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豆科植物固氮根瘤衰老过程中的代谢调控研究进展

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华中农业大学学报 2024年第4期43卷 12-24页

作者：周宇端木德强宿州学院生物与食品工程学院宿州234000 农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室/华中农业大学生命科学技术学院武汉430070

衰老是影响豆科植物根瘤固氮效率的主要因素之一,深入探究根瘤的衰老调控机制具有重要意义。本文从衰老根瘤的形态特征和生理生化变化、衰老的途径以及物质代谢调控等方面综述根瘤衰老的研究进展,总结了豆科植物和根瘤菌中与衰老相关基... 详细信息

衰老是影响豆科植物根瘤固氮效率的主要因素之一,深入探究根瘤的衰老调控机制具有重要意义。本文从衰老根瘤的形态特征和生理生化变化、衰老的途径以及物质代谢调控等方面综述根瘤衰老的研究进展,总结了豆科植物和根瘤菌中与衰老相关基因在共生固氮过程中的功能。开发新的研究方法和技术能够更全面地揭示衰老根瘤中关键物质代谢的分子机制。深入了解根瘤衰老的分子机制有助于通过遗传改造延缓根瘤衰老,提高豆科植物的固氮效率,促进农业生产的可持续发展。

关键词：共生固氮根瘤衰老环境胁迫转录调控物质代谢

大豆半胱氨酸蛋白酶基因在根瘤衰老过程中的表达分析

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大豆半胱氨酸蛋白酶基因在根瘤衰老过程中的表达分析

作者：许泽远华中农业大学

学位级别：硕士

根瘤的固氮作用对豆科植物的生长有着重要意义,根瘤的过早衰老会对植物生长产生负面影响,因此,我们需要更好地了解根瘤的发育和衰老。在豆科植物根瘤衰老的过程中,会激活植物体内包括半胱氨酸蛋白酶在内的一系列蛋白水解酶。植物半胱氨... 详细信息

根瘤的固氮作用对豆科植物的生长有着重要意义,根瘤的过早衰老会对植物生长产生负面影响,因此,我们需要更好地了解根瘤的发育和衰老。在豆科植物根瘤衰老的过程中,会激活植物体内包括半胱氨酸蛋白酶在内的一系列蛋白水解酶。植物半胱氨酸蛋白酶主要分为木瓜蛋白酶(C1,papain-like cysteine proteinases)和豆类天冬氨酸蛋白内切酶(C13 the legumains)。已有研究表明,半胱氨酸蛋白酶参与根瘤的衰老。在紫云英中,通过RNA干扰技术将半胱氨酸蛋白酶基因AsNODF32沉默后使得根瘤的衰老得到了延缓;通过EST数据库和cDNA基因芯片等技术在大豆根瘤中发现了大量根瘤特异性的基因,其中半胱氨酸蛋白酶AN03008D06基因在根瘤衰老时表达量有明显上升。已有研究通过转录组数据分析发现有18个半胱氨酸蛋白酶在大豆根瘤发育过程中转录水平发生了一定程度的变化,本研究为了从中初步筛选出在大豆根瘤衰老过程中发挥作用的蛋白酶,利用启动子表达分析、Real-time PCR分析和荧光法测蛋白酶活研究了部分半胱氨酸蛋白酶在大豆根瘤发育及衰老后期的表达情况。研究的主要结果如下:1.扩增出18个半胱氨酸蛋白酶的启动子序列,并连接到带有报告基因GUS的载体上。利用农杆菌介导的毛根转化将重组质粒转入大豆中,观察GUS的表达来检测启动子的表达情况。目前成功得到了转入了GmNCP2pro和GmNCP17pro的转基因植株。结果显示:GmNCP2在接种4周、8周和12周的根瘤中都有表达,从4周到8周GmNCP2在根瘤中的表达量增加,从8周到12周在根瘤中的表达量降低,这表明在根瘤后期GmNCP2的表达是下降的,可能不参与根瘤的衰老;GmNCP17在接种4周、8周和12周的根瘤中也都有表达,但是与GmNCP2不同的是,从4周到12周GmNCP17在根瘤中的表达量持续增加,这表明在根瘤后期GmNCP17的表达是上升的,可能与根瘤的衰老存在一定关系。2.通过Real-time PCR分析这18个半胱氨酸蛋白酶基因在根瘤中的表达,结果显示:GmNCP1、GmNCP2、GmNCP4、GmNCP8、GmNCP9、GmNCP11、GmNCP12、GmNCP13、GmNCP14、GmNCP15、GmNCP16和GmNCP18在4周到8周的根瘤中表达量有增加,在8周到12周的根瘤中表达量有下降;GmNCP3、GmNCP5、GmNCP6、GmNCP7、GmNCP10、GmNCP17在4周到12周的根瘤中表达量持续增加;GmNCP2和GmNCP17的Real-time PCR结果与启动子结果一致。另外相对于其他研究的半胱氨酸蛋白酶而言,GmNCP3在后期根瘤中的表达量增加幅度最大,表明GmNCP3与根瘤衰老相关的可能性最大;3.为了检测GmNCP3和GmNCP17的半胱氨酸蛋白酶活性,在原核细胞中表达得到了去掉GmNCP3和GmNCP17相应抑制结构域的GmNCP3-A蛋白和GmNCP17-A蛋白,通过荧光法测定蛋白酶活,结果显示:GmNCP3-A和GmNCP17-A能分解底物;当加入了半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64后,GmNCP3-A和GmNCP17-A的蛋白酶活性受到了抑制,表明GmNCP3和GmNCP17具有半胱氨酸蛋白酶活性。

