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桃拉综合征病毒的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测方法的建立

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河北农业大学学报 2020年第3期43卷 79-85页

作者：李伟哲刘露李丽娜肖勤河北农业大学生命科学学院河北保定071001 河北农业大学海洋学院河北秦皇岛066003

桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)是威胁虾类养殖业的主要病毒之一。本试验建立了一种快速检测TSV的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)方法,并与荧光定量PCR(qPCR)进行了对比。基于TSV的衣壳蛋白VP2核酸序列,设计3... 详细信息

桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)是威胁虾类养殖业的主要病毒之一。本试验建立了一种快速检测TSV的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)方法,并与荧光定量PCR(qPCR)进行了对比。基于TSV的衣壳蛋白VP2核酸序列,设计3对特异性引物(外引物:FIP/BIP,内引物:F3/B3,环引物:LF/LB),进行LAMP反应体系的优化。其中引物LF以BIO标记,LB以FAM标记,用于横向流动试纸条(LFD)的检测。结果表明:LAMP最佳反应可在63℃恒温条件下40 min内完成。整个扩增反应到LFD结果判定可在45 min内完成。LAMP-LFD可特异性检出TSV特异性片段,未与其它病毒和细菌发生交叉反应,且其检测限为22.9 fg。与qPCR相比,本研究所建立的LAMP-LFD检测体系虽然检测限高于qPCR 10倍,但比qPCR检测时间缩短近1 h,且LAMP-LFD特异性强、操作简单,无需特殊仪器设备,可快捷、方便地检测出TSV,满足TSV基层快速检测的需要。

关键词：横向流动试纸条环介导等温扩增桃拉综合征病毒荧光定量PCR

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桃拉综合征病毒多克隆抗体的制备及应用

桃拉综合征病毒多克隆抗体的制备及应用

作者：柏琴琴南京农业大学

学位级别：硕士

桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus,TSV)能感染对虾引发桃拉综合征(Taura Syndrome,TS)。在其主要宿主凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)和细角对虾(***)中爆发流行和导致高死亡率。其核衣壳由三个主要结构蛋白有VP1,VP2和VP3(55,40和24... 详细信息

桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus,TSV)能感染对虾引发桃拉综合征(Taura Syndrome,TS)。在其主要宿主凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)和细角对虾(***)中爆发流行和导致高死亡率。其核衣壳由三个主要结构蛋白有VP1,VP2和VP3(55,40和24kD)和一个次要蛋白VPO(58kD)构成,其中VP1基因是关键的抗原基因。本研究对VP1基因全长及保守区进行了克隆表达,制备了多克隆抗体,并应用多克隆抗体初步探讨了胶体金免疫层析快速检测方法。根据桃拉病毒中国株ZHZC3的全基因组序列,分别设计扩增其主要结构蛋白基因VP1保守区及全长的相应引物,利用RT-PCR技术对目的基因进行了扩增,分别获得了841bp和1552bp的基因片段。再将目的基因与pET-32a(+)载体连接,分别构建高效表达重组载体pET32a-VP1cr、pET32a-VP1。转化大肠杆菌BL21(DE3),重组子经酶切和测序鉴定正确后进行诱导表达。IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳检测。结果表明：融合蛋白在37℃下,1.0mmol/L的IPTG浓度诱导下能良好表达,并且,融合蛋白均以包涵体的形式存在。用镍柱纯化包涵体后能获得较纯的融合蛋白。融合蛋白pET32a-VP1cr/VP1经HisTrapTM HP纯化后分别免疫新西兰家兔和ICR小鼠,制备不同种属来源的多克隆抗体。通过ELISA方阵试验,确定pET32a-VP1cr融合蛋白免疫新西兰家兔和ICR小鼠的最佳蛋白包被浓度均为1μg/mL,最佳血清稀释度分别为1：1600和1：3200;融合蛋白pET32a-VP1免疫新西兰家兔和ICR小鼠的最佳蛋白包被浓度分别为1μg/mL和2μg/mL,最佳血清稀释度分别为1：3200和1：12800。方阵滴定后间接ELISA检测血清效价,两种融合蛋白分别免疫ICR小鼠的效价均达到1：25600,新西兰家免的效价达1：102400。用Hitrap Protein G HP柱纯化抗血清获得较纯的IgG。用纯化的兔抗融合蛋白IgG与粗提的TSV进行Western blot试验,在55kD位置出现特异性条带。分别用20nm和30nm的胶体金标记了兔抗pET32a-VP1cr抗体和兔抗pET32a-VP1抗体。采用双抗体夹心法,用20nm胶体金标记兔抗pET32a-VP1cr抗体制成金标抗体结合垫,将鼠抗pET32a-VP1cr抗体喷涂在NC膜组装成了胶体金免疫层析试纸条。阴性对照检测结果成立,检测粗提的TSV,质控线明显显色,检测线显色较淡。

