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格特隐球菌基因组学研究进展

协和医学杂志 2019年第5期10卷 505-513页

作者：贾鑫淼肖盟孙天舒徐英春中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中心实验室北京100730 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院检验科北京100730 侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室北京100730

格特隐球菌属于新生隐球菌复合体,既往被认为是新生隐球菌复合体的变种,但最终被确立为独立的物种。与新生隐球菌不同,格特隐球菌多感染免疫力正常人群,目前致病机制尚未明确。格特隐球菌的基因组学研究不仅可全面了解其基因组成、分子... 详细信息

格特隐球菌属于新生隐球菌复合体,既往被认为是新生隐球菌复合体的变种,但最终被确立为独立的物种。与新生隐球菌不同,格特隐球菌多感染免疫力正常人群,目前致病机制尚未明确。格特隐球菌的基因组学研究不仅可全面了解其基因组成、分子进化、毒力因子以及致病机制等特点,还可对致病相关基因和重要蛋白进行预测,为疫苗和新型抗生素的研发提供分子基础,并进一步为高效治疗和防控隐球菌病提供理论依据。本文就格特隐球菌的基因组测序和基本特征、基因组进化、重要毒力基因以及比较基因组研究予以概述。

关键词：格特隐球菌基因组比较基因组进化感染毒力

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格特隐球菌交配型的多重PCR鉴定

微生物学通报 2014年第5期41卷 1004-1008页

作者：冯晓博凌波付小花王磊廖万清姚志荣上海交通大学医学院附属新华医院皮肤科上海200092 同济大学环境科学与工程学院上海200092 第二军医大学附属长征医院病原真菌分子生物学研究所上海200003

【目的】建立一种基于格特隐球菌α交配型位点内SXI1α基因和a交配型位点内SXI2a基因的多重PCR分析,用于快速鉴定格特隐球菌的交配型。【方法】设计针对格特隐球菌α交配型位点内SXI1α基因部分片段和格特隐球菌a交配型位点内SXI2a基因... 详细信息

【目的】建立一种基于格特隐球菌α交配型位点内SXI1α基因和a交配型位点内SXI2a基因的多重PCR分析,用于快速鉴定格特隐球菌的交配型。【方法】设计针对格特隐球菌α交配型位点内SXI1α基因部分片段和格特隐球菌a交配型位点内SXI2a基因部分片段的特异性引物,用于多重PCR鉴定格特隐球菌的交配型;并与交配试验以及已报道的扩增α交配型位点的引物MFα、STE12α,及扩增a交配型位点的引物STE20a、STE3a进行扩增效果的比较。【结果】基于SXI1α基因和SXI2a基因的多重PCR分析,准确鉴定所有受试格特隐球菌(包括VGI、VGII、VGIII和VGIV基因型)的交配型,引物STE12α、STE20a和STE3a在常规PCR鉴定中不能鉴定部分菌株的交配型;66.7%的受试菌株不能发生交配,交配试验无法鉴定其交配型。【结论】建立的多重PCR方法明显优于常规PCR或交配试验鉴定。

关键词：格特隐球菌基因型交配型聚合酶链式反应

VGⅠ及VGⅡ型格特隐球菌的体外生长特性及对蜡螟的毒力差异研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2019年第10期39卷 725-730页

作者：杨晨金亮王丽凤薛新颖沈定霞解放军总医院第一医学中心临床检验中心北京100853

目的了解我国分离的VGⅠ及VGⅡ型格特隐球菌在体外的生长特性及对蜡螟的毒力差异.方法在对我国分离的8株格特隐球菌多位点序列分型的基础上,通过体外培养法绘制生长曲线、观察黑色素生成并测量荚膜厚度.利用蜡螟感染试验检测格特隐球菌... 详细信息

