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诺维氏梭菌的培养、鉴定方法的建立及其α毒素单克隆抗体和多克隆抗体的制备

诺维氏梭菌的培养、鉴定方法的建立及其α毒素单克隆抗体和多克隆...

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作者：孟德志山东农业大学

学位级别：硕士

诺维氏梭菌(Clostridium novyi)曾被称为水肿梭菌(Clostridium oedematiens)、水肿杆菌、第二型恶性水肿杆菌、巨大杆菌和水牛梭菌等,它是羊黑疫的致病菌。诺维氏梭菌广泛存在于自然界特别是土壤之中,饲草被芽胞体污染后,经羊采食,芽胞... 详细信息

诺维氏梭菌(Clostridium novyi)曾被称为水肿梭菌(Clostridium oedematiens)、水肿杆菌、第二型恶性水肿杆菌、巨大杆菌和水牛梭菌等,它是羊黑疫的致病菌。诺维氏梭菌广泛存在于自然界特别是土壤之中,饲草被芽胞体污染后,经羊采食,芽胞从胃肠壁经目前尚未阐明的途径到达肝脏引起发病。羊、牛均可感染。该菌可以使1岁以上的绵羊发病,山羊也可以患此病,牛仅偶发感染。由诺维氏梭菌引起的羊黑疫发病急,死亡快,家畜往往还没有表现出明显症状就死亡,部分病例可拖延1 d,但没有超过3 d的,给畜牧业带来了巨大损失。因此,亟需建立在羊群快速鉴定诺维氏梭菌的血清学检测技术,如ELISA诊断方法等。诺维氏梭菌属严格厌氧菌,其生长繁殖对营养要求和环境要求高,常见的培养基不能满足其需要。为了获得高密度的细菌培养物,满足实验室或疫苗生产的需要,须合成新的培养基;为了制备新的诊断试剂盒如ELISA试剂盒等,须制备天然毒素、单克隆抗体、多克隆抗体;为了获得单克隆抗体和多克隆抗体,在天然毒素获得困难的情况下,须用重组蛋白代替天然毒素。该病死亡快,为了实现现场在羊群快速诊断,制备了诺维氏梭菌重组蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体,为构建ELISA诊断方法等快速检测技术奠定了基础。本研究的主要目标包括以下四个方面:探索诺维氏梭菌新型增菌培养基;设计合适引物对诺维氏梭菌进行PCR鉴定;诺维氏梭菌天然毒素的SDS-PAGE鉴定;利用重组诺维氏梭菌ɑ毒素制备单克隆抗体和多克隆抗体。α毒素为A、B型诺维氏梭菌产生的主要致死性毒素,本研究首先选取合适的目的片段,对密码子进行优化后生物合成目的片段,通过原核表达,镍柱纯化后,得到了相对较纯的重组诺维氏梭菌α毒素,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对所获得的重组蛋白进行蛋白纯度检测。使用镍柱纯化的方法纯化重组蛋白对单克隆抗体的制备和多克隆抗体的制备起了至关重要的作用。本研究使用纯化的重组α毒素蛋白对6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫,于加强免疫3 d后取免疫小鼠脾脏细胞,将其与骨髓瘤细胞F0进行细胞融合。使用间接ELISA的方法来筛选,使用有限稀释亚克隆的方法成功获得了2株能够稳定分泌针对诺维氏梭菌α毒素重组蛋白的阳性杂交瘤细胞株。本研究选取生长状态好的阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内,待小鼠腹部自然膨大后收集腹水。所收集的腹水使用正辛酸-硫酸铵纯化方法进行纯化,从而获得针对诺维氏梭菌α毒素重组蛋白的单克隆抗体。本研究成功制备了2株针对诺维氏梭菌α毒素重组蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为1978CT716.15.65、1978CT142.38.7。对所得2株杂交瘤细胞分泌的抗体进行间接ELISA测抗体效价,纯化后的腹水抗体效价,最高可达到1:512000。对所获得的两株杂交瘤细胞进行Western Blot分析可知,两种单克隆抗体均能与重组蛋白发生特异性结合。鉴于单克隆抗体具有生物活性单一、纯度相对比较高且与抗原结合特异性强等优势,我们可以利用单克隆抗体达到快速检测疾病及治疗疾病的目的。本研究将制备的针对诺维氏梭菌α毒素重组蛋白单克隆抗体进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和免疫印迹(Western-blot)分析,进一步验证了该单克隆抗体的纯度和反应原性。本研究为构建快速检测诺维氏梭菌的检测技术和检测方法奠定了基础。

