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棉铃虫单核衣壳核多角体病毒bro基因的研究

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棉铃虫单核衣壳核多角体病毒bro基因的研究

作者：陈明明中国科学院研究生院(武汉病毒研究所)

学位级别：硕士

本论文选择棉铃虫杆状病毒(HaSNPV)中的三个杆状病毒重复开放阅读框（bro基因）进行了研究, 论文包括四个章节：第一章对杆状病毒和杆状病毒重复开放阅读框（bro基因）近年的研究进展作了简要综述，并对本研究的背景和目的意义作了简... 详细信息

本论文选择棉铃虫杆状病毒(HaSNPV)中的三个杆状病毒重复开放阅读框（bro基因）进行了研究, 论文包括四个章节：第一章对杆状病毒和杆状病毒重复开放阅读框（bro基因）近年的研究进展作了简要综述，并对本研究的背景和目的意义作了简要介绍。第二章对HaSNPV的三个bro基因进行了序列分析、克隆、原核表达与多克隆抗体制备。根据HaSNPV基因组全序列，设计引物，用PCR的方法扩增得到bro-a、bro-b和bro-c三个全长基因。将这三个基因的片段分别克隆至原核表达载体pProExHTb，在*** DH5α菌株中得到了高效表达。表达的目的蛋白大小分别为32 kDa、64 kDa和58 kDa，经SDS-PAGE分离纯化，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，1:2500倍稀释后用于Western Blot分析，获得特异性显色信号，所制备的三种抗体适合用作bro基因的功能的进一步研究。第三章对HaSNPV感染HzAM1细胞时三个bro基因的转录和表达时相进行了分析。RT-PCR结果显示，bro-a、bro-b和bro-c基因的转录分别开始于病毒感染细胞后6小时、12小时和4小时。Western Blot结果显示，bro-a、bro-b、bro-c基因的表达分别能在感染后24、16、4小时检测到。三个bro基因的转录和表达都能一直持续到感染后96小时, 其中bro-a和bro-b基因的转录和表达在感染后48小时达到峰值。第四章研究内容为构建HaSNPV中三个bro基因缺失（插入失活）的重组病毒。为构建缺失bro-a和bro-b基因的重组病毒，我们选择缺失基因组中4.35kb的hr2～bro-a～bro-b～hr3区段。为此，我们成功构建了一个缺失转移载体pCMM 1，尝试了传统的共转染HzAM1细胞系和线性片段在***中与HaBacHZ8进行同源重组等两种方法，均未成功。由于hr序列的复杂性和缺失片段较长等多方面因素，暂时不能下结论hr2～bro-a～bro-b～hr3区段对于病毒的增殖和复制是否必需。对于bro-c基因，对前期构建的HaBacHZ8随机转座子突变文库进行了筛选，得到一个阳性的插入突变子，命名为HaBacEa3，经过PCR、基因组酶切和测序反应验证无误，多次转染HzAM1细胞系未成功，因此推测bro-c基因有可能对于病毒的复制是必需的。

关键词：棉铃虫单核衣壳核多角体病毒杆状病毒重复开放阅读框 bro-a bro-b bro-c

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)Hind III-L片段的序列分析

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中国病毒学 2001年第4期16卷 355-360页

作者：方明刚陈新文王汉中 Just M Vlak 胡志红中国科学院武汉病毒所无脊椎动物病毒学联合实验室湖北武汉430071 Lab of Virology

本文报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (Helicoverpaarmigerasingle nucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)基因组的HindIII L片段的全序列。该片段全长 2 6 35bp ,包括 5个有意义的开放阅读框 :HaSNPVORF2 2 7,晚期表达因子 10基因 (lef10 ) ,vp10 5 4基因 ,Ac5 5 (AcMNPVORF5 5的同源基因 ) ,Ac5 6 (AcMNPVORF5 6的同源基因 )。与其它 6种杆状病毒的氨基酸序列比较表明 ,HaSNPV的lef10基因与甜菜夜蛾核型多角体病毒 (SeMNPV)的同源性最高 ,为6 4 % ,与冷杉毒蛾核型多角体病毒 (OpMNPV)的同源性最低 ,为 4 3% ;HaSNPV的vp10 5 4基因与SeMNPV的同源性最高 ,为 6 5 % ,与OpMNPV的同源性最低 ,为 4 9%。序列比较表明 ,HaSNPV的LEF10与VP10 5 4蛋白与其它 6种杆状病毒具有相同的保守区和亮氨酸拉链 (leucinezipper)