目的了解我国分离的VGⅠ及VGⅡ型格特隐球菌在体外的生长特性及对蜡螟的毒力差异.方法在对我国分离的8株格特隐球菌多位点序列分型的基础上,通过体外培养法绘制生长曲线、观察黑色素生成并测量荚膜厚度.利用蜡螟感染试验检测格特隐球菌的半数致死时间(LT50)和在48 h的半数致死浓度(LC50).同时采用14株新型隐球菌作为对比研究.结果8株格特隐球菌中有6株VGⅠ型,2株VGⅡ型.30℃培养,VGⅠ及VGⅡ型格特隐球菌与新型隐球菌的生长曲线基本一致,它们在96 h各自生长的总菌数均可达10^8 CFU/ml;37℃培养,它们在所有测试时间点的总菌数均不及30℃培养.新型隐球菌在30℃和37℃培养黑色素产生量无差异,但格特隐球菌VGⅠ型和VGⅡ型均显示37℃培养产生的黑色素量多于30℃.格特隐球菌VGⅠ型在37℃的荚膜-细胞壁直径比值大于30℃,差异具有统计学意义(P隐球菌、格特隐球菌VGⅠ型和VGⅡ型的LT50长短排序为:格特隐球菌VGⅡ型格特隐球菌VGⅠ型隐球菌.1×106 CFU/ml浓度下,格特隐球菌VGⅡ型的LT50为72 h.48 h只有格特隐球菌VGⅡ型对蜡螟致死数过半,LC50为1×10^8 CFU/ml.结论新型隐球菌、格特隐球菌VGⅠ型和VGⅡ型均在30℃培养条件下较37℃繁殖更快,但格特隐球菌在37℃时产生的黑色素量以及形成荚膜的厚度均大于30℃培养时.VGⅡ型格特隐球菌对蜡螟的半数致死时间最短,毒力最强.

关键词：格特隐球菌分子型生长特性蜡螟毒力

中国首株格特隐球菌VGII基因型分离株XH91的分子和表型特征鉴定

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微生物学报 2010年第11期50卷 1460-1465页

作者：冯晓博吴劲松凌波任大明姚志荣上海交通大学医学院附属新华医院皮肤科上海200092 暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院检验科深圳518020 复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200092

【目的】研究我国首次临床分离的一株格特隐球菌VGII基因型菌株(XH91)的分子和表型特征。【方法】对受试株XH91进行血清型的分子鉴定;选取核基因组和线粒体基因组中共16个基因片段进行多位点序列分型;对受试株进行单倍体繁育、同性交配... 详细信息

【目的】研究我国首次临床分离的一株格特隐球菌VGII基因型菌株(XH91)的分子和表型特征。【方法】对受试株XH91进行血清型的分子鉴定;选取核基因组和线粒体基因组中共16个基因片段进行多位点序列分型;对受试株进行单倍体繁育、同性交配及异性交配能力评价;观察受试株的黑色素生成、荚膜厚度及37℃生长等表型特征。【结果】我国首株格特隐球菌VGII基因型菌株XH91为血清B型;该菌株在多位点序列分型上与温哥华岛致病基因型VGIIb一致;XH91能与a交配型发生交配,产生担孢子,而不能与α交配型发生交配且不具备单倍体繁育能力;XH91的黑色素生成、荚膜厚度及37℃生长等表型特征与参考株无明显差异。【结论】我国首株格特隐球菌VGII基因型菌株XH91在基因型、表型特征上均与温哥华岛VGIIb基因亚型一致,该结果将为我国格特隐球菌VGII基因型的分子流行病学和疾病监控提供重要资料。

关键词：格特隐球菌基因型序列分析交配表型

广西贵港地区2009-2012年新生隐球菌和格特隐球菌临床分离株基因分型与毒力特性研究

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中华流行病学杂志 2015年第5期36卷 491-495页

作者：边富宁吴媛于栓宝车洁李文革邵祝军朱兵清卢金星中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室感染性疾病诊治协同创新中心北京102206

