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棉铃虫核多角体病毒iap3基因表达时相分析

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生物技术 2011年第5期21卷 13-16页

作者：梁昌镛李敏张高瞻扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225009

目的:原核表达棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)iap3基因,制备该蛋白的多克隆抗体,并利用该抗体分析iap3基因在病毒感染过程的表达时相,为深入研究提供基础。方法:PCR扩增iap3基因后,克隆至pET2... 详细信息

目的:原核表达棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)iap3基因,制备该蛋白的多克隆抗体,并利用该抗体分析iap3基因在病毒感染过程的表达时相,为深入研究提供基础。方法:PCR扩增iap3基因后,克隆至pET28b,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,利用亲合层析进行蛋白纯化,将纯化融合蛋白免疫大鼠制备抗血清,利用抗血清Western blot检测IAP3在病毒感染过程的表达时相。结果:成功在原核细胞中表达iap3基因,并获得纯化的融合His-tag的IAP3蛋白,制备了该蛋白的多克隆抗体。发现iap3基因最早在感染后24h表达,到72h到达表达高峰。结论:获得了IAP3多克隆抗体,iap3基因是一个晚期表达基因。

关键词：棉铃虫核多角体病毒 iap基因原核表达抗体表达时相

棉铃虫核多角体病毒泛素基因的克隆表达及抗体制备

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棉铃虫核多角体病毒泛素基因的克隆表达及抗体制备

作者：李京京华中师范大学

学位级别：硕士

泛素蛋白(Ubiquitin, Ubi)是由76个氨基酸组成的一种高度保守的小分子蛋白质,它以单体或与其他蛋白结合的形式广泛存在于各种真核生物中。泛素主要通过泛素-蛋白水解酶复合体通路(Ubiquitn-proteasome pathway, UPP)途径高效并高度选择... 详细信息

泛素蛋白(Ubiquitin, Ubi)是由76个氨基酸组成的一种高度保守的小分子蛋白质,它以单体或与其他蛋白结合的形式广泛存在于各种真核生物中。泛素主要通过泛素-蛋白水解酶复合体通路(Ubiquitn-proteasome pathway, UPP)途径高效并高度选择性地对细胞内蛋白进行完全或部分降解,尤其是短寿命的功能蛋白、变性变构蛋白、癌基因产物及某些调节因子和信号转导蛋白等。因此,它在DNA的修复、细胞周期运转、信号转导、转录水平上的调节、细胞内吞、抗原呈递、细胞凋亡等过程中具有非常重要的作用。在一些植物病毒和动物病毒中发现了泛素相关蛋白或泛素化病毒蛋白。已发现宿主的泛素分子共价连接到一些植物病毒上;磷脂类修饰的泛素包装入ASFV、VV、HSV等病毒粒子内;HSV-1的ICPO具泛素连接酶E3的活性,且具有两个E3连接位点,可结合不同的E2;一些逆转录病毒的出芽也与宿主泛素有关。昆虫杆状病毒和痘病毒是目前唯一编码泛素基因的病毒,所有病毒泛素基因编码N-末端泛素序列和1-256个氨基酸的C-末端多肽,在真核细胞泛素中起重要功能的残基在许多病毒泛素中很保守。目前对杆状病毒泛素蛋白的研究还处于初步阶段,其具体功能并不明确。本文采用PCR方法,根据已知HaSNPV泛素基因设计上游引物和下游引物,克隆了棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素基因。将该基因与pGEM-T载体连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,通过酶切鉴定阳性克隆。经序列分析表明,该泛素基因编码区全长252bp,编码83个氨基酸残基,预计分子量为9.24kDa。该基因在原核细胞表达系统中成功地进行了高表达。将泛素基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,成功构建了重组质粒pET-Ubi,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合蛋白,通过条带扫描分析表达量最高可达总蛋白的20%。用His-tag抗体检测目的蛋白,Westen-blot试验证明所表达的蛋白是带有His-tag的重组融合蛋白。

