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刚地弓形虫入侵宿主细胞过程中棒状体蛋白16的分泌与分布

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刚地弓形虫入侵宿主细胞过程中棒状体蛋白16的分泌与分布

作者：姜诗晨南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种呈世界性分布的专性寄生于有核细胞内的原虫,全球有三分之一以上的人口受其感染。人体可因食入含包囊的未熟的肉制品和被卵囊污染的食物或水而感染弓形虫。作为一种机会致病性原虫,正... 详细信息

一、研究背景刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种呈世界性分布的专性寄生于有核细胞内的原虫,全球有三分之一以上的人口受其感染。人体可因食入含包囊的未熟的肉制品和被卵囊污染的食物或水而感染弓形虫。作为一种机会致病性原虫,正常人感染弓形虫通常呈无症状带虫状态,然而,当弓形虫感染免疫功能缺陷者,如接受免疫抑制治疗者、恶性肿瘤放疗和艾滋病患者时,可在患者体内迅速增殖并广泛散播,主要侵犯人脑、眼和淋巴结等,表现为多器官损害,甚至引起死亡。孕妇在首次感染弓形虫后可经胎盘垂直传播给胎儿,导致流产、早产、畸胎,死胎和新生儿眼弓形虫病等。弓形虫还可寄生于牲畜和鸟类,给畜牧业带来损失。弓形虫主动入侵宿主,主要包括对宿主细胞的黏附、侵入、宿主细胞内陷形成纳虫空泡、对纳虫空泡进行修饰、速殖子分裂增殖、速殖子破细胞而出及转化为缓殖子等阶段。弓形虫的顶端复合体在虫体侵入宿主细胞中起着重要的作用,复合体上的分泌细胞器包括微线体、棒状体和致密颗粒。棒状体含有多种蛋白,在弓形虫入侵宿主细胞时,可迅速分泌至宿主细胞内或在虫体入侵时分泌并被纳入至纳虫泡膜(parasitophorus vacuole membrane, PVM)上,主要分布于纳虫泡膜、纳虫泡(Parasitophorous vacuole, PV)内和宿主细胞内(细胞核和细胞质),一般将棒状体蛋白(Rhoptry Protein, ROPs)分为两个家族：ROP1、ROP2蛋白家族。ROP1蛋白家族的代表性成员ROP1最初被称为穿透增强因子(Penetration enhancer factor, PEF),在入侵宿主细胞的早期阶段有促进作用,弓形虫一旦侵入宿主细胞,一部分成熟的ROP1蛋白便立即和PVM联合,并集中在PV中,但在入侵过程完成后的几小时内,ROP1的量显著降低甚至消失,而另一部分的ROP1则存在于纳虫空泡中。ROP2家族对弓形虫入侵感染和形成纳虫空泡都是至关重要的效应因子,其成员包括ROP2、ROP3、 ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP16和ROP18,如ROP2、ROP4、ROP5、 ROP7、ROP18等参与了纳虫空泡的形成。PV为一个非融合性小室,弓形虫在入侵宿主细胞后可寄居于内,PVM为弓形虫免受宿主细胞清除提供了保护屏障,弓形虫在PV内依靠宿主细胞提供的营养物质迅速增长繁殖并破坏宿主细胞,最后从遭弓形虫破坏而致裂解的宿主细胞中逸出并再次侵入邻近的新细胞中,如此往复。近期研究表明,ROP2家族不仅在虫体入侵宿主、纳虫空泡修饰和毒力作用方面表现突出,ROP18、ROP16及ROP5还是重要的弓形虫毒力决定因子,弓形虫ROP18可通过干扰免疫相关性GTP酶(IRGs)系统来抑制宿主固有免疫应答,还可靶向作用在内质网膜上的转录激活因子ATF6β来抑制宿主的适应性免疫应答,使弓形虫具备强毒力,而ROP16借助自身的核定位结构(nuclear localization signal, NLS),在侵入宿主细胞后,迅速移位至宿主细胞核,使宿主细胞内的信号传导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT) STAT3/STAT6发生磷酸化,影响宿主细胞内信号通路传导,从而干扰宿主细胞的增殖、分化、凋亡等功能。据报道,不同弓形虫株间ROP16的基因序列呈多态性。弓形虫感染宿主后,宿主的巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞会释放IL.12等细胞因子,诱导继发性免疫反应或直接清除寄生虫。Ⅰ型虫株感染细胞后,ROP16可迅速激活STAT3,随后抑制促炎因子如IL.12的释放,而在Ⅱ型却未发现此现象。不同虫株ROP16的作用不尽相同,那么不同虫株在入侵宿主细胞过程中,ROP16的分泌和分布情况如何呢?本研究通过对弓形虫ROP16进行原核表达,制备其多克隆抗体,运用实时荧光定量PCR实验比较不同虫株在入侵宿主细胞过程中ROP16转录水平的差异,相应地,制备抗弓形虫微管蛋白Tubulin抗体,在运用免疫印迹比较RH株和Pru株ROP16的表达量时作为内参抗体,为深入研究不同虫株ROP16在弓形虫入侵宿主细胞过程中的作用及阐明弓形虫的致病机制提供依据。二、研究目的弓形虫入侵宿主细胞是一个从吸附到宿主细胞膜、随后宿主细胞膜内陷形成纳虫泡、入侵到细胞内、汲取宿主细胞营养完成自身生长及繁殖和逸出旧宿主细胞侵染邻近新宿主细胞的连续性过程。在这个过程中,弓形虫顶端复合体上的分泌细胞器起着重要作用,其分泌出的蛋白包括微线体蛋白、棒状体蛋白、致密颗粒蛋白,其中棒状体蛋白在入侵过程中起了关键性作用。本研究的目的是了解弓形虫不同毒力株的ROP16在转录水平与蛋白水平是否一致,并掌握在入侵宿主细胞后,弓形虫分泌出的RO