关键词：棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 lef10基因 vp1054基因序列分析 HindⅢ-L片段

棉铃虫病毒HaSNPVfp25k基因的克隆表达及抗体制备

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中国病毒学 2004年第4期19卷 380-384页

作者：吴东邓菲胡志红袁丽孙修炼中国科学院武汉病毒研究所分子病毒学实验室

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpaarmigerasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)fp25k基因的序列,设计引物,引入适当的酶切位点,利用PCR扩增出基因片段。将该基因片段克隆至原核表达载体pProEXHTb,经IPTG诱导,在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达,表达产物的大小为32kDa。纯化蛋白产物免疫家兔制备抗血清。该抗血清可与原核表达的GST-FP25K融合蛋白及在感染的昆虫细胞中表达的FP25K蛋白发生特异性免疫反应。该抗体的获得为深入研究FP25K蛋白的功能提供了基础。

关键词：棉铃虫单核衣壳核多角体病毒基因克隆表达抗体杆状病毒

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基因芯片检测HearNPV基因组转录谱

基因芯片检测HearNPV基因组转录谱

作者：韩霄中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）

学位级别：硕士

本论文构建了基因芯片分析棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HearNPV)基因组转录谱，并对病毒基因组位置依赖的转录模式进行了探索性研究。第一章：文献综述。简要介绍了... 详细信息

本论文构建了基因芯片分析棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HearNPV)基因组转录谱，并对病毒基因组位置依赖的转录模式进行了探索性研究。第一章：文献综述。简要介绍了杆状病毒以及HearNPV的分子生物学研究进展;对基因芯片技术应用进行了大致的介绍，重点描述了基因表达的化学振荡以及信号处理方法在芯片数据挖掘中的应用;详细介绍了杆状病毒基因芯片的研究进展;最后叙述了本论文的目的和意义。第二章：HearNPV基因芯片的构建。我们针对HearNPV135个ORF设计了Affimetrix寡核苷酸基因芯片，并且通过预实验验证了该芯片能够有效的检测杆状病毒HearNPV所有预测ORF的转录情况。第三章：基因芯片检测HearNPV转录谱。我们利用构建的基因芯片检测了HearNPV G4株感染HzAMI细胞19个时间点的转录谱时相，同时运用实时荧光定量PCR对芯片数据进行了验证。依据芯片转录谱数据将基因按转录起始时间分为了三类：8小时以前、10-18小时、18小时以后。分类分析结果印证了杆状病毒在转录过程中具有宿主RNA聚合酶和自身编码RNA聚合酶两个阶段，而且符合杆状病毒BV—ODV的时序过程。同时我们运用了单值分解HearNPV的转录模式关系，发现ie-1、cg30等基因在转录过程中起着重要的作用，很可能直接决定了其他基因的表达行为。第四章：HearNPV基因组表达模式研究。通过独立分量和小波方法分析HearNPV基因组在转录过程中的基因组位置效应。发现HearNPV基因组在转录过程中存在着25kb的长程模式，且同源重复区(hr)明显的位于模式的峰谷对称中心。推测hr通过一定的DNA环状结构的增强子作用造成了这一长程模式，并由于其环状的结构使得HearNPV基因组分隔为了5个不同的DNA反应器。HearNPV的DNA反应器是由DNA脱氧核糖核酸介质构成，其GC含量行走具有分形特性，不同的反应器具有从1.13到1.23不同的分形维数。该分形维数与基因组转录模式的幅度相关性为0.93。推测DNA反应器产生的生物化学反应是一个分形介质反应过程，影响了基因表达噪音的产生。

关键词：基因芯片转录谱基因组位置效应棉铃虫单核衣壳核多角体病毒

棉铃虫核多角体病毒的两个保守基因Ha94与Ha132的功能分析

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棉铃虫核多角体病毒的两个保守基因Ha94与Ha132的功能分析

作者：方明刚中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）

学位级别：硕士

本文首次对HaSNPV的两个杆状病毒保守基因Ha94和Ha132的功能进行了研究，并报道了HaSNPV基因组的HindⅢ-L片段的序列分析结果。本论文包括4章。第一章对杆状病毒的研究作了综述性介绍，包括对杆状病毒的分类地位、基因组特征、已... 详细信息