关键词：棉铃虫核多角体病毒泛素克隆原核表达抗血清

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棉铃虫核多角体病毒HA2蛋白表达分析

棉铃虫核多角体病毒HA2蛋白表达分析

作者：李世兴中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）

学位级别：硕士

棉铃虫核多角体病毒(Helicovapa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)的orf2基因(ha2)及其同源基因存在于大多鳞翅目昆虫的杆状病毒中，是真核生物WASP蛋白家族的同源基因。序列分析表明ha2基因长1242bp，编码414个氨基酸，预测蛋... 详细信息

棉铃虫核多角体病毒(Helicovapa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)的orf2基因(ha2)及其同源基因存在于大多鳞翅目昆虫的杆状病毒中，是真核生物WASP蛋白家族的同源基因。序列分析表明ha2基因长1242bp，编码414个氨基酸，预测蛋白质分子量为46.1kDa。HearNPV HA2具有WASP家族的保守功能区：Pro-rich区、WH2区、Acidic区以及Cofilin区。WASP又全称为威奥综合征蛋白(Wiscott-Aldrich syndrome protein)。WASP是参与微丝骨架运动细胞信号传递的重要中介蛋白，它激活Arp2／3蛋白复合体，促进Arp2／3与肌动蛋白的结合进而促进肌动蛋白的聚合。研究发现HearNPV HA2蛋白也具有类似WSAP蛋白的功能，可以促进宿主肌动蛋白的聚合。另外，在对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica NPV,AcMNPV)的研究中发现p78／83基因为ha2的同源基因。P78／83为核衣壳的结构蛋白，只能与F-actin特异性结合。AcMNPV通过P78／83蛋白模仿WASP蛋白激活Arp2／3复合物使肌动蛋白聚合，并进而形成肌动蛋白索结合于核衣壳，以推动其向细胞核的运输。研究中发现，在HearNPV的感染过程中可以检测到32，46和50kDa三种不同的HA2，推测是翻译后不同修饰的结果。AcMNPV P78／83也存在类似的现象。研究表明WASP的磷酸化是其活性调控的重要手段，其主要功能区VCA区的的两个丝氨酸位点S483和S484可被Casein kinase 2磷酸化。磷酸化后的WASP蛋白VCA区同Arp2／3的结合更加紧密，间接促进了肌动蛋白的聚合。开展对HA2不同翻译后修饰的分析及其对功能的调控，以及不同结构域的功能等具有重要的意义。因此，利用昆虫表达系统表达的了不同截短形式的HA2以期为日后HA2的功能研究打下基础。论文共包括三章：第一章对杆状病毒做了综述性介绍，包括杆状病毒的分类地位、形态结构、复制周期，重点介绍了杆状病毒在感染过程中与肌动蛋白的相互作用，同时还介绍了杆状病毒作为表达载体的优点及本研究的目的等。第二章利用蛋白质分析工具对HA2进行结构预测分析，预测出可能的蛋白修饰位点，为将来的功能研究分析打下良好的基础。第三章利用真核表达系统表达HA2蛋白。试验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中分别表达了含有不同功能区的系列截短的HA2蛋白。实验中共表达了四种蛋白，分别命名为HA2-VCA、HA2-385、HA2-580、HA2-785，为进一步研究HA2蛋白的结构与功能奠定基础。

关键词：棉铃虫核多角体病毒 HearNPV HA2 肌动蛋白 WASP 磷酸化蛋白修饰真核表达

棉铃虫核多角体病毒lef-3基因的序列分析

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中国病毒学 2002年第3期17卷 234-238页

作者：张小霞梁振普牛国栋张忠信丁清泉中国科学院武汉病毒研究所湖北武汉430071

在棉铃虫核多角体病毒 (HelicoverpaarmigeraSingle nucleocapsidNucleopolyhedrovirus ,HaSNPV)基因组中发现了lef 3基因 ,该基因位于病毒基因组的BamHⅠ F片段上 ,全长 114 0bp ,编码 379个氨基酸 ,预计蛋白质分子量为 4 4kD ,启动... 详细信息

在棉铃虫核多角体病毒 (HelicoverpaarmigeraSingle nucleocapsidNucleopolyhedrovirus ,HaSNPV)基因组中发现了lef 3基因 ,该基因位于病毒基因组的BamHⅠ F片段上 ,全长 114 0bp ,编码 379个氨基酸 ,预计蛋白质分子量为 4 4kD ,启动子区具有TATAbox ,位于起始密码子ATG上游 4 0～ 4 3nt处 ,在终止密码子下游具典型的 poly(A)终止信号AATAAA。并且在它的氨基酸序列的N

