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桔梗DXS基因的原核表达、亚细胞定位和酶活性分析

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药学学报 2023年第4期58卷 1059-1068页

作者：董楠余函纹刘梦丽李景陈博文常相伟王举涛查良平桂双英安徽中医药大学药学院安徽合肥230012 安徽省中医药科学院药物制剂研究所安徽合肥230012 现代药物制剂安徽省教育厅工程技术研究中心安徽合肥230012 药物制剂技术与应用安徽省重点实验室安徽合肥230012

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase,DXS)是甲基赤藓醇磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径中催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸缩合生成1-脱氧-木酮糖-5-磷酸(DXP)的第一个关键酶。本研究通过反转录·聚合酶链反应(RT-PCR)从桔梗根中克隆得到PgDXS1、PgDXS2、PgDXS3基因,开放阅读框(ORF)全长分别为2160、2208和2151 bp,分别编码719、735、716个氨基酸,同源氨基酸序列分析表明桔梗与橡胶树、曼陀罗及甜菊的DXS基因编码的氨基酸序列具有较高同源性;进一步构建原核表达载体pET-28a-PgDXSs,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功诱导3个DXS蛋白的表达。亚细胞定位结果显示,PgDXS1和PgDXS2蛋白主要定位于叶绿体中,PgDXS3蛋白定位于叶绿体、细胞核和细胞质中。运用实时荧光定量PCR检测3个DXS基因在2个产区不同组织中的表达水平,结果表明3个DXS基因均在太和桔梗叶中高表达。在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导处理下,PgDXS1、PgDXS2、PgDXS3基因表达水平在不同诱导的时间点(3~48 h)呈现先降低后增高的趋势;酶活性检测结果显示:桔梗的3个组织中DXS酶活性在MeJA处理后不同的时间点也呈现先增加后降低的趋势。本研究为进一步阐明桔梗中萜类化合物合成途径PgDXS基因的生物学功能提供参考。

关键词：桔梗 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因克隆原核表达亚细胞定位酶活性分析

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桔梗叶绿体比较基因组学分析及系统发育研究

中草药 2023年第15期54卷 4981-4991页

作者：张瑜杜晨晖詹海仙尚彩玲李瑞锋原淑佳山西中医药大学中药与食品工程学院山西晋中030619

目的以桔梗Platycodon grandiflorus为材料,分析其叶绿体基因组特征,探究不同地区桔梗叶绿体基因组的差异及桔梗科其他物种的系统发育关系。方法利用IlluminaNovaSeq测序平台对桔梗叶绿体全基因组进行测序,完成其组装、注释和特征分析,... 详细信息

目的以桔梗Platycodon grandiflorus为材料,分析其叶绿体基因组特征,探究不同地区桔梗叶绿体基因组的差异及桔梗科其他物种的系统发育关系。方法利用IlluminaNovaSeq测序平台对桔梗叶绿体全基因组进行测序,完成其组装、注释和特征分析,采用生物信息学方法对不同地区桔梗进行比较基因组分析和系统发育分析。结果桔梗叶绿体基因组全长172770bp,呈现典型的环状四分体结构,总GC含量为38.10%,注释到139个基因,其中蛋白质编码基因95个,核糖体RNA8个和转运RNA36个。经序列分析鉴定出139个SSR位点,大部分重复由A和T组成。该叶绿体基因组密码子偏好性A/U大于G/C。边界分析表明,不同地区桔梗的JLA边界区域存在差异。对比不同地区桔梗叶绿体基因组序列发现21个变异区间,包括ycf1、psbC、rps18和rpoB等编码区以及rpl32-trnL、trnS-psbZ和trnN-ycf1等非编码区。基于最大似然法(maximum likelihood method,ML)对桔梗及其他17种桔梗科植物进行系统发育分析,发现桔梗科物种形成一个单系群,各属物种聚为一束,支持率达100%。结论桔梗科物种聚为一支与传统相符合,不同地区桔梗叶绿体基因组序列存在显著差异,为后期开展分子鉴定及群体遗传学研究提供提供科学依据。

关键词：桔梗叶绿体基因组序列比对系统发育 SSR

桔梗萜类合成途径PgMCS和PgHDR基因克隆与原核表达分析

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植物生理学报 2022年第3期58卷 533-542页

作者：李景刘梦丽余函纹周卓常相伟王举涛查良平桂双英安徽中医药大学药学院合肥230012 安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所合肥230012 安徽省中医药科学院药物制剂研究所合肥230012 安徽省教育厅现代药物制剂工程技术研究中心合肥230012 药物制剂技术与应用安徽省重点实验室合肥230012