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白16 多克隆抗体制备实时荧光定量PCR 间接免疫荧光蛋白质印迹

弓形虫棒状体蛋白16的原核表达及多克隆抗体制备

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江苏大学学报（医学版） 2015年第3期25卷 251-255页

作者：刘原杨华吴亮苏丹华付涛郭雪刘曼姜旭淦陈盛霞曹建平江苏大学医学院江苏镇江212013 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所上海200025

目的:克隆刚地弓形虫RH株速殖子棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)16基因,并构建ROP16基因的原核表达系统,检测和定位ROP16蛋白的表达。方法:以弓形虫RH株速殖子基因组DNA为模板,PCR扩增弓形虫ROP16基因,克隆至p ET-32a(+)载体,在大肠埃... 详细信息

目的:克隆刚地弓形虫RH株速殖子棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)16基因,并构建ROP16基因的原核表达系统,检测和定位ROP16蛋白的表达。方法:以弓形虫RH株速殖子基因组DNA为模板,PCR扩增弓形虫ROP16基因,克隆至p ET-32a(+)载体,在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达。经KCl染色切胶法纯化重组ROP16蛋白,并制备其兔多克隆抗体。采用蛋白质印迹法和间接免疫荧光法检测和定位ROP16在弓形虫速殖子内的表达。结果:成功表达并纯化重组ROP16蛋白,制备了其多克隆抗体。蛋白质印迹法检测出相对分子质量为74 000的特异性条带,间接免疫荧光实验显示ROP16分布于弓形虫速殖子胞质内。结论:经原核表达重组ROP16制备的多克隆抗体能检测和定位ROP16在弓形虫速殖子内的表达。

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白16 原核表达 KCl染色切胶

Chinese1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

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安徽医药 2015年第4期19卷 675-679页

作者：唐媛媛莫绪维陈鹤李群蔡亦红沈继龙安徽医科大学基础医学院病原与免疫学实验室安徽合肥230032 安徽省六安市人民医院检验科安徽六安237000 安徽医科大学第一附属医院检验科安徽合肥230022 安徽医科大学公共卫生学院卫生检验检疫系安徽合肥230032 安徽医科大学基础医学院寄生虫学教研室安徽合肥230032

目的构建弓形虫Chinese 1基因型Tg Ct Wh3(以后均简称Wh3)株棒状体蛋白(rhoptry protein,ROPs)16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16... 详细信息

目的构建弓形虫Chinese 1基因型Tg Ct Wh3(以后均简称Wh3)株棒状体蛋白(rhoptry protein,ROPs)16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至p MD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3D结构。结果各组均PCR扩增出约2.1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p EGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以p ET-28a和p EGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。

关键词：弓形虫棒状体蛋白16 克隆表达生物信息学分析

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弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展

弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展

刚地弓形虫ROP16蛋白对MH-S细胞极化和凋亡的影响及其相关机制

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：刘功振崔勇李瑾魏庆宽黄炳成尹昆赵桂华徐超王洪法山东省医学科学院山东省寄生虫病防治研究所

棒状体蛋白16(ROP 16)是弓形虫棒状体蛋白家族成员,这类蛋白结构存在丝氨酸、苏氨酸激酶区,是弓形虫入侵过程中重要毒力因子。ROP16可分泌到宿主细胞核,能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT,干扰宿主细胞信号通路传导,在弓形虫入侵宿主... 详细信息

棒状体蛋白16(ROP 16)是弓形虫棒状体蛋白家族成员,这类蛋白结构存在丝氨酸、苏氨酸激酶区,是弓形虫入侵过程中重要毒力因子。ROP16可分泌到宿主细胞核,能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT,干扰宿主细胞信号通路传导,在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。本篇文章对弓形虫ROP16发现、结构功能、免疫原性等方面进行综述。

