偶联蛋白-1(UCP1),过氧化物酶-γ共激活因子1α(PGC-1α),同时使用光密度分析对脂肪细胞中的脂滴进行分析。【结果】(1)qRT-PCR结果显示转染AMPKα1-siRNA后脂肪细胞AMPKα1mRNA相对表达量明显低于对照组;qRT-PCR结果显示两种脂肪细胞模型中转染组中PGC-1α和UCP1mRNA相对表达量明显低于对照组;Western Blotting结果显示两种脂肪细胞模型中转染组中PGC-1α和UCP1蛋白相对表达量明显低于对照组。(2)油红O染色结果显示两种脂肪细胞模型中脂滴均被染色;光密度分析结果显示转染AMPKα1-siRNA后脂肪细胞中添加组与非添加组OD值无明显差异。qRT-PCR结果显示显示两种脂肪细胞模型添加Irisin之后转染组PGC-1α和UCP1mRNA相对表达量明显低于非转染组;Western Blotting结果显示两种脂肪细胞模型添加Irisin之后转染组PGC-1α和UCP1蛋白相对表达量明显低于非转染组。【结论】AMPKα1蛋白在Irisin促进白色脂肪细胞棕色化中起了重要作用,为深一步研究Irisin促进白色脂肪棕色化的信号通路提供了依据。

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类叶升麻苷对白色脂肪棕色化的作用及机制研究

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作者：兰健浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的肥胖作为当前全球范围内最受关注的公共卫生问题,一直为人们所关注。随着生活水平的提高,肥胖问题日趋严峻。如何解决体内脂肪过多,成为当下研究热点。本研究,以白色脂肪棕色化为切入点,运用荧光定量PCR技术（Real-time PCR）、蛋... 详细信息

目的肥胖作为当前全球范围内最受关注的公共卫生问题,一直为人们所关注。随着生活水平的提高,肥胖问题日趋严峻。如何解决体内脂肪过多,成为当下研究热点。本研究,以白色脂肪棕色化为切入点,运用荧光定量PCR技术（Real-time PCR）、蛋白质印迹法（Western-blot）,探究中药地黄提取物类叶升麻苷对C57BL/6小鼠原代白色脂肪细胞棕色化过程的影响,分析类叶升麻苷影响白色脂肪细胞棕色化过程的分子机制。方法1.查阅中医关于肥胖、地黄的相关文献,探究中医对肥胖、地黄认识,以及地黄在肥胖治疗中的运用。2.复苏3T3-L1前脂肪细胞,传代培养。待3代脂肪细胞至对数期,将细胞随机分成6组:实验组1（1u M类叶升麻苷）;实验组2（5u M类叶升麻苷）;实验组3（10u M类叶升麻苷）;实验组4（20u M类叶升麻苷）;实验组5（30u M类叶升麻苷）;对照组（0u M类叶升麻苷）。在相同的诱导条件下进行8天的棕色化诱导培养。