本文首次对HaSNPV的两个杆状病毒保守基因Ha94和Ha132的功能进行了研究，并报道了HaSNPV基因组的HindⅢ-L片段的序列分析结果。本论文包括4章。第一章对杆状病毒的研究作了综述性介绍，包括对杆状病毒的分类地位、基因组特征、已报道过的完全保守基因的功能、应用作了概括性地描述，对本文的研究目的作了简要的描述。第二章报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)基因组的HindⅢ-L片段的全序列。该片段全长2635 bp，包括5个有意义的开放阅读框：HaSNPV ORF227，晚期表达因子10基因(lef10)，vp1054基因，Ac55(AcMNPV orf55的同源基因)，Ac56(AcMNPV orf56的同源基因)。第三章对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)的Ha94基因的功能进行了研究。HA94与AcMNPV orf109同源，是杆状病毒的保守基因。序列分析表明，Ha94基因长1086bp，预计编码362个氨基酸，预测蛋白质分子大小为41.5 kDa。在其起始密码子上游-65nt发现杆状病毒晚期启动子转录起始信号ATAAG，在其终止密码子下游-14nt发现polyA加尾信号AATAAA。为阐明它的功能，在大肠杆菌中将Ha94与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达。被表达的融合蛋白质经纯化后，注射免疫家兔获得抗体。在HaSNPV感染的HzAM1细胞中研究了这个基因的转录和表达特征。RT-PCR结果表明Ha94是一个晚期基因，在感染后24小时开始检测到病毒的转录产物，持续到表达至96小时。对HaSNPV感染的HzAM1细胞的样片进行Western blot分析，从感染后48 h到96 h检测到一条43kDa大小的特异蛋白质带。为证明HA94是HaSNPV的一个结构蛋白，对来自BV和ODV的总蛋白质进行Western blot分析，结果表明HA94蛋白质在ODV而不是在BV中检测到。将ODV进一步分成核衣壳和囊膜成份后，Western blot分析表明HA94是核衣壳与囊膜的共有结构成份。现有结果证明H894编码HaSNPVODV的一个结构蛋白质(ODV-EC43)。第四章对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)的Ha132基因的功能进中国科学院硕土毕业论义 HaSNPV Ha94与 Haj32的功能分析行了研究。HaSNPV的HA132与AcWPV 0RF22同源，是杆状病毒的保守基因，并且在不同的杆状病毒中的保守性较高。序列分析表明 HaSNPV Ha132基因长 11 52hp，预计编码 384个氨基酸，预测蛋白质分子大小为 44．5 kDa。软件预测 0RF132有一个信号肽序列（signal peptide），最可能的切割位点在＊和R20之间。在其起始密码子上游－12 nt发现晚期启动子转录起始信号 TTAAG。为阐明它的功能，在大肠杆菌中将Ha132与谷肤甘肽疏基转移酶（GST）融合表达。纯化被表达的融合蛋白质，注射免疫兔子获得抗体。在HaSNPV感染的HzAMI细胞中研究这个基因的转录和表达特征。No，them blot 结果表明 HaI32是一个晚期基因，在病毒感染后72 d＼时产生多个转录产物。被HaSNPV感染的HzAMI细胞的Western blot分析发现，从感染后48 h yg 96 h检测到一条 43kDa大小的蛋白带。对来自 BV和ODV的总蛋白质进行Western blot分析，结果表明HA132 蛋白不是HaSNPV病毒粒子的结构成份。通过在大肠杆菌内同源重组构建得到 ORF132 的缺失重组病毒（HaSNPV凸132），转染成功后的电镜切片表明，HaSNPV 凸132能够在HZAMI细胞内正常复制、增殖。缺失实验表明HA132不是HaSNPV 正常复制所必需的。

关键词：棉铃虫单核衣壳核多角体病毒保守基因 Ha94 Ha132 功能分析

棉铃虫核多角体病毒解螺旋酶（helicase）基因的序列分析和含有HaSNPV同源重复区亚克隆的构建

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棉铃虫核多角体病毒解螺旋酶（helicase）基因的序列分析和含有Ha...