关键词：弓形虫棒状体蛋白16 信号转录活化因子STAT3/6 磷酸化

来源： cnki会议评论

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022年第5期40卷 579-586页

作者：李佳铭王艺璇杨宁爱马慧慧兰敏刘春兰赵志军宁夏医科大学临床医学院银川750004 宁夏病原微生物重点实验室银川750004 宁夏医科大学总医院医学实验中心银川750004

目的探究刚地弓形虫棒状体蛋白16 (ROP16)在小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)中的表达及其对细胞极化和凋亡的影响和相关机制。方法利用携带绿色荧光标签的ROP16过表达慢病毒转染MH-S细胞,构建稳定表达ROP16的ROP16-MH-S细胞株(过表达组),... 详细信息

目的探究刚地弓形虫棒状体蛋白16 (ROP16)在小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)中的表达及其对细胞极化和凋亡的影响和相关机制。方法利用携带绿色荧光标签的ROP16过表达慢病毒转染MH-S细胞,构建稳定表达ROP16的ROP16-MH-S细胞株(过表达组),同时设空载体慢病毒转染对照组(空载体组)和无转染对照组(对照组)。转染72 h后免疫荧光法检测ROP16-MH-S中ROP16的表达及其在细胞中的定位。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的转录水平为内参照,RT-qPCR检测ROP16-MH-S细胞中促炎(M1)因子白细胞介素-1β (IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、 IL-18、 IL-6、 IL-12和抗炎(M2)因子IL-10、转化生长因子-β(TGF-β),以及抑凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)和促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase 3)、 Caspase 9等mRNA的相对转录水平;Western blotting检测ROP16-MH-S细胞中极化蛋白精氨酸酶1 (Arg-1)、信号转导和转录激活因子3 (STAT3)、 705位点磷酸化(pTyr705)-STAT3、 STAT6、 pTyr641-STAT6和凋亡蛋白Caspase 9、 Caspase 3、 Bcl-2、 Bax蛋白的相对表达水平;流式细胞术检测ROP16-MH-S细胞的凋亡情况。组间比较采用单因素方差分析。结果转染后72 h,空载体组和过表达组90%以上的细胞可见较强的绿色荧光,过表达组细胞中可见明显红色荧光聚集在ROP16-MH-S细胞核及其周围。RT-qPCR结果显示,过表达组ROP16 mRNA的相对转录水平为8 023.459±39.325,高于空载体组(5.540±0.001)(F=83 188, P 16蛋白的相对表达水平为16.349±0.746,高于空载体组(1.291±0.333)(F=831.7, P 体组(0.994±0.043、 1.165±0.034、 0.943±0.005、 1.153±0.028、 0.926±0.031)(F=261.7、 536.5、 1 682.0、 225.0、 78.5, P 体组(0.790±0.031、 1.091±0.027)(F=23 835.0、 200.1, P 蛋白相对表达水平分别为2.337±0.089、 3.471±0.046、 3.905±0.045,均高于空载体组(0.871±0.014、 1.482±0.071、 1.514±0.050)(F=640.8、 1 608.0、 3 528.0, P 体组(5.655±0.290)%(F=219.7, P 蛋白Bax、 Caspase 3、 Caspase 9的相对表达水平分别为0.558±0.005、 0.640±0.011、0.593±0.026, Bax/Bcl-2为0.453±0.011,均低于空载体组(0.991±0.010、 0.926±0.006、 0.963±0.012、0.834±0.008)(F=2 850.0、 1 200.0、 359.3、 2 337.0, P 体组(0.924±0.016、 0.937±0.041、 0.807±0.032、 0.779±0.014)(F=24.7、 78.6、 154.9、 26

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白16 小鼠肺泡巨噬细胞凋亡信号转导和转录激活因子3/6

刚地弓形虫I型棒状蛋白16对肺腺癌细胞中程序性配体--1表达及其与程序性死亡蛋白1结合的影响

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中国血吸虫病防治杂志 2024年

作者：李光琪周毓宁马少寒田梅党甜甜赵志军宁夏回族自治区临床病原微生物重点实验室宁夏医科大学总医院医学实验中心宁夏回族自治区医学检验临床研究中心宁夏医科大学第一临床医学院

目的观察刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型棒状体蛋白16(rhoptry protein 16,ROP16）对肺腺癌细胞中程序性死亡配体-1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-LI）表达的影响，探索刚地弓形虫I型ROP16蛋白对肺腺癌细胞PD-L1相对表达量、细胞膜表... 详细信息