经油红染色鉴定细胞成脂效果后,采用Real-time PCR技术检测UCP-1 m RNA表达水平。3.将4周龄C57BL/6雄鼠作为实验对象,处死后取其腹股沟脂肪组织,作为原代白色脂肪细胞进行细胞传代培养。待三代白色脂肪细胞培育至对数期时,随机分成4组:实验组1（5u M类叶升麻苷）;实验组2（5u MDMSO+forsk）;实验组3（5u M类叶升麻苷+forsk）;对照组（5u M DMSO）。在相同的诱导条件下进行8天的棕色化诱导培养。经油红染色鉴定细胞成脂效果后,采用Real-time PCR技术和Western-Blot技术检测UCP-1 m RNA和蛋白的表达水平。4.将4周龄C57BL/6雄鼠作为实验对象,处死后取其肩胛间区脂肪组织,作为原代棕色脂肪细胞进行细胞传代培养。待三代棕色脂肪细胞培育至对数期时,随机分成2组:实验组（5u M类叶升麻苷）;对照组（5u M DMSO）。在相同的诱导条件下进行8天的棕色化诱导培养。经油红染色鉴定细胞成脂效果后,采用Real-time PCR技术检测UCP-1 m RNA的表达水平。结果1.3T3-L1前脂细胞经诱导培养,油红染色显示其成脂效果良好。Real-time PCR结果显示:实验组2、实验组4较对照组UCP-1 m RNA表达显著增加（P＜0.01）;实验组5较对照组UCP-1 m RNA表达增加（P＜0.05）;实验组1、实验组3较对照组UCP-1m RNA表达差异不明显（P＞0.05）。2.原代白色脂肪细胞经诱导培养,油红染色显示其成脂效果良好。Real-time PCR结果显示:实验组1较对照组UCP-1 m RNA表达显著增加,具有统计学意义（P＜0.01）;实验组1较对照组AP2、Adipq、Leptin、Pgc1α、Cidea、Prdm16 m RNA表达无明显差异,不具有统计学意义（P＞0.05）;实验组3较对照组UCP-1、Pgc1αm RNA表达显著增加,具有统计学意义（P＜0.01）;实验组3较对照组AP2、Adipq、Leptin、Cidea、Prdm16无明显差异,不具有统计学意义（P＜0.05）。Western-Blot结果显示:实验组1较对照组UCP-1蛋白表达显著增加,具有统计学意义（P＜0.01）3.原代棕色脂肪细胞经诱导培养,油红染色显示其成脂效果良好。Real-time PCR结果显示:实验组较对照组UCP-1 m RNA表达差异不明显,不具有统计学意义（P＞0.05）。结论1.5u M、20u M类叶升麻苷对促进3T3-L1脂肪细胞UCP-1 m RNA表达效果显著。2.5u M类叶升麻苷对促进C57BL/6小鼠白色脂肪细胞UCP-1 m RNA和蛋白表达效果显著。3.5u M类叶升麻苷对促进C57BL/6小鼠棕色脂肪细胞UCP-1 m RNA表达效果不显著。4.类叶升麻苷有促进白色脂肪棕色化的作用。5.中药地黄治疗减肥的有效成分可能是类叶升麻苷,其机制可能与白色脂肪棕色化有关。

