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陆地棉抗棉蚜QTL-qRAD04.1的克隆和功能分析

陆地棉抗棉蚜QTL-qRAD04.1的克隆和功能分析

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作者：安秋双石河子大学

学位级别：硕士

【目的】棉蚜(Aphis gossypii Glover),作为一种危害极大的世界性棉花害虫,在我国大多数棉花产区均有发生,严重威胁着我国棉花的产量和品质。目前,在棉花中关于棉蚜抗性基因挖掘的研究还比较少,这严重影响了我国棉花抗虫育种的发展。因... 详细信息

【目的】棉蚜(Aphis gossypii Glover),作为一种危害极大的世界性棉花害虫,在我国大多数棉花产区均有发生,严重威胁着我国棉花的产量和品质。目前,在棉花中关于棉蚜抗性基因挖掘的研究还比较少,这严重影响了我国棉花抗虫育种的发展。因此,挖掘棉蚜抗性相关基因和解析其分子机制对棉花的抗虫育种和提高棉花的产量和品质具有重要意义。【方法】在本研究中鉴定获得了两份对棉蚜表现出极端表型的材料,分别为Z50(高感ZS)和Z61(高抗HR)。并以其为亲本构建了一个包含有600个有效个体的F2分离群体。以虫口数量为主要抗性指标,从F2分离群体中筛选出83株对棉蚜的抗性表现出差异的极端材料(ZS:41个,HR:42个)。对83株极端材料及两亲本进行单株简化基因组测序(ddRAD),并利用GEMMA(Version 0.94.1)软件中的混合线性模型进行全基因组连锁分析。随后,对亲本材料进行了蚜虫侵染并进行转录组测序分析。结合QTL定位与转录组测序结果,筛选候选基因,并通过VIGS对候选基因进行功能验证。【结果】(1)基于ddRAD-seq全基因组连锁分析定位棉花抗棉蚜QTL通过混合线性模型计算共获得了4个超过了阈值的QTL(Quantitative Trait Locus),分别位于Chr A09、Chr D04、Chr D07和Chr D10染色体上。因此,我们分别将他们命名为q RAA09.1、q RAD04.1、q RAD07.1和q RAD10.1。其中,在Chr D04染色体上确定了一个主效的QTL,候选区间为40.67-50.14MB,LOD值为5.99,解释了27%的表型变异率。借助参考基因组数据,确定了该区间内共包含460个编码基因。(2)基于转录组分析和氨基酸变异鉴定陆地棉抗棉蚜候选基因结合QTL定位结果进行转录组分析发现,在候选区间内共有18个基因在两个极端材料中显著差异表达,其中GH04G1280、GH04G1369、GH04G1126、GH04G1418和GH04G1459在高抗亲本中的表达量显著高于高感亲本。此外,对五个候选基因进行序列分析发现,高感亲本的GH04G1418基因第四个外显子上存在一个10bp插入,导致其蛋白质序列的第280个氨基酸开始发生了突变并在第300个氨基酸处发生了翻译的提前终止。同时,该候选基因与拟南芥漆酶基因家族成员At LAC4最同源,并具有漆酶保守结构域,进一步的系统发育树分析也发现GH04G1418与At LAC4和Gh LAC4聚集在一起。这些结果表明GH04G1418是棉花中的一个漆酶基因。因此,我们将其命名为Gh LAC4-3。(3)棉蚜抗性候选基因Gh LAC4-3的VIGS验证及功能解析为了验证上述结果,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)对Gh LAC4-3基因进行基因沉默,并进行了蚜虫的选择和非选择性取食试验。结果发现沉默植株对蚜虫的敏感性更高,说明Gh LAC4-3基因参与到棉花对棉蚜的抗性过程中。根据前人研究进展发现,植物漆酶基因主要参与细胞壁中木质素的积累。因此,我们进一步对Gh LAC4-3基因沉默植物和对照植物进行了木质素的组织染色和含量测定。结果发现,与对照植株相比,沉默植株的木质素组织染色明显较浅,叶片和茎中木质素的含量也显著降低。根据这些结果,我们利用q RT-PCR对6个木质素关键合成基因进行表达量检测发现,与对照植株相比,Gh LAC4-3基因沉默植物中6个木质素合成关键基因的表达量均发生显著下降。【结论】本研究通过ddRAD-seq和混合线性模型确定了4个棉蚜抗性QTLs(q RAA09.1、q RAD04.1、q RAD07.1和q RAD10.1)。结合RNA-seq、氨基酸变异和功能注释,筛选出关键候选基因Gh LAC4-3。通过VIGS试验发现,Gh LAC4-3能够通过调控棉花细胞壁内木质素的积累,进而影响棉花对棉蚜的抗性。本研究的结果为抗虫棉花的定向培育和抗虫育种提供了重要的候选基因和理论基础,同时也丰富了漆酶家族的功能研究及在植物抗虫中的重要性。

关键词：棉花棉蚜抗性 ddRAD-seq 转录组分析植物漆酶

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