目的观察刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型棒状体蛋白16(rhoptry protein 16,ROP16）对肺腺癌细胞中程序性死亡配体-1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-LI）表达的影响，探索刚地弓形虫I型ROP16蛋白对肺腺癌细胞PD-L1相对表达量、细胞膜表面相对分布量及程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD1)PD-1/PD-L1结合的影响。方法分别构建过表达刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16蛋白慢病毒载体，并转染A549细胞系。以A549细胞为空白对照组，A549细胞转染慢病毒空表达载体为阴性对照组，过表达刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16蛋白的A549细胞为实验组。通过嘌呤霉素筛选稳定过表达细胞株并通过Western blotting、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR）及免疫荧光实验进行验证。利用Western blotting及RT-qPCR技术分别检测刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16蛋白过表达组及空白对照组、阴性对照组A549细胞中PD-L1表达水平，并通过流式细胞术对细胞膜表面PD-L1相对分布量进行检测。以酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）为原理设计PD-1/PD-L1表面结合实验，评估A549细胞内刚地弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白对PD-1/PD-L1结合的影响。结果空白对照组、阴性对照组及刚地弓形虫I、II、III型ROP16过表达组中ROP16蛋白相对表达量分别为0、0、（1.546±0.091）、（1.822±0.047）、（2.334±0.089),ROP16 mRNA相对表达量分别为（2.153±0.949）、（2.436±1.614）、（14.343±0.020）、（12.577±0.285）、（15.090±0.420），差异均有统计学意义（F=1 339.00、483.50,P均16过表达组中ROP16蛋白及m RNA表达水平均升高（P均16蛋白主要定位于细胞核中。空白对照组、阴性对照组及刚地弓形虫I、II、III型ROP16过表达组PD-L1蛋白相对表达量分别为（0.685±0.109）、（0589±0.114）、（1.007±0.117）、（0.572±0.151）、（0.426±0.116),PD-L1 m RNA相对表达量分别为（1.012±0.190）、（1.281±0.465）、（1.950±0.175）、（0.889±0.251）、（0.230±0.192），差异均有统计学意义（F=9.46、14.18,P均16过表达组PD-L1蛋白及mRNA表达水平均升高（P均16过表达组PD-L1蛋白在A549细胞膜表面相对分布量分别为（10.83±0.60）%、（11.23±0.20）%、（14.61±0.50）%，差异有统计学意义（F=28.31,P16蛋白过表组中PD-L1蛋白在细胞膜表面的相对分布量上调（P均蛋白浓度为0.04、0.08、0.12μg/mL时，刚地弓形虫Ⅰ型ROP16过表达组、空白对照组、阴性对照组细胞吸光度（absorbance,A）值差异均有统计学差异（F=10.45、11.68、52.68,P均16过表达组A值均高于空白对照组及阴性对照组（P均16蛋白以浓度依赖方式促进A549细胞中PD-L1与PD-1结合。结论过表达刚地弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白可在mRNA及蛋白水平上调A549细胞中PD-L1表达及在A549细胞膜表面的相对分布量，并以浓度依赖方式影响PD-1/PD-L1结合。

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白16 肺腺癌程序性死亡配体-1 程序性死亡蛋白1

刚地弓形虫ROP16-ROP18复合基因真核表达载体的构建

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中国病原生物学杂志 2017年第1期12卷 57-61页

作者：刘楠张晓磊郭玲玲张进顺贾晓晖刘荣荣河北北方学院病原生物学与免疫学研究所河北张家口075000

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)、棒状体蛋白18(TgROP18)复合基因真核表达重组质粒,并验证其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒pVAX1-ROP16与pVAX1-ROP18分别经EcoRⅠ和NotⅠ、NheⅠ和AflⅡ双酶切,将ROP16与ROP18基因先... 详细信息

目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)、棒状体蛋白18(TgROP18)复合基因真核表达重组质粒,并验证其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒pVAX1-ROP16与pVAX1-ROP18分别经EcoRⅠ和NotⅠ、NheⅠ和AflⅡ双酶切,将ROP16与ROP18基因先后克隆至双启动子真核表达载体质粒pVAXD的多克隆位点中,构建pVAXD-ROP16-ROP18重组质粒。分别用双酶切和PCR验证正确的重组质粒及对照组质粒转染Hela细胞,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板进行ROP16基因、ROP18基因与管家基因β肌动蛋白基因的RT-PCR扩增,采用间接免疫荧光法检测各自基因的表达。结果重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18经PCR及双酶切鉴定构建正确。转染后经RT-PCR检测,实验组与对照组β-肌动蛋白基因扩增产物均与预期大小相符,实验组ROP16基因、ROP18基因扩增产物分别为1 700bp和2 100bp,与预期大小相符,而对照组均未扩增出ROP16及ROP18基因。间接免疫荧光法检测显示,重组质粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18转染组细胞可见绿色荧光,空质粒及对照组无绿色荧光。结论成功构建了重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,该质粒可在真核细胞中表达。

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白16 棒状体蛋白18 复合重组质粒真核表达