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分泌型Osteopontin通过CD44依赖的PI3K-AKT通路促进白色脂肪细胞棕色化

分泌型Osteopontin通过CD44依赖的PI3K-AKT通路促进白色脂肪细胞...

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作者：王梦茜南昌大学

学位级别：硕士

目的:骨桥蛋白(OPN)是一种分泌的多功能糖蛋白,参与免疫反应、炎症、肿瘤形成和代谢等多种病理生理过程。OPN以两种形式存在,即分泌型OPN(sOPN)和胞内型OPN(iOPN)。尽管它们可能具有不同的生物学活性,但它们对棕色脂肪细胞分化的影响尚... 详细信息

目的:骨桥蛋白(OPN)是一种分泌的多功能糖蛋白,参与免疫反应、炎症、肿瘤形成和代谢等多种病理生理过程。OPN以两种形式存在,即分泌型OPN(sOPN)和胞内型OPN(iOPN)。尽管它们可能具有不同的生物学活性,但它们对棕色脂肪细胞分化的影响尚未完全阐明。因此,本研究旨在探讨sOPN在白色脂肪棕色化中的作用及其机制,并探讨未修饰人重组OPN(rhOPN)作为iOPN的替代物,是否具有类似的作用和机制。方法:首先,3T3-L1前脂肪细胞分别用含有rhOPN(10,50,100,200μM)的DMI诱导培养基诱导培养,并设置用含磷酸盐缓冲液(PBS)的培养基代替rhOPN处理的为Vehicle组,诱导分化6天后,设立分组为Ctrl组、Vehicle组、rhOPN(200μM)组;另一方面,用特异性腺病毒Ad-GFP-ap2-OPN感染另一组3T3-L1细胞后用DMI诱导培养基诱导分化,并同时用阴性对照腺病毒(Vehicle)处理作为对照,设立分组为Ctrl组、Vehicle组、Ad-GFP-ap2-OPN组。其次,分别用CD44抗体和免疫球蛋白(Ig G)处理感染过特异性腺病毒Ad-GFP-ap2-OPN的细胞,并如上述方法诱导培养6天,分别设置anti-CD44组、Ig G组。最后,检测以下指标:(1)通过MTS法检测rhOPN处理3T3-L1细胞后的细胞活力;(2)通过ELISA法检测sOPN的表达水平;(3)油红O染色观察3T3-L1细胞诱导后细胞内脂质聚集情况;(4)Western blotting法分别检测与棕色脂肪细胞分化相关的markers如UCP-1、PRDM16、PGC-1α、PPARγ等蛋白表达水平;检测细胞中p-PI3K、PI3K、AKT、AKT-pS473的蛋白表达水平以探讨作用机制。结果:(1)油红O染色结果显示:诱导培养6天时,细胞内脂质大量聚集,脂肪细胞基本诱导成熟。(2)用不同滴度特异性腺病毒Ad-GFP-aP2-OPN感染3T3-L1细胞后,在荧光倒置显微镜下观察,发现脂肪细胞在病毒滴度为1×10PFU感染48h时细胞未见明显损伤并且绿色荧光强度最高。因此,本实验选择最佳感染病毒滴度为1×10PFU,最佳感染时间为48h。(3)ELISA法检测结果显示:用特异性腺病毒Ad-GFP-aP2-OPN感染3T3-L1细胞后分泌sOPN的水平上升。(4)MTS法检测结果显示:用由不同浓度的rhOPN来替代欠修饰的iOPN处理脂肪细胞后,细胞活力没有受到明显的影响。(5)油红O结果显示:感染特异性腺病毒上调sOPN后,细胞内脂质大量聚集,而用rhOPN处理后细胞内脂质并没有明显聚集现象。(6)Western blotting测定结果显示:用腺病毒Ad-GFP-aP2-OPN感染的3T3-L1细胞内UCP-1、PRDM16、PGC-1α和PPARγ等蛋白的表达水平显著升高;而用rhOPN处理后的细胞内上述相应蛋白却没有明显的上升趋势。(7)确认sOPN上调促进白色脂肪细胞棕色化后,油红O结果显示:用CD44抗体中和CD44受体后,对比空白对照Ig G组,细胞内脂质聚集受到明显的抑制。(8)Western blotting测定结果显示:对比空白对照Ig G组,中和CD44受体后,UCP-1、PRDM16、PGC-1α和PPARγ等棕色化相关蛋白的表达受到明显的抑制,并且相关通路蛋白p-PI3K、AKT-pS473的表达也受到明显的抑制。结论:sOPN具有促进白色前脂肪细胞棕色化的能力,其作用机制可能是依赖于与细胞膜上的CD44受体结合的。然而,rhOPN则未发现具有上述效应。

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Osteopontin下调抑制C57BL/6小鼠白色脂肪组织棕色化及其机制研究

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作者：卢意南昌大学

学位级别：硕士

目的:目前,白色脂肪棕色化在治疗肥胖症及其相关代谢性疾病中具有积极意义。在我们前期的研究中,已经发现Osteopontin(OPN)能够实现白色前脂肪细胞的棕色化诱导。本研究通过脂肪组织特异性靶向OPN的干扰腺病毒(Ad-aP2-OPN-shRNA)感染正... 详细信息