关键词：大豆半胱氨酸蛋白酶根瘤衰老启动子定型根瘤

大豆根瘤衰老相关半胱氨酸蛋白酶的分离和鉴定

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大豆根瘤衰老相关半胱氨酸蛋白酶的分离和鉴定

作者：张先鹏华中农业大学

学位级别：硕士

大豆是最重要的豆科植物,也是最重要的粮食作物之一。大豆能够与固氮细菌形成一种互利的共生关系,利用好大豆根瘤固氮特性,不仅能提高大豆产量,而且能减少化肥的使用,有利于农业可持续发展。大豆种植过程中由于环境压力会导致根瘤过早... 详细信息

大豆是最重要的豆科植物,也是最重要的粮食作物之一。大豆能够与固氮细菌形成一种互利的共生关系,利用好大豆根瘤固氮特性,不仅能提高大豆产量,而且能减少化肥的使用,有利于农业可持续发展。大豆种植过程中由于环境压力会导致根瘤过早衰老等问题影响产量,如何延缓根瘤衰老是科研与生产的重要课题。目前关于半胱氨酸蛋白酶与根瘤衰老的研究越来越多,半胱氨酸蛋白酶参与根瘤发育和衰老也已得到验证。近年来,通过RNA-seq技术发现有18个半胱氨酸蛋白酶基因在大豆根瘤成熟及衰老期表达,但还没有明确其中有多少或哪些与根瘤衰老相关。以此为背景和前提,本研究以大豆根瘤特异表达的半胱氨酸蛋白酶为研究对象,探索其中参与大豆根瘤衰老的部分,旨在为延迟大豆根瘤衰老、提高固氮效率提供科学依据和材料。主要研究成果如下:1.通过CRISPR-Cas9系统编辑大豆结瘤因子受体基因,使大豆转基因根无法正常结瘤,完善大豆毛根转化体系的同时也成功得在大豆毛根转化体系中利用CRISPR-Cas9系统敲除基因。2.将大豆根瘤特异表达的半胱氨酸蛋白酶基因分别命名为Gm NCP1～18。通过同源性分析将其分为三组,构建CRISPR-Cas9系统敲除三组基因的载体,分别命名为CRISPR A、CRISPR B和CRISPR C。毛根转化后通过观察根瘤表型与测定根瘤固氮酶活性,表明CRISPR B能延缓根瘤的衰老。3.将CRISPR B中涉及的基因分为三部分,同样构建CRISPR-Cas9系统敲除三部分基因载体。毛根转化表型表明敲除Gm NCP3基因能延缓根瘤的衰老。4.将Gm NCP3,6,10,11,12等基因在蒺藜苜蓿中异源表达,毛根转化结果表明,只有Gm NCP3与Gm NCP11能造成苜蓿根瘤的提前衰老。5.通过酵母双杂交系统探究GmNCP1～18这18个基因表达的全部蛋白与大豆根瘤特异表达的七个半胱氨酸蛋白酶抑制剂(分别命名为Gm Cys1～7)蛋白之间的互作关系,结果表明,只有Gm NCP16基因表达的两个蛋白(Gm NCP16.1和Gm NCP16.2)能分别与Gm Cys1和Gm Cys2两个蛋白在酵母中验证为互作关系。