关键词：桃拉综合征病毒 VP1基因多克隆抗体胶体金免疫层析试验

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桃拉综合征病毒单克隆抗体的制备及应用

桃拉综合征病毒单克隆抗体的制备及应用

作者：赵彦华南京农业大学

学位级别：硕士

对虾病毒性疾病的爆发流行能够导致较高的死亡率,其中桃拉综合征病毒感染凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)的累积死亡率达到40%～100%,给对虾养殖业造成了严重的损失,影响了对虾养殖业的长期健康稳定的发展。目前检测对虾病毒性疾病的方法... 详细信息

对虾病毒性疾病的爆发流行能够导致较高的死亡率,其中桃拉综合征病毒感染凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)的累积死亡率达到40%～100%,给对虾养殖业造成了严重的损失,影响了对虾养殖业的长期健康稳定的发展。目前检测对虾病毒性疾病的方法,仍然具有耗时长、费用高、实验室要求高等缺点,这需要建立起一种具有快速、便捷、敏感、结果判断直观的检测方法。对虾桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)能感染对虾引起桃拉综合征(Taura syndrome,TS)。病毒为单链正股RNA病毒,其核衣壳由三个主要结构蛋白VP1, VP2和VP3(55,40和24kD)以及一个次要蛋白VPO (58kD)构成,其中VP1基因是其核衣壳上关键的抗原基因。本文主要根据对虾桃拉综合征病毒核衣壳蛋白VP1是主要的抗原蛋白,利用实验室所保存已构建好的含有VP1保守区基因的菌株,大量诱导表达蛋白做为抗原蛋白,选取5～6周龄雌性Balb/c小鼠,采用皮下免疫的方法免疫小鼠,免疫周期为7d,三次免疫后测得血清效价达到1：10-4,加强免疫三天后,无菌条件下取小鼠脾细胞,在融合剂聚乙二醇的作用下与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)杂交,形成杂交瘤细胞,利用间接ELISA的方法,筛选出能够分泌抗体的杂交瘤细胞;杂交瘤细胞经三次亚克隆后得到两株稳定分泌抗体的单克隆细胞株,将此细胞株扩大培养,调整细胞密度为1×106个/mL,接种于9～10周龄Balb/c小鼠腹腔,注射量为1mL/只,每只小鼠接种大约106个细胞,7～10d后抽取腹水,制备出效价达1：10-6的单克隆抗体(McAb),经Western-Blotting验证其具有特异性。利用制备的单克隆抗体,以膜为固相载体制备对虾桃拉综合征病毒胶体金检测试纸条,分别用20nm和30nm的胶体金标记鼠抗pET32a-VP1cr单克隆抗体,选取最优条件,从而建立起一种更快速,简便的检测方法。采用双抗体夹心法,用20nm胶体金标记鼠抗pET32a-VP1cr抗体制成金标抗体结合垫。将鼠抗pET32a-VP1cr抗体喷涂在NC膜组装成了胶体金免疫层析试纸条。阴性对照检测结果成立,检测含有VP1全长的融合蛋白,质控线和检测线显示红色。

关键词：桃拉综合征病毒 VP1基因单克隆抗体胶体金免疫层析试验

二温式多重PCR检测对虾的白斑综合征病毒和桃拉综合征病毒

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农业生物技术学报 2007年第2期15卷 237-241页

作者：吴刘记吴信忠孟庆国浙江大学动物科学学院杭州310029 浙江大学动物科学学院

根据多重PCR的技术原理,利用对虾(Penaeus vannamei)白斑综合征病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了两对特异引物,并将常规三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立二温式多重PCR技术用于对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome... 详细信息

根据多重PCR的技术原理,利用对虾(Penaeus vannamei)白斑综合征病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了两对特异引物,并将常规三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立二温式多重PCR技术用于对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)和桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)的复合快速检测。利用二温式PCR能特异地扩增出WSSV和TSV的基因片段。结果表明,二温式多重PCR技术具有较高的特异性和敏感性,最低能检测到WSSV核酸模板10pg,TSV核酸模板100pg,且对其它一些对虾病原呈阴性。

关键词：白斑综合征病毒桃拉综合征病毒二温式多重PCR

应用RT-PCR方法从进境南美白对虾亲虾中检出桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus)