目的:目前,白色脂肪棕色化在治疗肥胖症及其相关代谢性疾病中具有积极意义。在我们前期的研究中,已经发现Osteopontin(OPN)能够实现白色前脂肪细胞的棕色化诱导。本研究通过脂肪组织特异性靶向OPN的干扰腺病毒(Ad-aP2-OPN-shRNA)感染正常和肥胖小鼠下调脂肪组织中OPN,从动物水平研究下调OPN对小鼠白色脂肪棕色化的影响及潜在作用机制。方法:首先,选取40只健康雄性C57BL/6小鼠,随机分成两组,其中一组高糖高脂饮食(HFD),待12周后,肥胖模型成功建立;另一组则正常饮食(Normal)作为对照。随后,HFD组选取15只造模成功的肥胖小鼠,随机分成3组,分别尾静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS)、阴性对照腺病毒(Vehicle)和Ad-aP2-OPN-shRNA特异性腺病毒,Normal组同样进行上述操作。该实验最后的实验分组为Ctrl组、Vehicle组、sh-OPN组和Obese组、Obese+Vehicle组、Obese+sh-OPN组。最后,通过Western Blotting法和ELISA法分别检测iOPN和sOPN的表达水平,确定Ad-aP2-OPN-shRNA特异性腺病毒感染小鼠使其OPN下调后,检测以下指标:(1)体重(Weight)、身长(Length)、Lee’s指数(Lee’s Index)和脂肪指数(FI);(2)称量腹股沟(皮下)白色脂肪(IWAT)、附睾白色脂肪(EWAT)、肾周白色脂肪(PWAT)、脊柱旁白色脂肪(RWAT)、肩胛区棕色脂肪(IBAT)、肝、心、脾、肺和肾的重量;(3)HE染色观察腹股沟白色脂肪、附睾白色脂肪、肾周白色脂肪和脊柱旁白色脂肪的细胞形态;(4)检测各组小鼠的各项生化指标(空腹血糖FPG、血胰岛素FINS、血甘油三脂TG、血胆固醇TCH、胰岛素抵抗指数HOMA-IR和血抵抗素Resistin);(5)油红O染色观察肝脏脂肪代谢情况;(6)免疫组化法检测腹股沟白色脂肪中PGC-1α、PRDM16和UCP-1的表达水平;(7)Western Blotting法检测腹股沟白色脂肪中PI3K、AKT、AKT-pS473、PPARγ的蛋白表达水平以探讨作用机制。结果:(1)脂肪组织特异性腺病毒Ad-aP2-OPN-shRNA感染小鼠后,小鼠脂肪组织中iOPN和血清中sOPN的水平下降。(2)OPN下调后,小鼠体形及各部位脂肪组织的形态大小更大,且肥胖组比正常组更加明显。(3)OPN下调后,正常组小鼠的体重、体长、Lee’s指数和脂肪指数FI无明显差异,但肥胖组小鼠体重和Lee’s指数显著性降低。(4)HE染色结果显示:OPN下调后各部位脂肪组织的细胞形态变大。(5)OPN下调后,小鼠各部位脂肪组织及各脏器重量增加,但只有肥胖组的腹股沟脂肪和肝脏具有统计学意义。(6)OPN下调后,小鼠各项生化指标(空腹血糖FPG、血胰岛素FINS、血甘油三脂TG、血胆固醇TCH、胰岛素抵抗指数HOMA-IR和血抵抗素Resistin)呈现上升趋势。(7)油红O结果显示:OPN下调后,肝脏内脂肪含量增加。(8)免疫组化结果显示,OPN下调后腹股沟白色脂肪组织中棕色化标志蛋白(PGC-1α、PRDM16和UCP-1)的表达水平下降。(9)根据Western Blotting结果,小鼠腹股沟白色脂肪组织中PI3K、AKT-pS473、PPARγ表达水平下降。结论:C57BL/6小鼠感染脂肪组织特异性腺病毒Ad-aP2-OPN-shRNA后OPN下调,OPN下调后抑制小鼠白色脂肪组织棕色化,而这一作用机制可能是通过PI3K-AKT通路介导抑制PPARγ进而抑制白色脂肪组织棕色化。

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Leptin通过降低脂肪细胞中ITGA5的表达抑制纤维化及促进白脂棕色化的作用机制

Leptin通过降低脂肪细胞中ITGA5的表达抑制纤维化及促进白脂棕色...

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作者：黄红涛西北农林科技大学

学位级别：硕士

瘦素(Leptin)作为脂肪细胞分泌的一种小分子蛋白,在脂肪组织的机体的能量代谢,免疫调节等生命活动中发挥着重要的作用。在肥胖发生时会由于脂肪组织迅速扩张导致细胞缺氧及炎症等因素进而导致脂肪组织纤维化,纤维化会导致脂肪组织功能失... 详细信息