关键词：大豆半胱氨酸蛋白酶根瘤衰老 CRISPR-Cas9系统

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硫化氢对大豆共生根瘤衰老的作用研究

硫化氢对大豆共生根瘤衰老的作用研究

作者：潘晴西北农林科技大学

学位级别：硕士

硫化氢信号分子(Hydrogen sulfide,HS)能够参与植物的生长发育过程,并在植物响应各种生物和非生物胁迫过程中发挥重要作用,因此被认定为继一氧化氮(Nitric oxide,NO)和一氧化碳(Carbon monoxide,CO)后的新的气体信号分子。然而,HS是否... 详细信息

硫化氢信号分子(Hydrogen sulfide,HS)能够参与植物的生长发育过程,并在植物响应各种生物和非生物胁迫过程中发挥重要作用,因此被认定为继一氧化氮(Nitric oxide,NO)和一氧化碳(Carbon monoxide,CO)后的新的气体信号分子。然而,HS是否参与调控大豆-根瘤菌共生固氮体系进而影响根瘤的固氮及衰老过程还不是很清楚。因此,本项目选用大豆中黄13为实验材料,从植株生长表型、氮素含量、根瘤数目及衰老根瘤所占比例、根瘤内固氮酶活性、固氮酶蛋白表达、衰老标记基因及固氮共生基因的表达等方面分析HS在大豆植物根瘤衰老以及固氮过程中的调控机制研究。研究结果如下:1.以人工气候室培养的大豆(中黄13)为实验对象,接种大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii,strain Q8)。在接种根瘤菌后三周,外源添加HS,分6个时期(3周、4周、5周、6周、7周、8周)分别收取样品,并测定大豆地上/地下干重、根瘤总数及衰老根瘤所占比例等生理指标。结果表明,相比对照组,HS处理后大豆植株干重增加、叶绿素含量下降较慢、根瘤数目增多且根瘤衰老比例减小、固氮酶活性增加、氮素营养积累较多且向豆荚转移快,表明HS影响根瘤的固氮酶活性、可延长固氮周期、促进根瘤成熟延缓衰老。2.采用石蜡切片观察6个时期不同处理条件下根瘤内的根瘤菌侵染情况以及共生体的分布。切片显示3-5周施加HS对根瘤内共生体分布与根瘤侵染状态没有明显差异,但从6周开始,未施加HS处理的根瘤共生体内出现空腔且形成一个中央衰老区,而HS处理的根瘤在7周才出现衰老区,此时未经过HS处理的根瘤衰老区已经出现根瘤结构的破坏。透射电子显微镜分析根瘤超微结构显示,在接菌后3周HS处理的根瘤中类菌体内PHB颗粒较多,接菌后5周两个处理无明显差异。但接菌后6周Q8开始出现衰退的类菌体,囊泡中出现类菌体降解后的空隙,而此时Q8+NaHS没有明显的衰老特征。接菌后7周观察到Q8类菌体有皱缩的边缘,衰老导致的杆状类菌体皱缩成圆球状的数量增多,囊泡的空隙变大。同时Q8+NaHS也开始出现衰退的类菌体。表明HS处理延缓了根瘤的衰老、延长了根瘤的活性时期。3.选用固氮酶铁蛋白(Nitrogenase ironprotein,)抗体、谷氨酰胺合成酶类蛋白(glutamate–ammonia ligase-like protein,NodGS)抗体。分别提取6个时期大豆根和根瘤的总蛋白并进行Western-blot。结果表明:HS处理后,根瘤中固氮酶铁蛋白表达量增多。谷氨酰胺合成酶类蛋白,在施加HS处理后表达增多且在接菌后4周和5周Q8、Q8+NaHS的NodGS表达差异最大,前期表达较多,而后逐渐下降。HS处理能够提高结瘤素蛋白在初生根及根瘤的发育和信号转导中的作用,使固氮酶活性保持较长时间,延长了固氮周期。4.提取6个时期的大豆根及根瘤RNA,设计植物衰老(半胱氨酸蛋白酶等)以及与共生固氮相关基因(钙调速依赖性蛋白激酶等)的特异性引物,qRT-PCR分析这些基因的表达情况。实验结果表明,外源施加HS会干扰根瘤菌侵染过程中核孔蛋白及Ca信号传递等共生基因的表达。另外,外源添加HS后,植株根和根瘤内半胱氨酸蛋白酶表达量下降,超氧化物歧化酶、谷氨酰胺合成酶相关基因表达量增高。综上所述,HS信号分子通过影响大豆根瘤菌共生体系建立过程中共生、氮代谢以及根瘤衰老过程相关基因的表达,使大豆氮素积累增多及转移加快、干重增加、根瘤产生增多且衰老比例下降、固氮酶活性升高,进而延缓根瘤的衰老进程。HS信号分子在延缓大豆衰老中具有作用,可以为提高大豆生物固氮作用、扩大固氮周期、提高氮肥利用率提供一定的理论基础和科学依据,为实现大豆高产高效提供新的思路。