为了研究桔梗三萜类化合物生物合成途径中的关键酶,根据桔梗转录组数据中的基因序列信息,通过RT-PCR方法从桔梗根中克隆得到了2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol2,4-cyclodiphosphate synthase,MCS)和1-羟基... 详细信息

为了研究桔梗三萜类化合物生物合成途径中的关键酶,根据桔梗转录组数据中的基因序列信息,通过RT-PCR方法从桔梗根中克隆得到了2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol2,4-cyclodiphosphate synthase,MCS)和1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR]基因PgMCS和PgHDR,进行序列分析和原核表达分析。结果表明PgMCS和PgHDR的开放阅读框(ORF)长度分别为738和1416 bp,分别编码245和471个氨基酸,相对分子质量分别为26277.53和52984.17;PgMCS和PgHDR蛋白理论等电点分别为7.71和5.92。PgMCS具有PLN02862(MECDP合酶)家族的保守结构域,PgHDR具有PLN02821(HMBPP还原酶)家族的保守结构域。原核表达结果显示,IPTG均可成功诱导目的蛋白表达,分子质量分别为26和60 kDa。基因表达结果显示,PgMCS和PgHDR基因的表达水平在叶中最高,其次是茎和根。本文首次克隆并分析了桔梗PgMCS和PgHDR基因,成功建立原核表达体系,为进一步研究桔梗三萜类化合物生物合成的分子机制提供理论依据。

关键词：桔梗 MCS HDR 基因克隆原核表达

Box-Behnken设计-响应面法优化桔梗醇提工艺及醇提物美白活性分析

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食品工业科技 2023年第20期44卷 189-196页

作者：蔡铁全庞会娜黄意情万志强严铭铭国家市场监督管理总局食品审评中心北京100070 长春中医药大学东北亚中医药研究院吉林长春130117 吉林省中药保健食品科技创新中心吉林长春130117

利用响应面法优化桔梗醇提工艺,并考察其美白活性。以提取时间、提取次数、溶媒量为影响因素,采用单因素考察和Box-Behnken响应面设计试验,优化桔梗醇提工艺;以酶抑制活性和抗氧化为指标考察提取物的美白活性。结果表明,桔梗的最佳乙醇... 详细信息

利用响应面法优化桔梗醇提工艺,并考察其美白活性。以提取时间、提取次数、溶媒量为影响因素,采用单因素考察和Box-Behnken响应面设计试验,优化桔梗醇提工艺;以酶抑制活性和抗氧化为指标考察提取物的美白活性。结果表明,桔梗的最佳乙醇提取工艺为提取次数3次,提取时间1 h,溶媒量8倍,该条件下制备的桔梗醇提物中桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗总皂苷的提取率分别为0.122%±0.003%、0.128%±0.005%、0.582%±0.007%,且具有良好的酪氨酸酶抑制活性(92.39%)、透明质酸酶抑制活性(88.26%)、细胞黑色素抑制效果及自由基DPPH(90.19%)和ABTS^(+)(80.57%)清除活性。优化的桔梗醇提工艺稳定可靠,可操作性好,该工艺提取的桔梗醇提物具有良好的美白和抗氧化活性,为进一步研究桔梗生物活性及美白机制提供科学依据。

关键词：桔梗醇提物提取工艺酪氨酸酶透明质酸酶黑色素

桔梗过氧化物酶Ⅲ基因家族的鉴定及辐射后表达分析

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核农学报 2023年第6期37卷 1089-1098页

作者：刘霄杜艳李雪虎晋玲马晓辉王富胜周利斌中国科学院近代物理研究所生物物理室甘肃兰州730000 中国科学院大学北京100049 甘肃中医药大学药学院甘肃兰州730000 定西市农业科学院甘肃定西743000 白银市科近重离子束生物产业创新研究院甘肃白银730900

为探究过氧化物酶Ⅲ(peroxidase classⅢ,PERs)基因家族在药用植物响应电离辐射中的作用,本试验研究了中药材桔梗的PERs(PgPERs)家族成员特性,及桔梗幼苗经高能重离子束和X射线辐射处理后PgPERs基因的表达量变化。通过序列比对、结构域... 详细信息