瘦素(Leptin)作为脂肪细胞分泌的一种小分子蛋白,在脂肪组织的机体的能量代谢,免疫调节等生命活动中发挥着重要的作用。在肥胖发生时会由于脂肪组织迅速扩张导致细胞缺氧及炎症等因素进而导致脂肪组织纤维化,纤维化会导致脂肪组织功能失调,而在ob/ob鼠中添加外源Leptin会缓解小鼠脂肪组织炎症及纤维化。Leptin还能够通过激活下丘脑神经系统及对下游信号通路的抑制等方式促进白脂棕色化,而白脂棕色化已被证明能够缓解脂肪组织纤维化。但Leptin是否能够通过调控脂肪组织纤维化进而影响白脂棕色化尚不清楚。本试验通过Leptin处理小鼠脂肪细胞后,通过测序分析筛选出可能对脂肪组织纤维化发挥作用的靶蛋白ITGA5,并进一步通过构建ITGA5的超表达载体及干扰片段,通过q PCR,WB及形态学观察等技术检测脂肪组织纤维化及白脂棕色化等相关基因表达的变化。探究了Leptin对脂肪组织纤维化进而影响白脂棕色化的分子机制。本研究为进一步探究Leptin与脂肪组织纤维化及脂肪组织纤维化与白脂棕色化的关系提供了一定的理论基础。本试验一共取得以下研究结果:***通过降低脂肪细胞ITGA5的表达从而抑制纤维化相关基因的表达。Leptin处理脂肪细胞后,检测脂肪细胞中Col1、Col3、Mmp9等纤维化相关基因的表达,发现Leptin处理能显著下调脂肪细胞纤维化相关基因的表达(P化密切相关的蛋白整合素α5(ITGA5)的含量相比于对照组显著降低(P化相关基因的表达,且与ITGA5密切相关。***5通过PI3K-Akt信号通路调节脂肪组织纤维化。通过TGF-β构建脂肪细胞纤维化模型及通过高脂诱导肥胖构建小鼠脂肪组织纤维化模型。利用ITGA5超表达载体和干扰片段,分别处理脂肪细胞和注射小鼠,检测脂肪细胞及脂肪组织的纤维化相关基因的表达。发现干扰ITGA5能够显著下调纤维化相关基因的表达(P化得到缓解,组织羟脯氨酸含量显著降低(P化相关基因表达的促进作用被抑制(P化相关基因的表达从而缓解脂肪组织纤维化。***通过ITGA5促进白脂棕色化。通过Leptin注射小鼠,检测棕色化相关基因的表达,发现Leptin处理后能够显著上调脂肪组织棕色化相关基因。而在细胞水平上通过TGF-β处理脂肪细胞构建细胞纤维化模型,发现TGF-β处理后能够显著抑制脂肪组织棕色化相关基因的表达(P棕色化相关基因的抑制作用。利用ITGA5的超表达载体和干扰片段处理脂肪细胞和小鼠,检测棕色化相关基因的表达。发现干扰ITGA5能够显著上调PRDM16、PGC-1α、UCP1等棕色化相关基因的表达(P化等进一步验证了这个结果。表明Leptin能够通过降低ITGA5的表达从而缓解脂肪组织纤维化并促进白脂棕色化。本试验证明了Leptin可以通过降低脂肪细胞中ITGA5的表达从而抑制了PI3K-Akt信号通路的激活,进一步抑制脂肪细胞纤维化相关基因的表达,从而缓解了脂肪组织纤维化。并且ITGA5还能够通过抑制脂肪组织纤维化而进一步促进白脂棕色化。本研究揭示了Leptin通过ITGA5在脂肪组织纤维化和白脂棕色化中的作用,为进一步研究纤维化对脂肪组织代谢的影响提供了一定的理论基础。

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钠离子与低密度脂蛋白受体对白色脂肪棕色化的调控及机制研究

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作者：周鑫中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

背景和目的:鉴于肥胖会诱发包括心血管疾病和糖尿病在内的多种代谢综合征相关疾病,而通过调节机体能量消耗来对付肥胖是一个行之有效的方法。棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)以及白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)诱导分... 详细信息