作者：范凌云中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）

学位级别：硕士

对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigerd single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HaSNPV)基因组中EcoRI—N片段进行序列分析，获得了完整的解螺旋酶基因(hel)，其开放阅读框大小为3762bp，编码一个分子量为146kDa的蛋白质。在hel起始密码子ATG上游50位有强晚期启动子转录起始信号ATAAG，在—112位和—189位存在两个TATA box，但未发现早期转录信号CAGT。其在终止密码子下游第12位有—PolyA终止信号AATAAA。HaSNPV解螺旋酶与其它5种杆状病毒解螺旋酶相比，有5个基元序列(Ⅰ、Ⅰa、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)保守，另外两个(Ⅴ和Ⅵ)完全不保守。同源性比较发现HaSNPV解螺旋酶的氨基酸序列与甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigue MNPV，SeMNPV)的解螺旋酶具有最高的同源性(66％)，与Xestia c-nigrum颗粒体病毒(XcGV)解螺旋酶同源性最低(43％)，HaSNPV解螺旋酶基因是第一个报道的单粒包埋核多角体病毒的解螺旋酶基因。在HaSNPV基因组中存在5个同源重复区hr,它们可能对病毒的复制和转录调控等起重要作用。对HaSNPV的5个hr区域进行了亚克隆，为进一步的功能研究奠定了基础。

关键词：棉铃虫单核衣壳核多角体病毒解螺旋酶基因同源重复区

棉铃虫核多角体病毒特有基因Ha34，Ha99的鉴定和杆状病毒类蜗牛毒素的初步功能研究

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棉铃虫核多角体病毒特有基因Ha34，Ha99的鉴定和杆状病毒类蜗牛毒...

作者：冯纵棣中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）

学位级别：硕士

本论文共包括5章。第一章对杆状病毒近几年的研究进展作了简单的综述，主要侧重于杆状病毒在理论研究和实际中的应用;并对本研究的目的意义作了简要的介绍。第二章报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)XbaⅠ-Ⅰ片段的序... 详细信息

本论文共包括5章。第一章对杆状病毒近几年的研究进展作了简单的综述，主要侧重于杆状病毒在理论研究和实际中的应用;并对本研究的目的意义作了简要的介绍。第二章报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)XbaⅠ-Ⅰ片段的序列结构。该片段在基因组上定位于18.4-22.8 m.u.，包括8个完整的开放阅读框架和p47的5’端部分序列。其中ubiquitin等7个基因是杆状病毒的同源基因，另外两个orf507和orf1080是HaSNPV的特有基因。对以上各基因进行了深入的序列比较。第二章对棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)的一个未知功能基因Ha34进行了鉴定。Ha34是HaSNPV的一个特有基因，定位于基因组XbaⅠ-Ⅰ片段，共1080个核苷酸，预测的蛋白分子量为41.2kDa。RT-PCR的结果显示，Ha34基因的转录开始于感染后24小时，一直持续至96小时。对Ha34进行了原核表达并制备了相应的抗体，用该抗体对感染HaSNPV的HzAM1细胞进行了Western blot检测。Ha34在基因组中的位置是其它杆状病毒基因组特有基因经常出现的地方，暗示该基因所处的位置是进化的热点。第四章对HaSNPV的另一个特有基因Ha99进行了初步鉴定。Ha99定位于病毒基因组的94.5-94.9kbp处。对Ha99基因作了相关的计算机分析，用RT-PCR方法从mRNA水平上对该基因进行了鉴定，证明是一个晚期基因。3’RACE的结果表明转录终止于终止密码子TGA下游4 bp处。为了检测其表达产物，进行了Ha99的原核表达并制备了多克隆抗体，对病毒感染的HzAM1细胞、病毒的BV和ODV进行了蛋白杂交检测。杆状病毒类蜗牛毒素是一类小分子肽，在AcMNPV、LdMNPV和BusuNPV等一些杆状病毒基因组中存在，但其确切的生物学功能尚不清楚。第五章利用杆状病毒Bac-to-Bac系统构建了含有油桐尺蠖核多角体病毒的类蜗牛毒素基因的重组病毒rAcBacCTL和rHaBacCTL，在其相应宿主甜菜夜蛾和棉铃虫的细胞水平和虫体水平进行了超表达实验。为了研究毒素在虫体中的定位，构建了类蜗牛毒素和增强的绿荧光蛋白融合的重组病毒rAcBacCTLGFP2和rHaBacCTLGFP，为下一步研究奠定了基础。

关键词：棉铃虫单核衣壳核多角体病毒特有基因 Ha34 Ha99 ctl