目的研究广西贵港地区新生隐球菌和格特隐球菌临床分离株，在种、基因型和交配型的构成及毒力特性。方法收集2009--2012年广西贵港地区临床分离的新生隐球菌株20株，PCR扩增转录间隔区（ITS）序列进行分子生物学验证，通过特异性引物进... 详细信息

目的研究广西贵港地区新生隐球菌和格特隐球菌临床分离株，在种、基因型和交配型的构成及毒力特性。方法收集2009--2012年广西贵港地区临床分离的新生隐球菌株20株，PCR扩增转录间隔区（ITS）序列进行分子生物学验证，通过特异性引物进行PCR扩增，鉴定血清型、交配型。利用M13-PCR指纹图谱法和URA5-限制性片段长度多态性分析法，鉴定和验证基因型。表型研究包括37℃生长试验、黑色素生成试验和尿素酶试验。结果20株有19株为新生隐球菌格鲁比变种，血清型为A型，cL交配型，基因型为VNI型。1株为格特隐球菌，属a交配型，基因型VGI。毒力特性研究结果显示，所有临床分离株37℃正常生长，黑色素试验、尿素酶试验阳性。结论广西贵港地区隐球菌致病菌株中绝大多数（95％）为新生隐球菌格鲁比变种、血清型为A型，a交配型，基因型为VNI型，并发现格特隐球菌菌株。

关键词：新生隐球菌格特隐球菌基因型交配型毒力特性

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格特隐球菌在河北地区引起1例脑膜炎的临床与实验研究

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中国真菌学杂志 2015年第1期10卷 11-15页

作者：窦红涛万喆杨启文王瑶王贺谢秀丽刘娟李若瑜徐英春中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院检验科北京100730 北京大学第一医院皮肤性病科北京大学真菌与真菌病研究中心北京100034

目的报道1例我国河北地区由格特隐球菌引起的脑膜炎,并对该菌进行试验研究。方法将分离自患者脑脊液中的隐球菌分别接种于Chromagar显色培养基和刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝(CGB)培养基35℃培养,使用API 20C AUX、全自动微生物鉴定仪V... 详细信息

目的报道1例我国河北地区由格特隐球菌引起的脑膜炎,并对该菌进行试验研究。方法将分离自患者脑脊液中的隐球菌分别接种于Chromagar显色培养基和刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝(CGB)培养基35℃培养,使用API 20C AUX、全自动微生物鉴定仪Vitek 2 Compact、生物梅里埃基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)、r DNA ITS和IGS序列分析等方法对该菌进行菌种鉴定,并使用ATB FUNGUS 3进行抗真菌药敏试验。结果该菌在显色培养基上35℃培养48 h后为白色略带粉色菌落,在CGB培养基35℃培养5 d后使CGB培养基由黄色变为蓝色。API 20C AUX、Vitek 2 Compact和MALDI-TOF MS的鉴定结果均为新生隐球菌,r DNA ITS和IGS序列分析均提示该菌为格特隐球菌。5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑对该菌的最小抑菌浓度分别是≤4μg/m L、≤0.5μg/m L、≤1μg/m L、≤0.125μg/m L、≤0.06μg/m L。结论 CGB培养基、r DNA ITS和IGS序列分析能够区分新生隐球菌和格特隐球菌,应重视格特隐球菌的分离鉴定。

关键词：格特隐球菌河北地区 CGB培养基鉴定序列测定抗真菌药敏试验

微小RNA-146a在新生隐球菌、格特隐球菌诱导THP-1细胞炎性反应中的机制研究

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中国感染与化疗杂志 2017年第4期17卷 393-396页

作者：王妍高睿陈宏陈欢金怡廖宁馨陈江汉第二军医大学附属长征医院皮肤科上海200003 南京金陵医院皮肤科

目的观察并分析微小RNA-146a(miR-146a)在新生隐球菌(标准株WM148)、格特隐球菌(标准株R265)刺激人单核巨噬细胞系(THP-1细胞)中表达的差异,探讨miR-146a在隐球菌所致隐球菌脑膜炎中的调控作用及机制。方法体外培养的人单核巨噬细胞系TH... 详细信息