关键词：棉铃虫核多角体病毒 lef-3基因序列分析

棉铃虫核多角体病毒包埋型病毒粒子体外感染Hz-AM1细胞的研究

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棉铃虫核多角体病毒包埋型病毒粒子体外感染Hz-AM1细胞的研究

作者：姜婷中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）

学位级别：硕士

杆状病毒区别于其它病毒的一个重要的特点是在其生活史中具有两种不同的病毒形态:出芽型病毒粒子(budded virus, BV)和包埋型病毒粒子(occlusion derived virus, ODV)。这两种病毒粒子具有相同的核衣壳,但囊膜组成不同,这种差异赋予了BV... 详细信息

杆状病毒区别于其它病毒的一个重要的特点是在其生活史中具有两种不同的病毒形态:出芽型病毒粒子(budded virus, BV)和包埋型病毒粒子(occlusion derived virus, ODV)。这两种病毒粒子具有相同的核衣壳,但囊膜组成不同,这种差异赋予了BV和ODV具有不同的感染机制,发挥不同的功能。BV是进行组织和细胞之间感染的病毒形式,膜融合蛋白在感染过程中发挥重要作用;而ODV主要参与口服感染,目前为止,已经鉴定了四种与口服感染相关的基因( pif )。本文以棉铃虫核多角体病毒( Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus, HaSNPV)为研究对象,研究发现ODV同样能感染体外培养的昆虫细胞,并且感染效率受pH的影响;中和试验发现病毒pif基因(p74, pif-1, pif-2和pif-3)决定了HaSNPV ODV感染体外培养细胞的能力。另外,构建了重组棉铃虫核多角体病毒(vHa/lacZ),通过报告基因hsp70/lacZ可以在感染棉铃虫幼虫后经过解剖染色观察到病毒感染的进程,可用于进一步研究棉铃虫核多角体病毒的发病机理。论文第一章综述了杆状病毒的基本结构特点、感染周期、感染途径、感染后的病理变化以及主要结构基因与功能,其中着重介绍了杆状病毒口服感染的相关基因。另外,还介绍了杆状病毒作为真核表达系统的应用,以及在生物防治与基因治疗等方面的应用。第二章介绍了HaSNPV的包埋型病毒粒子感染体外培养的Hz-AM1细胞的研究,阐明了ODV可以感染体外培养的昆虫细胞,并且感染效率受pH值的影响,最高的感染效率在pH 8.0左右,当pH>8.0时感染效率逐渐降低。随后克隆并表达了p74和Ha111基因片段,制备了抗体,中和实验表明,HaSNPV p74, pif-1, pif-2和pif-3特异性的抗体单独均能中和HaSNPV ODV感染HzAM1细胞的能力,但仅在使用四种抗体时才表现协同作用,该结果说明口服感染相关基因(pif)同样参与了ODV感染体外培养的细胞。论文第三章介绍了重组杆状病毒vHa/lacZ的构建,并通过解剖染病幼虫初步研究了棉铃虫核多角体病毒的发病进程。

关键词：棉铃虫核多角体病毒包埋型病毒粒子口服感染相关基因(pif) 病毒中和实验重组杆状病毒vHa/lacZ

棉铃虫核多角体病毒泛素基因的克隆表达及抗体制备

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中国病毒学 2005年第3期20卷 298-302页

作者：李京京姚青杨东叶余泽华陈新文华中师范大学昆虫学研究所武汉430079 中国科学院武汉病毒研究所分子病毒学实验室武汉430071

昆虫杆状病毒和痘病毒是目前已知唯一编码泛素基因的病毒。通过PCR方法,克隆了棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素基因(Ubiquitin,Ubi)。序列分析表明,该基因编码区全长252bp,编码83个氨基酸残基,预计分子量为9.24kDa。将泛素基因克隆到原... 详细信息

