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广东农业科学 2019年第8期46卷 111-117页

作者：孙勋勋杨宏宇周轶楠刘吉平华南农业大学动物科学学院

【目的】建立桑花叶型萎缩病相关病毒(Mulberry Mosaic Dwarf associated Virus,MMDaV)的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】以MMDaV保守的外壳蛋白基因为靶基因,设计特异引物,构建外壳蛋白基因序列的阳性质粒,建立阳性质粒的标准曲线,... 详细信息

【目的】建立桑花叶型萎缩病相关病毒(Mulberry Mosaic Dwarf associated Virus,MMDaV)的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】以MMDaV保守的外壳蛋白基因为靶基因,设计特异引物,构建外壳蛋白基因序列的阳性质粒,建立阳性质粒的标准曲线,并对MMDaV特异引物的灵敏性和特异性进行检测,并使用建立的MMDaV实时荧光定量PCR检测方法检测广东、广西、海南、重庆、陕西和江西6个省区的桑病叶样品。【结果】构建的标准曲线具有良好的扩增效率(97.88%),设计的特异引物可特异的检测到MMDaV,最低的质粒检测浓度为8 copies/μL,是普通PCR灵敏度的24倍,并且MMDaV实时荧光定量PCR检测方法对6个省区的桑病叶样品均有良好的检测结果,检测的Cq值在9.69~26.17之间。【结论】建立的MMDaV实时荧光定量PCR检测方法具有高效率、特异性好和灵敏度高等特性,可被应用于寄主体内MMDaV的定量检测。

关键词：桑树双生病毒桑花叶型萎缩病桑花叶型萎缩病相关病毒实时荧光定量PCR

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桑花叶型萎缩病相关病毒的初步检测

桑花叶型萎缩病相关病毒的初步检测

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中国蚕学会第九届青年学术研讨会

作者：孙勋勋杨宏宇刘吉平华南农业大学动物科学学院

桑病毒病是桑树上的常见病害之一,影响着桑树产业的健康发展,其中桑花叶型萎缩病是危害最广、研究最多的一种桑病毒病,桑花叶型萎缩病相关病毒（mulberrymosaic dwarf associated virus,MMDaV）是桑花叶型萎缩病被广泛关注致病病原。本... 详细信息

桑病毒病是桑树上的常见病害之一,影响着桑树产业的健康发展,其中桑花叶型萎缩病是危害最广、研究最多的一种桑病毒病,桑花叶型萎缩病相关病毒（mulberrymosaic dwarf associated virus,MMDaV）是桑花叶型萎缩病被广泛关注致病病原。本研究根据NCBI上报道的桑花叶型萎缩病相关病毒基因组序列（KP303687.1）设计了特异性检测引物,并对引物组的特异性与灵敏性进行了检测。同时利用特异引物组MCP746F/MCP1148R对收集自广东省、广西区和海南省桑园的32份带有花叶、皱缩、脉带等症状的桑叶样品进行了PCR检测。结果 32个份样品中均检测出桑花叶型萎缩病相关病毒MMDaV,表明桑花叶型萎缩病相关病毒MMDaV是桑花叶型萎缩病的常见病原,与桑病毒病的发生具有极高的相关性,至于该病原是否是桑花叶型萎缩病唯一的致病病原还有待深入研究。本研究应用分子生物学技术对桑花叶型萎缩相关病毒进行的检测研究初步结果,为桑病毒病的预测预报和综合防控提供了实验依据。

关键词：桑病毒病桑花叶型萎缩病相关病毒 PCR

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华南地区桑花叶型萎缩病相关病毒的初步检测

华南地区桑花叶型萎缩病相关病毒的初步检测

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全国桑树产业发展学术研讨会

作者：孙勋勋杨宏宇刘吉平华南农业大学动物科学学院

从广东省、广西省和海南省收集30多个具有花叶,皱缩、丝叶、带脉等症状的桑叶样品,根据ncbi上的桑花叶型萎缩病相关病毒基因组序列设计特异性检测引物,并检测引物组的特异性与灵敏性。利用特异引物组MCP746F/MCP1148R对30多个样品进行检... 详细信息