关键词：硫化氢共生固氮大豆根瘤衰老固氮酶活半胱氨酸蛋白酶

菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失株生理响应机制研究

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菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失株生理响应机制研究

作者：邓硕雪南京农业大学

学位级别：硕士

豆科植物与根瘤菌共生固氮是自然界中最为高效的一种生物固氮体系。在土壤环境中,豆科植物会遇到很多正常结瘤但固氮能力不同的根瘤菌,宿主植物能否对根瘤菌固氮能力的差异做出反应,从而建立和维持稳定的共生关系?已在大豆、含羞草等植... 详细信息

豆科植物与根瘤菌共生固氮是自然界中最为高效的一种生物固氮体系。在土壤环境中,豆科植物会遇到很多正常结瘤但固氮能力不同的根瘤菌,宿主植物能否对根瘤菌固氮能力的差异做出反应,从而建立和维持稳定的共生关系?已在大豆、含羞草等植物中发现宿主限制根瘤内非固氮根瘤菌增殖、类菌体分化等生理和形态学现象,但对其响应机理却研究甚少。因此本实验以形成定型根瘤非终端分化类菌体的菜豆作为宿主植物,利用甲苯胺蓝染色技术、透射电子显微镜观察和转录组测序等多种手段来研究宿主对不同固氮能力根瘤菌的生理响应机理。实验室前期研究发现菜豆根瘤菌Rhizobium etli CFN42（wild type-WT）与nifHa/bDK突变菌株（ΔnifHa/bDK,固氮缺失株）1:1共同接种到菜豆植株根部后,菜豆对固氮缺失株ΔnifHa/bDK在根瘤数量的形成上有一定的限制作用,ΔnifHa/bDK菌株单独占瘤率一直处于较低水平,而WT菌株的单独占瘤率逐步升高,最终达到80%,表明菜豆可以识别固氮缺失株ΔnifHa/bDK并作出一定的反应。本论文主要是在WT和ΔnifHa/bDK单独接种的条件下,研究菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失株ΔnifHa/bDK的生理响应机制,主要结果如下:（1）为研究nifHa/bDK对菜豆根瘤菌CFN42-菜豆结瘤固氮的影响,首先分别测定野生型菌株CFN42单独接种、固氮缺失株ΔnifHa/bDK单独接种和二者1:1混合接种宿主菜豆后2-5周的根瘤固氮酶活性,结果显示单独接种ΔnifHa/bDK根瘤的固氮酶活性丧失,单独接种WT和WT与ΔnifHa/bDK混合接种的植株,3周龄根瘤固氮酶活性最高,达到20000 μmol C2H4/hr/g以上,此后随植株生长趋势逐渐下降。