昆虫杆状病毒和痘病毒是目前已知唯一编码泛素基因的病毒。通过PCR方法,克隆了棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素基因(Ubiquitin,Ubi)。序列分析表明,该基因编码区全长252bp,编码83个氨基酸残基,预计分子量为9.24kDa。将泛素基因克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pETUbi,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合蛋白。用Histag抗体检测目的蛋白,Westenblot实验证明所表达的蛋白是带有Histag的重组融合蛋白。通过改变IPTG浓度和诱导时间对表达条件进行了优化。利用NI琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化目的蛋白,SDSPAGE鉴定为单一条带,同时用提纯蛋白制备了特异性抗体,为进一步的研究打下基础。

关键词：棉铃虫核多角体病毒泛素克隆原核表达抗血清

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棉铃虫核多角体病毒基因库及其物理图谱

Virologica Sinica 1987年第1期 57-64页

作者：柯丽华吴远明中国科学院武汉病毒研究所中国科学院武汉病毒研究所武汉

本文报道棉铃虫核多角体病毒DNA经限制性内切酶BamHI酶解,琼脂糖凝胶电泳分离,得到大小不同的11种片段。所得片段与BamHI酶解的pBR质粒DNA进行体外重组并转化大肠杆菌LE392菌株。根据菌落杂交和插入片段的分子量等鉴定,证明获得11个插... 详细信息

本文报道棉铃虫核多角体病毒DNA经限制性内切酶BamHI酶解,琼脂糖凝胶电泳分离,得到大小不同的11种片段。所得片段与BamHI酶解的pBR质粒DNA进行体外重组并转化大肠杆菌LE392菌株。根据菌落杂交和插入片段的分子量等鉴定,证明获得11个插入了病毒DNA片段的重组质粒,但其中两个大片段克隆的分子量比原片段小。通过限制酶EcoRI和BamHI酶解片段的交叉吸印杂交及用p标记的克隆片段与病毒DNA酶解片段杂交等方法,构建了病毒基因组BamHI的物理图谱。杂交结果表明,病毒基因组主要由独特的序列组成。

关键词：酶解片段重组质粒 DNA 物理图谱菌落杂交格伦斯坦—霍格内斯法限制酶核酸酶 BamHI 棉铃虫核多角体病毒内切酶酶解基因组染色体组酶解产物病毒学

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棉铃虫核多角体病毒病的组织病理研究

昆虫学报 1978年第2期21卷 133-136页

作者： INSECT VIRUS LABORATORY, DEPARTMENT OP BIOLOGY, HUA-CHUNG TEACHERS COLLEGE, HUPEH 华中师院生物系昆虫病毒研究室

棉铃虫(Heliothis armigera)核多角体病毒(VHA-273),对寄主的主要病变,发生于三种敏感性组织,即脂肪体、表皮层、气管基质。这些组织可能同时被感染。中肠未被破坏,肌肉、马氏管、神经节等,

关键词：病变敏感性棉铃虫核多角体病毒病毒束包埋多角体病毒粒子病毒体病理研究

棉铃虫核多角体病毒VHA-273感染几种动物培养细胞的试验

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华中师院学报(自然科学版) 1981年第3期 88-93页

作者：陈曲侯王家坤余泽华彭建新华中师院生物系昆虫病毒研究室华中师院昆虫病毒研究室研究生

昆虫病毒作为杀虫剂的安全性问题是人们普遍关注的问题。为了从细胞水平探究它的安全性,本试验用多粒包埋型(MEV)的棉铃虫核多角体病毒VHA—273感染了两栖类,鸟类、哺乳类动物及人的细胞培养物,以观察病毒对这些细胞的致病性。同时还用... 详细信息

昆虫病毒作为杀虫剂的安全性问题是人们普遍关注的问题。为了从细胞水平探究它的安全性,本试验用多粒包埋型(MEV)的棉铃虫核多角体病毒VHA—273感染了两栖类,鸟类、哺乳类动物及人的细胞培养物,以观察病毒对这些细胞的致病性。同时还用这种病毒感染了该病毒的宿主细胞——棉铃虫卵巢细胞,作为对照。实验结果表明:除棉铃虫卵巢细胞中出现了病变并复制出了多角体外,所感染的其它各种细胞均未发现细胞瘸变和病毒增殖。

关键词：卵巢细胞培养细胞 VHA-273 棉铃虫核多角体病毒人胚肺细胞动物