从广东省、广西省和海南省收集30多个具有花叶,皱缩、丝叶、带脉等症状的桑叶样品,根据ncbi上的桑花叶型萎缩病相关病毒基因组序列设计特异性检测引物,并检测引物组的特异性与灵敏性。利用特异引物组MCP746F/MCP1148R对30多个样品进行检测,各地各种桑病毒病病叶样品中均检测到桑花叶型萎缩病相关病毒,该病毒是否是上述病症的致病原还需进一步研究,但桑花叶型萎缩病相关病毒与桑病毒病之间存在相关性。

关键词：桑病毒病桑花叶型萎缩病相关病毒

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两种桑树病毒的形态观察与检测

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植物保护 2019年第5期45卷 252-258页

作者：孙勋勋周轶楠黄吉雷易辉玉田铃刘吉平华南农业大学动物科学学院亚太地区蚕桑培训中心广州510642 华南农业大学测试中心广州510642

桑树病毒病一直是影响蚕桑产业发展的重要因素之一,但其病原也尚未完全确认。本研究收集全国不同桑园、不同时间和不同品种的皱缩状和花叶状桑叶样品,分离病毒后使用透射电子显微镜观察病毒形态特征。结果在桑病叶中分离获得两种病毒,... 详细信息

桑树病毒病一直是影响蚕桑产业发展的重要因素之一,但其病原也尚未完全确认。本研究收集全国不同桑园、不同时间和不同品种的皱缩状和花叶状桑叶样品,分离病毒后使用透射电子显微镜观察病毒形态特征。结果在桑病叶中分离获得两种病毒,一种为双联体形态病毒,长(27.84±1.71)nm,宽(17.05±1.13)nm,形态特征与双生病毒属的病毒形态特征一致;另一种为球状体病毒(80~100 nm),形态特征与番茄斑萎病毒属的病毒形态特征一致;桑叶切片观察,发现同一桑叶材料中存在这两种病毒。通过高通量测序发现其存在桑花叶型萎缩病相关病毒Mulberry mosaic dwarf associated virus(MMDaV)和桑脉带相关病毒Mulberry vein banding associated virus(MVBaV)。设计上述病毒的特异引物,对158份桑病叶进行PCR检测,MMDaV的检出率为93.04%;而MVBaV为60.13%,同时检出率为57.59%。结果表明,MMDaV和MVBaV在桑病叶中普遍存在,且同时存在。本研究首次在桑树病叶中同时观察并检测到MMDaV和MVBaV,二者在桑皱缩状和花叶状的桑叶中存在混合感染的现象,研究结果将为今后深入研究桑病毒病及防控奠定了基础。

关键词：桑树病毒病桑花叶型萎缩病相关病毒桑脉带相关病毒形态特征 PCR检测

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桑花叶病病原的鉴定与分子生物学研究

桑花叶病病原的鉴定与分子生物学研究

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作者：孙勋勋华南农业大学

学位级别：硕士

桑树是养蚕业的重要原料,也是药食两用的经济林作物,在食品保健、畜禽饲料、生态修复等方面得到了广泛的应用,且越来越受到人们的重视。桑花叶病是一种桑树病毒病,会导致桑树产生叶质量变差、产量下降、植株矮小和桑树抵抗力下降等问题... 详细信息