背景和目的:鉴于肥胖会诱发包括心血管疾病和糖尿病在内的多种代谢综合征相关疾病,而通过调节机体能量消耗来对付肥胖是一个行之有效的方法。棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)以及白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)诱导分化形成的米色脂肪细胞拥有特殊的产热功能而已经被证明可以改善与肥胖相关的多种代谢性疾病。多种参与调节棕色和米色脂肪细胞生物学功能的因子和通路已经被成功鉴定,为代谢疾病提供了有希望的治疗靶标。钠离子(sodium,Na)通常是被临近第三脑室的室周器所感受,并且已经被证明与交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)的兴奋密切相关,SNS与基础代谢率关联紧密,并且可以直接激活BAT或者促进WAT向米色脂肪的转变。最近已有研究表明高Na摄入会引起大鼠体脂降低,这可能意味着Na可能会对脂肪组织的活性有调控作用,但尚无确切证据,而且对于Na如何调控SNS也缺乏了解。而低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLr)参与细胞对低密度胆固醇的摄取和利用,脂质代谢通常与能量代谢互有关联,已经有研究表明LDLr基因敲除(LDLr)小鼠在高热量饮食的饲喂过程中相比于野生型小鼠体现出了对肥胖的抵抗性,这可能意味着LDLr缺乏导致机体代谢水平升高,但是对于人们其中的具体机制还缺乏了解。本研究提出了高Na饮食或LDLr缺乏这两个因素通过不同机制激活BAT并促使WAT棕色化的科学假设,并开展了一系列动物实验来验证以上假设,本研究分为两部分进行:1、证明Na可以激活BAT并导致WAT棕色化,并初步证明下丘脑弓状核中的神经肽Y(NPY)参与介导了这个过程。2、验证体内LDLr缺乏导致BAT激活和WAT棕色化,并重点观察了LDLr缺乏是否干预了冷刺激对脂肪组织生物学活性的改变。研究方法:1、给予C57小鼠梯度盐水饲养后观察摄入不同剂量Na后对小鼠基础体征的影响。2、使用间接测热法测量并计算2%盐水饲喂后C57小鼠24小时能量消耗,使用荧光定量聚合酶链锁反应(q-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)实验等技术检测其BAT和腹股沟白色脂肪(inguinal white adipose tissue,WATi)生热基因的表达情况。3、应用转录组测序的方法观察2%盐水饲喂后C57小鼠下丘脑基因表达谱的改变。4、使用间接测热法测量并计算2%盐水饲喂后NPY敲除小鼠(NPY)24小时能量消耗,使用q-PCR、WB等技术检测BAT和WATi生热基因的表达情况。5、使用大脑立体定位注射仪将载有NPY-FLEX的病毒注射到NPY小鼠大脑的特定部位,利用Cre重组酶在下丘脑弓状核特异性恢复小鼠NPY的表达,并使用q-PCR、WB等技术检测BAT和WATi生热基因的表达情况。6、使用间接测热法分别测量LDLr小鼠和C57小鼠在给予冷暴露的情况下24小时的氧气消耗量、二氧化碳产生量,并计算其呼吸交换率和能量消耗。7、使用q-PCR、WB等技术检验LDLr小鼠和C57小鼠在给予冷暴露的情况下BAT和WATi生热基因的表达情况。研究结果:1、梯度盐水饲喂实验表明,盐水浓度达到1%以后会对对C57小鼠的体重、体脂和血脂产生影响,并且这种影响与饲喂的盐水浓度有量效依赖关系。2、2%盐水饲喂可以使C57小鼠基础代谢率和脂肪组织生热相关基因的表达升高。3、转录组测序分析表明,下丘脑中涉及摄食与能量代谢相关基因表达产生较大变化,其中NPY表达下降而酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达上升。4、2%盐水饲喂对NPY小鼠基础代谢率和脂肪组织生热相关基因的表达没有影响。5、恢复NPY敲除小鼠下丘脑弓状核NPY的表达后,2%盐水饲喂可以重新提高脂肪组织生热相关基因的表达。6、普通饮食下LDLr小鼠的基础代谢率和脂肪组织生热相关基因的表达都高于C57小鼠,然而在给予冷暴露后,C57小鼠的基础代谢率和脂肪组织生热相关基因的表达都升高了,而LDLr小鼠却没有发生变化。结论:1、额外的Na摄入后,小鼠BAT和WATi生热基因的表达升高,这种效应是由下丘脑弓状核的NPY介导的。2、LDLr缺乏可以促使小鼠BAT活性升高,亦可诱导WATi棕色化,并且LDLr干预了冷暴露的诱导生热作用。

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利拉鲁肽诱导肥胖小鼠白色脂肪棕色化及对相关miRNAs表达的影响

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作者：张盼盼江苏大学

学位级别：硕士

目的肥胖已成为一种全球性的流行病,它增加了2型糖尿病、脂肪肝、高血压等疾病的发生风险。利拉鲁肽是一种很有潜力的减重药,不仅能减少食欲,还可通过促进白色脂肪棕色化增加机体能量消耗,从而起到降脂减重作用。微小RNAs（miRNAs）是... 详细信息