为探究过氧化物酶Ⅲ(peroxidase classⅢ,PERs)基因家族在药用植物响应电离辐射中的作用,本试验研究了中药材桔梗的PERs(PgPERs)家族成员特性,及桔梗幼苗经高能重离子束和X射线辐射处理后PgPERs基因的表达量变化。通过序列比对、结构域鉴定和蛋白保守基序分析,共获得53个PgPERs,其蛋白的序列长度多数为258~621个氨基酸,碱性蛋白占多数。启动子区调控元件分析结果说明PgPERs存在多个与生长发育、植物激素和逆境胁迫相关的顺式作用元件。进化分析结果显示,PgPERs基因家族主要分为5个簇,与拟南芥过氧化物酶Ⅲ(AtPERs)有29对共线性关系。高能重离子束辐射桔梗幼苗后检测到3个PgPERs基因表达量上调,X射线辐射处理后有8个PgPERs基因差异表达。这些差异基因编码的蛋白质二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构的相似度高,并含有跨膜螺旋。以上结果表明,不同类型的电离辐射处理桔梗幼苗后,其PgPERs响应机制并不相同。本研究结果为探究电离辐射影响桔梗生长发育和辐射响应过程提供了新的视角。

关键词：桔梗过氧化物酶Ⅲ 基因家族电离辐射重离子束

凝胶渗透色谱-气相色谱-离子阱质谱法测定桔梗原药和当归提取物中101种农药残留

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色谱 2023年第2期41卷 178-186页

作者：张蓉陈跃郑培代莹李莎莎贾颖异谢然王金花中国海关科学技术研究中心北京100026 山东警察学院山东济南250200

建立了凝胶渗透色谱(GPC)-气相色谱-离子阱质谱同时检测桔梗原药和当归提取物中101种农药残留的分析方法。方法采用乙腈超声辅助提取桔梗原药和当归提取物,浓缩提取液至近干后用乙酸乙酯-环己烷(1∶1,v/v)复溶,采用凝胶渗透色谱法(选取4... 详细信息

建立了凝胶渗透色谱(GPC)-气相色谱-离子阱质谱同时检测桔梗原药和当归提取物中101种农药残留的分析方法。方法采用乙腈超声辅助提取桔梗原药和当归提取物,浓缩提取液至近干后用乙酸乙酯-环己烷(1∶1,v/v)复溶,采用凝胶渗透色谱法(选取40 cm长、内径20 mm的凝胶渗透色谱柱)对样品进行净化,弃去前段含脂类、色素等杂质的流出液,收集17~30 min洗脱液并旋转蒸发浓缩至近干,甲苯1 mL定容上机。选用DB-5MS毛细管色谱柱分离待测物,通过离子阱质谱实现对101种农药残留的高效检测。方法通过优化前处理条件和离子阱二级质谱参数,有效降低了复杂中药基质对待测化合物的干扰,最大限度提高了样品中农药的定量准确性和回收率,101种农药3水平添加的平均回收率为58.3%~108.9%,每个添加水平10次独立重复测定的相对标准偏差为0.4%~16.5%,检出限(LOD)范围为0.2~40.0μg/kg,可满足当前韩国、日本、欧洲规定的最大残留限量(maximum residue limits,MRLs)要求。方法具有操作简单快速、灵敏度高、重复性好等特点,凝胶渗透色谱技术的应用克服了固相萃取小柱净化容量不足的弊端,离子阱技术的应用可以进一步排除共流出基体杂质的干扰,提高定量和定性的准确性,检测效果优于常用的气相色谱-质谱法,是对中药中同时分析多种农药残留检测方法的有益补充。

关键词：凝胶渗透色谱气相色谱-离子阱质谱农药残留桔梗当归提取物

桔梗PgHMGS和PgHMGR基因克隆与原核表达分析

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中成药 2022年第9期44卷 3062-3068页

作者：余函纹刘梦丽李景彭华胜韩邦兴查良平桂双英安徽中医药大学药学院安徽合肥230012 安徽中医科学院中药资源保护与开发研究所安徽合肥230012 安徽省中医药科学院药物制剂研究所安徽合肥230012 现代药物制剂安徽省教育厅工程技术研究中心安徽合肥230012 药物制剂技术与应用安徽省重点实验室安徽合肥230012 皖西学院生物与制药工程学院安徽六安237010

目的从桔梗植物的根中克隆羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因,并进行生物信息学及原核表达分析。方法依据桔梗转录组数据中筛选的基因序列信息,通过RT-PCR从桔梗根中克隆得到桔梗PgHMGS和PgHMGR基... 详细信息