目的观察并分析微小RNA-146a(miR-146a)在新生隐球菌(标准株WM148)、格特隐球菌(标准株R265)刺激人单核巨噬细胞系(THP-1细胞)中表达的差异,探讨miR-146a在隐球菌所致隐球菌脑膜炎中的调控作用及机制。方法体外培养的人单核巨噬细胞系THP-1细胞分成新生隐球菌诱导组、格特隐球菌诱导组,按灭活菌数∶THP-1=5∶1的比例与THP-1细胞共孵育0、3、6、9和12 h后离心收集上清液和细胞沉淀。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测各组细胞miR-146a的表达情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的释放量。结果新生隐球菌诱导组细胞中miR-146a表达量与0 h相比明显升高(P格特隐球菌诱导后,miR-146a的表达逐渐升高,12 h达到最高值,但3 h、6 h点变化与0 h比较差异并无统计学意义;上清液中TNF-α的表达12 h到达峰值;IL-6的表达逐渐增加,12 h达到最高值,变化无统计学意义。结论新生隐球菌、格特隐球菌刺激THP-1细胞炎性反应后,miR-146a表达随时间延长呈现不同的规律,TNF-α、IL-6的动态变化表现不同的特点。研究表明新生隐球菌、格特隐球菌诱导THP-1炎性反应可能存在不同的调控机制。

关键词：微小RNA-146a 新生隐球菌格特隐球菌 THP-1细胞炎性反应

格特隐球菌核基因、交配型位点和线粒体基因的多位点序列分型及重组分析

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微生物学杂志 2013年第6期33卷 26-31页

研究格特隐球菌VGI和VGII基因型菌株间线粒体基因重组与核基因、交配型位点重组间的关系。采用分子鉴定区分受试格特隐球菌的血清型、基因型和交配型;选取包含核基因和线粒体基因10个位点的多位点序列分型(MLST)进行基因型和系统发育分... 详细信息

研究格特隐球菌VGI和VGII基因型菌株间线粒体基因重组与核基因、交配型位点重组间的关系。采用分子鉴定区分受试格特隐球菌的血清型、基因型和交配型;选取包含核基因和线粒体基因10个位点的多位点序列分型(MLST)进行基因型和系统发育分析;采用同质性检验评价基因系谱间的一致性。多位点的序列和系统发育分析结合同质性检验表明,受试位点中,仅ATP6位点发现VGI和VGII菌株间基因的杂交和重组,该基因系谱与其余位点的基因系谱呈现不一致性。结果显示,受试的部分VGI菌株中的ATP6位点含有VGII菌株的基因序列,表明VGI和VGII菌株间线粒体基因的重组;没有发现核基因及交配型位点中两者间的重组,提示VGI和VGII菌株间线粒体基因的重组现象与交配行为无关。

关键词：格特隐球菌基因型 ATP6基因遗传重组系统发育分析

中国广西地区格特隐球菌的基因型分析和体外毒力特性研究

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中国广西地区格特隐球菌的基因型分析和体外毒力特性研究

作者：黄春阳广西医科大学

学位级别：硕士

目的:通过基因型分析探讨中国广西地区格特隐球菌的基因型特点及种群结构特征,并阐明临床分离的格特隐球菌与全球菌株的进化关系;同时利用体外毒力特性研究探讨格特隐球菌基因型与致病性的内在联系。方法:（1）收集2014至2018年间分离... 详细信息