桑树是养蚕业的重要原料,也是药食两用的经济林作物,在食品保健、畜禽饲料、生态修复等方面得到了广泛的应用,且越来越受到人们的重视。桑花叶病是一种桑树病毒病,会导致桑树产生叶质量变差、产量下降、植株矮小和桑树抵抗力下降等问题,严重制约着蚕桑产业的健康稳定发展。在桑树产业蓬勃发展的新形势下,桑花叶病的发生规律、检测技术和防控手段等问题都亟待解决。本研究收集了广东、广西、海南、重庆四个省区共16个县市以及华南农业大学桑园不同季节的具有皱缩和花叶症状的182份桑叶样品、3份桑枝条样品以及3份蓟马与叶蝉两种桑园害虫。首先利用密度梯度离心对收集的病叶中的病毒进行分离纯化,使用电子显微镜进行形态特征观察,并按照柯赫式法则对分离病毒的致病性进行回感验证。接着,通过PCR检测以及高通量测序对桑病叶中病毒种类进行分析和确认,并对四个省区29份桑病叶样品中的病毒进行了全基因组测序和生物信息学分析。最后,根据病毒保守的核苷酸序列,设计特异检测引物,建立PCR及qPCR检测方法,并对182份桑叶样品、3份昆虫和桑组织样品进行PCR检测,分析病毒与病状、季节、地理等因素之间的关系并探究病毒的传播规律。获得的主要研究结果如下:(1)分离纯化获得一种桑花叶病的病毒样本,经电镜观察,病毒为二联体形态,病毒粒子长为27.84±1.71 nm,宽为17.05±1.13 nm,这符合双生病毒科病毒粒子的形态特征(2)PCR检测以及高通量测序结果显示,皱缩和花叶状的桑叶中均同时存在两种病毒,即双生病毒科(Geminiviridae)的桑花叶型萎缩病相关病毒(mulberry mosaic dwarf associated virus,MMDaV)和正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的桑脉带相关病毒(Mulberry vein banding associated virus,MVBaV)。(3)对四个省区29份MMDaV进行全基因组测序和生物信息学分析的结果显示,MMDaV病毒存在明显的地理差异,分别归为华南株系HNZX和华东株系HDZX两大类群,而广东、广西和海南地区则同时存在MMDaV的两大株系。(4)根据MMDaV外壳蛋白基因和MVBaV核壳体蛋白基因核酸序列,设计特异PCR和qPCR检测引物,并分别构建阳性检测质粒。其中,MMDaV的PCR特异引物检测到的质粒浓度为1×1066 ng/μL,qPCR的有效质粒检测浓度为1×1066 ng/μL。MVBaV的PCR特异引物检测到的质粒浓度为1×1055 ng/μL。(5)对采集的182份桑叶样品、3份蓟马与叶蝉等样品进行PCR检测的结果显示,MMDaV和MVBaV两种病毒存在混合侵染,其中MMDaV在皱缩和花叶两种症状的桑叶中普遍存在,而MVBaV仅在花叶状的桑叶中普遍存在。MVBaV受季节温度影响明显,高温条件下存在明显的潜隐现象。蓟马和叶蝉中均携带这两种病毒,病毒可在桑树根部越冬,来年随桑树的生长而繁殖。全文创新之处:研究发现桑花叶病的病叶中同时存在MMDaV和MVBaV两种病毒;建立了MMDaV病毒检测技术(专利申请号:201711281273.8)和MBVaV病毒检测技术(专利申请号:201810552526.9)。

关键词：桑树桑花叶病病毒病桑花叶型萎缩病相关病毒桑脉带相关病毒

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桑树病毒的初步检测

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中国蚕学会第九届青年学术研讨会

作者：孙勋勋杨宏宇刘吉平华南农业大学动物科学学院

桑病毒病是桑树上的常见病害之一,影响着桑树产业的健康发展。根据已有报道的桑树病毒及NCBI上的桑树病毒核酸序列,设计特异性检测引物。同时利用特异引物组对收集自广东省、广西区和海南省桑园的32份带有花叶、皱缩、脉带等症状的桑叶... 详细信息

桑病毒病是桑树上的常见病害之一,影响着桑树产业的健康发展。根据已有报道的桑树病毒及NCBI上的桑树病毒核酸序列,设计特异性检测引物。同时利用特异引物组对收集自广东省、广西区和海南省桑园的32份带有花叶、皱缩、脉带等症状的桑叶样品进行了PCR初步检测。结果 32个病叶样品中检测出桑花叶型萎缩病相关病毒（mulberrymosaic dwarf associated virus,MMDaV）及桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding-associated virus,MVBaV）,其中MMDaV的检出率高达100.00%,MVBaV的检出率为78.13%。表明,MMDaV和MVBaV与桑病毒病具有很大相关性。

关键词：桑病毒病桑花叶型萎缩病相关病毒桑脉带相关病毒

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