其次分别对WT、ΔnifHa/bDK单独接种和二者1:1混合接种植株的结瘤情况进行检测,结果显示,第6周,WT单独接种与两种菌株1:1混合接种植株的根瘤数量均在120颗/株左右,而单独接种ΔnifHa/bDK植株的根瘤数量达到220颗/株左右,产生超结瘤现象,与单独接种WT植株的根瘤数量间存在显著差异（P＜0.0001）,从植物对氮源的需求角度看,接种ΔnifHa/bDK植物无法获得足够的氮源,所以植物产生更多的根瘤以期获得足够的氮源。（2）为研究菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失株ΔnifHa/bDK的生理响应,首先利用超景深体式显微镜对菜豆根瘤的颜色形态进行观察,接种ΔnifHa/bDK的2周龄根瘤呈白色,后期颜色逐渐加深,第4周根瘤颜色已变为棕褐色,部分根瘤甚至出现中空皱缩（典型的根瘤衰老现象）,而接种WT的2周龄根瘤呈粉红色,到第4周大部分根瘤颜色依然呈粉红色,具有固氮能力,表明ΔnifHa/bDK形成的根瘤出现提前衰老现象。分别对单独接种WT和ΔnifHa/bDK根瘤中的菌体数量进行检测,从而比较两种不同固氮能力的根瘤菌在宿主适应性上的差异,结果显示,2-5周,接种WT根瘤中的菌体数量高于接种ΔnifHa/bDK根瘤中的菌体数量,两者之间存在显著性差异,接种WT根瘤中的平均菌体数量在第4周达到最高,而接种ΔnifHa/bDK根瘤中的平均菌体数量在第2周达到峰值,随后逐渐降低,第5周时近1/6的根瘤中已检测不到该菌株,表明WT在宿主根瘤中的适应性明显优于ΔnifHa/bDK。通过对甲苯胺蓝染色的根瘤切片观察发现,接种WT的2周龄根瘤,侵染细胞发育良好、形态饱满可见液泡,而接种ΔnifHa/bDK的2周龄根瘤中,部分侵染细胞的液泡破裂,第4周ΔnifHa/bDK的侵染细胞与WT相比发生不规则变形、皱缩,且大多数侵染细胞内,液泡发生破裂,表明ΔnifHa/bDK侵染的宿主细胞出现提前衰老。利用透射电子显微镜对WT和ΔnifHa/bDK分化的类菌体进行形态观察,发现接种ΔnifHa/bDK的2周龄根瘤细胞的共生体膜发生分解,到第4周大部分共生体膜都已分解,并且出现细胞破裂、类菌体被释放到细胞间隙的现象,表明ΔnifHa/bDK菌株的侵染细胞逐渐凋亡,而在接种WT的根瘤切片中没有发现该现象。以上结果表明菜豆通过降低根瘤内固氮缺失株的菌体数量或迫使根瘤提前衰老从而对ΔnifHa/bDK产生一定的限制或制裁,以维持共生关系的稳定。（3）为探究菜豆对菜豆根瘤菌CFN42固氮缺失菌株ΔnifHa/bDK的生理响应机制,采用RNA-Seq技术对单独接种WT和单独接种ΔnifHa/bDK的菜豆根瘤RNA进行测序分析,结果发现与单独接种WT相比,单独接种ΔnifHa/bDK处理下,5977个基因的表达水平发生了显著变化（| log2 ratio |≥1）,其中3264个基因上调表达,2713个基因下调表达。对差异表达基因进行KEGG pathway富集分析,发现差异表达基因主要富集