目的肥胖已成为一种全球性的流行病,它增加了2型糖尿病、脂肪肝、高血压等疾病的发生风险。利拉鲁肽是一种很有潜力的减重药,不仅能减少食欲,还可通过促进白色脂肪棕色化增加机体能量消耗,从而起到降脂减重作用。微小RNAs（miRNAs）是一类短单链非编码RNA,通过抑制转录后翻译和促进m RNA降解调节基因表达,具有调节白色脂肪棕色化及增强棕色脂肪产热功能。目前关于利拉鲁肽对白色脂肪棕色化相关的miRNAs的调节鲜有研究报道。故本研究拟在肥胖小鼠中,分析利拉鲁肽对肥胖小鼠白色脂肪棕色化的作用及对棕色化相关miRNAs的影响情况。方法4周龄C57BL/6小鼠,适应性喂养1周后随机分为普食组、高脂喂养组,分别给予普通饲料和45%高脂饲料喂养20周构建肥胖模型,将体重符合的小鼠进一步分为2组:高脂组（HFD+NS）、利拉鲁肽组（HFD+LIRA）,继续45%高脂饲料喂养并进行干预。普食组设为正常对照组（ND+NS）。HFD+LIRA组以0.2mg/kg利拉鲁肽每日一次腹部皮下注射,ND+NS组和HFD+NS组给予等体积生理盐水每日一次皮下注射,干预12周,期间每两周测定小鼠体重变化。于12周末行腹腔葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验评估糖代谢情况;所有小鼠行CT检测腹部脂肪分布情况;收集小鼠血清检测三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）;小鼠附睾脂肪组织行HE染色,观察脂肪组织形态学变化;实时荧光定量PCR检测白色脂肪中的解偶联蛋白（UCP-1）、过氧化物酶体增殖物激活受体辅助活化因子1α（PGC-1α/PPARGC1A）、PR结构域家族的第16个成员（PRDM16）、细胞诱导死亡的DFFA样效应因子A（CIDEA）的m RNA水平;Western blot及免疫组化检测白色脂肪组织中UCP1的表达情况;实时荧光定量PCR检测白色脂肪组织中与白色脂肪棕色化相关的miRNAs表达水平;靶基因预测数据库Target Scan对差异表达的miRNAs的靶基因进行预测。结果（1）利拉鲁肽干预12周后,HFD+LIRA组小鼠体重较HFD+NS组显著降低,胰岛素抵抗情况好转,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）利拉鲁肽干预12周后,小鼠腹部CT检测结果显示,在不同腰椎平面上,HFD+LIRA组小鼠腹部脂肪面积均显著低于HFD+NS组,差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）利拉鲁肽干预12周后,HFD+LIRA组小鼠血清TG、TC、LDL-C水平较HFD+NS组显著下降,差异有统计学意义（P＜0.01）。（4）利拉鲁肽干预12周后,取小鼠附睾脂肪组织行HE染色观察细胞形态,结果显示,HFD+LIRA组小鼠的附睾脂肪细胞体积较HFD+NS组减小。（5）利拉鲁肽干预12周后,与HFD+NS组相比,HFD+LIRA组小鼠附睾白色脂肪组织中棕色化相关基因PRDM16、UCP1、PGC-1α、CIDEA的m RNA表达水平均显著上升,差异均有统计学意义（P＜0.05）。Western blot和免疫组化结果显示,HFD+LIRA组小鼠附睾白色脂肪组织中UCP1表达水平增高。（6）利拉鲁肽干预12周后,小鼠附睾白色脂肪组织中与白色脂肪棕色化正相关的miR-196a、miR-378a升高,与白色脂肪棕色化负相关的miR-155、miR-199a、miR-382下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。使用靶基因预测数据库Target Scan对差异表达的miRNAs的靶基因进行预测,结果表明,PRDM16是miR-378a、miR-155、miR-199a、miR-382的共同靶基因;PGC-1α是miR-196a、miR-199a、miR-382的共同靶基因。结论（1）利拉鲁肽可显著降低高脂喂养C57BL/6小鼠的体重,改善胰岛素抵抗。（2）利拉鲁肽干预可使小鼠白色脂肪细胞体积减小。（3）利拉鲁肽可诱导高脂喂养小鼠白色脂肪细胞棕色化,增强脂肪组织产热功能。（4）利拉鲁肽可通过调节附睾白色脂肪组织中棕色化相关miRNAs的表达,诱导白色脂肪棕色化的发生。

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