目的:通过基因型分析探讨中国广西地区格特隐球菌的基因型特点及种群结构特征,并阐明临床分离的格特隐球菌与全球菌株的进化关系;同时利用体外毒力特性研究探讨格特隐球菌基因型与致病性的内在联系。方法:（1）收集2014至2018年间分离自临床确诊为隐球菌病患者的隐球菌临床株,利用CGB培养基初步筛选格特隐球菌。（2）收集并整理格特隐球菌感染的患者病历资料进行系统的回顾分析。（3）试剂盒提取格特隐球菌基因组DNA,采用多位点序列分型方法（MLST）分别扩增初步筛选所得的格特隐球菌的6个管家基因CAP59、GPD1、LAC1、PLB1、SOD1、URA5和基因间隔区IGS1以确定其序列类型（ST）和基因型,并利用交配型特异性引物鉴定格特隐球菌的交配型。（4）基于MLST测序所得的7段DNA串联序列,通过MEGA7软件构建系统发育树;并利用R语言进行主成分分析。（5）通过体外理化特性研究,包括37℃生长率、相对荚膜大小、黑素产生能力及交配实验等,观察并比较格特隐球菌的体外毒力差异。（6）根据M27-A3方案进行格特隐球菌的体外抗真菌药敏实验。结果:（1）在120株临床隐球菌中,11株隐球菌的CGB培养基初筛结果为阳性,中国广西地区格特隐球菌的分离率约为9%（11/120）。（2）在11个被确诊为格特隐球菌感染的患者中,其中10例患者为隐球菌性脑膜炎,另外1例患者为肺隐球菌病;所有患者诱导期经过两种（AMB和FLC）或三种（AMB、FLC和5FC）抗真菌药物联合治疗后,除了一例（GX0147）因病程迁延不愈放弃治疗后死亡以外,多数患者病情明显好转;所有患者均无格特隐球菌暴发流行区域的旅行史,但多数患者曾接触过鸽粪和桉树等隐球菌喜好栖息的自然生态环境。（3）MLST方法显示其中5株基因型为*** s.s.（AFLP4/VGI）,另外6株为***（AFLP6/VGII）,所有菌株交配型均为MATα。（4）虽然本研究尚未发现与加拿大及美国等格特隐球菌暴发流行区域类似的AFLP6A/VGIIa及AFLP6C/VGIIc基因亚型高毒力菌株,但是经系统发育分析以及主成分分析发现,本研究的部分AFLP6/VGII菌株与高毒力的AFLP6A/VGIIa及AFLP6C/VGIIc均起源并进化自南美巴西格特隐球菌。（5）体外毒力研究显示所有受试菌均能在37℃条件下正常生长;所有受试菌均能在体外诱导荚膜形成,且GX0104和高毒力菌株R265之间的相对荚膜大小没有显著差异;多数格特隐球菌在30℃条件下黑色素产生能力大于37℃,且部分菌株黑色素产生能力优于高毒力菌株R265;3个AFLP6/VGII菌株（GX0104、GX0105与GX0147）均可进行交配实验,形成菌丝并产生典型的担子和担孢子。（6）这些临床分离的格特隐球菌对抗真菌药物的MIC均位于敏感值范围内,尚未发现耐药菌株。结论:综上所述,经生理生化特性研究以及部分菌株能进行交配实验从而产生更多感染繁殖体的结果表明,中国广西地区可能存在高毒力高致病性的AFLP6/VGII基因型格特隐球菌,并且具有导致暴发感染的潜在风险,应引起人们的广泛关注及高度警惕。本研究的格特隐球菌具有丰富的遗传多样性,有性生殖和遗传重组可能是该地区格特隐球菌遗传多样性及毒力进化的原因之一。本研究尚未发现耐药性菌株,但其毒力因子有可能会使格特隐球菌感染患者的治疗结果复杂化。由于本研究的样本量较小,且生态研究尚未分离出格特隐球菌,因此该地区的格特隐球菌分子流行病学特点及传播规律,除了在临床上继续扩大样本量加以研究以外仍需结合环境分布进行深入探讨。

关键词：格特隐球菌多位点序列分型系统发育分析交配试验毒力