关键词：菜豆根瘤菌宿主制裁根瘤衰老共生固氮

豆科植物结瘤因子受体及半胱氨酸蛋白酶在共生固氮中的功能研究

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豆科植物结瘤因子受体及半胱氨酸蛋白酶在共生固氮中的功能研究

作者：陈梦肖华中农业大学

学位级别：硕士

豆科植物与根瘤菌建立的共生固氮作用被广泛研究和应用,在农业、环境、经济等方面都具有重大的应用价值。目前,众多研究者从根瘤菌、宿主植物及外界环境等方面入手,不断更新和完善根瘤菌-豆科植物共生固氮的分子机理。作为共生信号途径... 详细信息

豆科植物与根瘤菌建立的共生固氮作用被广泛研究和应用,在农业、环境、经济等方面都具有重大的应用价值。目前,众多研究者从根瘤菌、宿主植物及外界环境等方面入手,不断更新和完善根瘤菌-豆科植物共生固氮的分子机理。作为共生信号途径的关键基因,结瘤因子受体(Nod Factor Receptors,NFR)发挥着至关重要的作用。结瘤因子受体是一类LysM型受体,识别结瘤因子(Nod Factor,NF)并激活共生信号传导途径,最终导致根瘤菌入侵宿主植物,并形成根瘤。而对于根瘤衰老,除了外界因素的影响,还引发了一系列生理生化变化,其中就包括了半胱氨酸蛋白酶基因(Cysteine proteases,CYP)的表达。将LjNFR1-LjNFR5共转入蒺藜苜蓿并接种*** MAFF303099可结瘤,在此基础上,本文第一章以大豆(Glycine max)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、百脉根(Lotus japonicus)nfr突变体为材料,探索大豆、百脉根的NFRs结构及其功能,旨在扩大根瘤菌的宿主范围。第二章以百脉根MG20为材料,探索LjCYPs在根瘤衰老中的作用,为后期提供理论依据和实验材料。主要研究结果如下:1.将LjNFR1-LjNFR5共转互补Gmnfr5突变体可以和大豆根瘤菌共生结瘤,但不能与百脉根根瘤菌共生结瘤。而GmNFR1α-GmNFR5α共转互补Mtnfp突变体时并不能与大豆根瘤菌共生结瘤。2.以GmNFRs、LjNFRs为研究对象,通过改变NFRs的胞内域结构、胞外域结构,分别互补Ljnfr1、Ljnfr5突变体,并接种百脉根根瘤菌NZP2235/Lac Z。结果表明GmNFR1α不能互补Ljnfr1突变体,而GmNFR5α能完全互补Ljnfr5突变体正常结瘤,也说明LjNFR胞外域是一个绝对保守的结构,在共生过程中起着至关重要的作用,影响着共生能否正常进行。3.利用生物软件分析得到8个可能与根瘤衰老相关的LjCYPs,以此为基础进行Real-time PCR检测8个LjCYPs在百脉根根瘤后期的表达,结果表明Lj1g3v4047290.1、LjCYP1、LjCYP3、LjCYP5均在根瘤后期(7-10 w)表达量呈上调趋势,尤其是LjCYP5上调趋势明显。4.利用CRISPR-Cas9体系及百脉根毛根转化技术分别单敲除LjCYP3、双敲除LjCYP1-LjCYP5,结果表明百脉根根瘤基因组均发生了编辑,以碱基缺失与插入为主,最终影响百脉根根瘤固氮效率及衰老。第一,利用TUNEL法检测接种7 w根瘤时,单敲除LjCYP3与双敲除LjCYP1-LjCYP5均可有效延缓根瘤凋亡与衰老;第二,利用乙炔还原酶法检测接种9 w时根瘤的固氮酶活,单敲除LjCYP3与双敲除LjCYP1-LjCYP5均能极显著提高根瘤固氮酶活;第三,从根瘤衰老情况来看,单敲除LjCYP3时红瘤显著多于对照,双敲除LjCYP1-LjCYP5时红瘤极显著多于对照而衰老根瘤极显著少于对照。

关键词：根瘤菌结瘤因子受体共生固氮半胱氨酸蛋白酶根瘤衰老 CRISPR-Cas9体系