关键词：诺维氏梭菌 α毒素单克隆抗体 ELISA 梭菌病诊断

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产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的制备及鉴定

产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的制备及鉴定

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作者：李翠松山东农业大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌(***)又名魏氏梭菌是一种广泛分布于自然界和动物肠道中的细菌,属于条件性致病菌。可产生多种外毒素和酶类,其主要毒素是α、β、ε和ι,其中β毒素具有较强的神经毒性、细胞毒性和致死性。能够引起羊猝狙,犊牛、羔羊、仔... 详细信息

产气荚膜梭菌(***)又名魏氏梭菌是一种广泛分布于自然界和动物肠道中的细菌,属于条件性致病菌。可产生多种外毒素和酶类,其主要毒素是α、β、ε和ι,其中β毒素具有较强的神经毒性、细胞毒性和致死性。能够引起羊猝狙,犊牛、羔羊、仔猪肠毒血症,以及人和动物坏死性肠炎。在家畜感染造成快速的发病死亡,因此,称其为‘家畜猝死症’。在多种畜禽和野生动物发病,尤其3周内的幼小动物更易感染,给我国畜牧业造成了严重的损失。在80年代中期,我国曾经广泛而严重的爆发流行,后因抗生素的使用,使得该病的流行受到一定程度的抑制,有时临床症状不明显,但是仍有大量的报道。农业部将其列为二类传染病。本研究的主要目的是利用较纯的产气荚膜梭菌β毒素制备单克隆抗体。B、C型产气荚膜梭菌产生β毒素主要致死性毒素,但是C型菌也产生少量的α毒素。本研究首先采用了SephadexG-25对粗提的产气荚膜梭菌外毒素进行除盐,然后又通过SephadexG-200对浓缩液进行提纯的方法,最后得到了相对较纯的β毒素。我们将纯化的β毒素通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对分离的蛋白纯度进行检测。所以采用该方法纯化的蛋白对单克隆抗体的制备起了很重要的作用。本研究采用了天然纯化的β毒素对6-8周龄的BALB/c小鼠进行免疫,加强免疫3天后取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行细胞融合。经过间接ELISA筛选和有限稀释亚克隆法获得了2株稳定分泌针对C型产气荚膜梭菌β毒素的阳性的杂交瘤细胞株。将生长状态良好的阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内,待小鼠腹部膨大后收集腹水。采用正辛酸-硫酸铵纯化方法进行纯化腹水,从而获得产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体。本实验成功获得了两株抗β毒素的杂交瘤细胞,分别命名为1G7、2F4。对所得到的两株抗β毒素的杂交瘤细胞分泌的抗体经过间接ELISA方法可知,小鼠腹水中单抗的效价显著高于杂交瘤细胞上清的抗体效价,最高可达到1:102400。经过Western Blot分析可知两种单克隆抗体均能与天然纯化的β毒素发生特异性反应,而与其他的毒素不发生反应。单克隆抗体具有生物活性单一、纯度高、与抗原结合的特异性强等优点,我们可以用单克隆抗体很快的检测疾病及治疗疾病。进而将制备的抗β毒素单克隆抗体通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)实验进一步验证了抗β毒素单克隆抗体的纯度和反应原性。为下一步快速构建有效检测产气荚膜梭菌毒素类型的检测技术方法奠定了基础。该方法在疫病快速检测、食品安全等方面具备很好的应用前景。

关键词：产气荚膜梭菌 β-毒素单克隆抗体构建ELISA诊断技术梭菌病诊断

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