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中国动物检疫 2003年第12期20卷 21-22页

作者：陈信忠龚艳清孔繁德王景明周斌华郑征黄元成厦门出入境检验检疫局厦门361012

应用PCR和RT-PCR技术,对一批进境的南美白对虾亲虾进行了多种病毒性病原的检疫。结果检出桃拉综合征病毒。临床观察也表明,该批亲虾体表散布大量黑色病灶,为TSV感染引起的TS典型病变。

关键词：应用 RT—PCR方法进口产品南美白对虾亲虾桃拉综合征病毒检疫

对虾桃拉综合征病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

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福建畜牧兽医 2013年第2期35卷 16-19页

作者：方成俊陈俊玉王碧生杨奇志潘迎芬陈晖陈旭新东山出入境检验检疫局福建东山363401 美国Protein Simple公司中国广州办事处广州510000

目的:建立一种敏感、定量、快速、特异、安全的实时荧光定量PCR检测方法,用于对虾桃拉综合征病毒(TSV)的早期诊断和监测。方法:从GeneBank下载所有Taura病毒的序列,用生物软件进行序列比对,在TSV保守区序列设计特异性引物和探针。对实... 详细信息

目的:建立一种敏感、定量、快速、特异、安全的实时荧光定量PCR检测方法,用于对虾桃拉综合征病毒(TSV)的早期诊断和监测。方法:从GeneBank下载所有Taura病毒的序列,用生物软件进行序列比对,在TSV保守区序列设计特异性引物和探针。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化,提高特异性和灵敏度。结果:检测灵敏度达450个病毒拷贝,超过普通PCR100倍;检测特异性为100%,高于普通PCR;检测时间在60min内,约为普通PCR的1/4;有效解决PCR产物的气溶胶污染问题,安全性高。结论:本研究应用荧光定量PCR技术用于对虾桃拉综合征病毒检测具有敏感、定量、快速、特异、安全等优点。

关键词：桃拉综合征病毒实时荧光定量PCR(FQ—PCR) 检测

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上海口岸入境泰国草虾中检出桃拉综合征病毒

中国动物检疫 2005年第5期22卷 39-39页

作者：熊炜邱璐李健蒋静王巧全胡永强上海出入境检验检疫局 200135

桃拉综合征病毒( Taura syndrome virus, TSV)是全球范围内广泛流行并严重威胁虾养殖业的病原体,属于世界动物卫生组织OIE目录规定的二类疫病.

关键词：桃拉综合征病毒上海口岸世界动物卫生组织检出草虾泰国入境 virus 全球范围二类疫病病原体养殖业 OIE

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水生动物疫病病种介绍之:桃拉综合征

中国水产 2011年第4期 62-64页

作者：陈爱平江育林钱冬陈昌福李安兴黄捷杨冰

桃拉综合征俗称红尾病，是由桃拉综合征病毒引起的对虾的一种严重传染性疾病，急性期以虾体变红（虾红素增多）、软壳，过渡期以角质上皮不规则黑化为特征。我国将其列为二类疫病，OIE将其列为必须通报疾病。

关键词：桃拉综合征病毒传染性疾病二类疫病虾红素 OIE 对虾俗称软壳

养殖南美白对虾桃拉综合征病原的确认及其组织病理学观察

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海洋水产研究 2004年第2期25卷 18-23页

作者：龚艳清陈信忠黄印尧厦门出入境检验检疫局 361012

应用RT PCR技术 ,对福建南部养殖南美白对虾 (Litopenaeusvannamei)自然暴发的急性传染病病原进行了检测。结果检出桃拉综合征病毒。对 2 31bp的扩增产物进行了测序 ,并与Genbank桃拉综合征病毒相应序列进行比较 ,其同源性超过 97 0 %... 详细信息

应用RT PCR技术 ,对福建南部养殖南美白对虾 (Litopenaeusvannamei)自然暴发的急性传染病病原进行了检测。结果检出桃拉综合征病毒。对 2 31bp的扩增产物进行了测序 ,并与Genbank桃拉综合征病毒相应序列进行比较 ,其同源性超过 97 0 %。临床观察也表明 ,虾体表发红、有的虾体表散布有一些灰白色病灶 ,附肢及尾扇发红 ,还有一些病虾体表散布大量黑色不规则病灶 ,为桃拉综合征病毒感染引起的典型症状。组织病理学检查表明 ,病虾体表、附肢、鳃等组织的表皮上皮有许多坏死病灶 ,结缔组织细胞与相邻横纹肌纤维基底部也有病变。病变细胞嗜酸性颗粒增多 ,细胞核固缩或破裂。部分病虾肝胰腺出现脂肪化和空泡变性。

关键词： RT-PCR 南美白对虾桃拉综合征病毒