目的从桔梗植物的根中克隆羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因,并进行生物信息学及原核表达分析。方法依据桔梗转录组数据中筛选的基因序列信息,通过RT-PCR从桔梗根中克隆得到桔梗PgHMGS和PgHMGR基因;通过生物信息学分析软件预测PgHMGS和PgHMGR的蛋白性质,构建蛋白的三级结构模型,进行系统进化分析;构建重组表达载体pET-28a(+)-PgHMGS和pET-32a(+)-PgHMGR,在Ecoli.BL21(DE3)中诱导表达。结果克隆获得的PgHMGS、PgHMGR ORF长度分别为1401、1749 bp,分别编码466、582个氨基酸。通过在线软件预测PgHMGS、PgHMGR分别定位于线粒体膜和内质网,均为酸性蛋白。二级结构预测结果显示PgHMGS、PgHMGR主要由α-螺旋组成。跨膜结构域预测PgHMGS不包含跨膜结构域,PgHMGR在54~76、96~118 aa分别有两个跨膜结构域。结构功能域分析PgHMGS的4~466 aa具有PLN02577(羟甲基戊二酰辅酶A合酶)家族的保守结构域,PgHMGR的171~574 aa具有HMG-CoA_reductase_classI(HMG-CoA还原酶)的保守结构域。SDS-PAGE结果显示PgHMGS和PgHMGR基因成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白分子量分别为45、70 kDA,与预测结果一致。结论本研究首次克隆桔梗HMGS和HMGR基因(命名为PgHMGS和PgHMGR),并成功诱导出重组蛋白,为进一步研究桔梗三萜生物合成途径奠定基础。

关键词：桔梗 HMGS HMGR 基因克隆原核表达

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桔梗及其炮制品的质量标准研究概况

中华中医药学刊 2024年第5期42卷 151-155,I0029页

作者：郭静英李紫冰郑鹏郑郁清张涛白婷婷商杰张金莲江西中医药大学江西南昌330004

桔梗为药食两用中药,专入肺经,具有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效,被称为“舟楫之剂”。作为传统中药,其炮制历史悠久,炮制方法众多。现行标准中桔梗及其炮制品的炮制方法描述及检查项要求并不统一。从文献古籍、现代法规对桔梗及其炮... 详细信息

桔梗为药食两用中药,专入肺经,具有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效,被称为“舟楫之剂”。作为传统中药,其炮制历史悠久,炮制方法众多。现行标准中桔梗及其炮制品的炮制方法描述及检查项要求并不统一。从文献古籍、现代法规对桔梗及其炮制品记载的炮制方法进行对比分析;对现行《中华人民共和国药典》和各省炮规质量标准相关指标进行归纳比较;结合文献计量学方法,对桔梗质量控制方面的现代研究进行可视化分析,以期探讨桔梗现行质量标准的合理性和科学性,并为其炮制品的质量标准研究提供参考。

关键词：桔梗炮制方法现行标准本草记载文献计量学

桔梗中PgMCT和PgCMK的克隆及原核表达分析

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中成药 2022年第5期44卷 1600-1605页

作者：刘梦丽余函纹李景徐睿吴君贤彭华胜查良平桂双英安徽中医药大学药学院安徽合肥230012 中国中医科学院中药资源中心道地药材国家重点实验室培育基地北京100700 安徽省中医药科学院药物制剂研究所安徽合肥230012 现代药物制剂安徽省教育厅工程技术研究中心安徽合肥230012 药物制剂技术与应用安徽省重点实验室安徽合肥230012

目的从桔梗中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)和4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基D-赤藓糖醇激酶(CMK)基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学及原核表达分析。方法根据桔梗转录组数据,通过RT-PCR方法从桔梗根中克隆得到PgMC... 详细信息

目的从桔梗中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)和4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基D-赤藓糖醇激酶(CMK)基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学及原核表达分析。方法根据桔梗转录组数据,通过RT-PCR方法从桔梗根中克隆得到PgMCT和PgCMK序列,利用生物信息学软件预测PgMCT和PgCMK蛋白的特征;利用ClustalW和MEGA 6.06软件构建PgMCT和PgCMK的系统进化树;构建原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。结果PgMCT和PgCMK基因ORF全长为954、1227 bp,分别编码317、408个氨基酸,均为不稳定蛋白。PgMCT和PgCMK蛋白的二级结构中,均为无规卷曲所占比例最高。结构功能域分析PgMCT和PgCMK分别属于糖基转移酶GT-A超家族和IspE超家族,推测这2个蛋白均为非跨膜蛋白。预测PgMCT和PgCMK蛋白均无跨膜结构,为非跨膜蛋白。SDS-PAGE结果显示,PgMCT和PgCMK诱导表达蛋白分别为55、50 kDa,与预期蛋白分子量一致。结论本实验首次从桔梗中克隆出MCT和CMK(命名为PgMCT和PgCMK),为进一步探究桔梗三萜皂苷成分的生物合成奠定了物质基础。

关键词：桔梗 MCT CMK 基因克隆原核表达