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猪流行性腹泻病毒S1蛋白的原核表达及其核酸适配体的筛选

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畜牧兽医学报 2025年第2期56卷 839-850页

作者：张冬萱王智豪乔岩赵肖肖范松杰张超河南农业大学动物医学院农业农村部动物生化与营养重点开放实验室郑州450046

本文旨在可溶性原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1蛋白的C端结合域(S1-CTD),并利用指数富集的配体系统进化技术筛选靶向S1-CTD蛋白的DNA适配体,为该病毒治疗药物的开发以及检测方法的建立奠定基础。采... 详细信息

本文旨在可溶性原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1蛋白的C端结合域(S1-CTD),并利用指数富集的配体系统进化技术筛选靶向S1-CTD蛋白的DNA适配体,为该病毒治疗药物的开发以及检测方法的建立奠定基础。采用大肠杆菌原核表达系统,将PEDV-S1-CTD质粒与带有麦芽糖结合蛋白(MBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、反转录终止因子(NusA)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)四种促溶标签的原核表达载体pET21b连接,构建重组质粒pET21b-MBP-S1、pET21b-SUMO-S1、pET21b-NusA-S1、pET21b-GST-S1,将双酶切鉴定和测序正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21进行诱导表达,选择可溶性好且表达量高的rMBP-S1重组蛋白进行后续试验,Western blot结果显示该重组蛋白正确表达,间接免疫荧光试验(IFA)结果表明rMBP-S1能与细胞表面受体结合。随后经磁珠法筛选得到111条靶向rMBP-S1重组蛋白的候选DNA适配体,其中Apt-S1-3、Apt-S1-11富集程度最高,分别是18%和16.2%,酶联适配体吸附试验ELASA(enzyme-linked aptamer sorbent assays,ELASA)测定适配体Apt-S1-3的解离常数为2.09 nmol,并且该适配体不与rMBP蛋白、rMBP-gD蛋白、rMBP-GP5蛋白以及BSA蛋白发生交叉反应,表明该适配体具有高亲和力与高特异性。此外,使用在线软件Mfold分析适配体Apt-S1-3形成的二级结构,并且通过分子对接模拟,发现该适配体能够与靶标蛋白形成稳定的复合物。最后的间接免疫荧光试验表明适配体Apt-S1-3能够识别PEDV,流式细胞术试验证实该适配体能够抑制PEDV感染宿主细胞。本研究筛选得到的DNA适配体能够与猪流行性腹泻病毒S1-CTD蛋白高亲和力、高特异性结合,而且能够抑制猪流行性腹泻病毒感染细胞,为PEDV的靶向治疗和检测方法开发奠定基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S1-CTD蛋白磁珠法核酸适配体亲和力

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基于AS1411核酸适配体和金纳米颗粒组装新型生物传感器及其在超灵敏检测肿瘤细胞中的应用

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分析科学学报 2025年第1期41卷 21-27页

作者：王艳艳杨柳韩浩健徐永权邢文竹许萌陈恋菊文庆莲赵云冬郝峰北华大学医学技术学院吉林医药学院检验学院西南医科大学附属医院肿瘤科

AS1411核酸适配体可与表达在肿瘤细胞上的核蛋白结合，将其与纳米材料偶联建立一种传感平台，用于肿瘤细胞的超灵敏检测。以金纳米颗粒（AuNPs）为中心，通过金-硫醇键将聚乙二醇（PEG）衍生物与AuNPs链接。在反应体系中加入巯基聚乙二... 详细信息

AS1411核酸适配体可与表达在肿瘤细胞上的核蛋白结合，将其与纳米材料偶联建立一种传感平台，用于肿瘤细胞的超灵敏检测。以金纳米颗粒（AuNPs）为中心，通过金-硫醇键将聚乙二醇（PEG）衍生物与AuNPs链接。在反应体系中加入巯基聚乙二醇马来酰亚胺（SH-PEG-MAL）偶联剂，生成AuNPs-SH-PEG-MAL。进一步，将带有5-羧基荧光素（5-FAM）的AS1411核酸适配体与AS1411互补DNA单链结合，形成传感探针，最终构建了一个“开关式”的特异性检测传感器。所制备的传感器在10～300个细胞/mL范围内，荧光强度与人宫颈癌Hela细胞和人乳腺癌MCF-7细胞浓度呈良好线性关系。Hela细胞的线性相关系数为R2=0.991、检出限5个细胞/mL;MCF-7细胞的线性相关系数为R2=0.983,检出限为7个细胞/mL。本研究建立的传感器具有重复性好、稳定性强等优点，实现了“超灵敏”检测肿瘤细胞的目的，有望为临床肿瘤患者早期诊断提供新的思路和技术手段。

关键词：肿瘤细胞 AS1411 核酸适配体金纳米颗粒传感器

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核酸适配体技术及其在法医学精阴混合斑中的应用

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中国法医学杂志 2025年第01期 83-89+95页

作者：聂昊陈静赵兴春杨瑞琴中国人民公安大学侦查学院公安部鉴定中心

作为法医物证鉴定中的疑难检材，精子和上皮细胞的混合样本因检验过程繁琐、分离效果欠佳、结果解释复杂，成为困惑司法实践已久的技术难题。通过核酸适配体筛选技术结合分子对接、高通量测序等分子生物学、化学交叉融合手段对筛选得到... 详细信息

作为法医物证鉴定中的疑难检材，精子和上皮细胞的混合样本因检验过程繁琐、分离效果欠佳、结果解释复杂，成为困惑司法实践已久的技术难题。通过核酸适配体筛选技术结合分子对接、高通量测序等分子生物学、化学交叉融合手段对筛选得到的精子细胞特异性的核酸适配体参数进行优化表征有助于富集、分离单一来源的精子细胞STR分型。本文就核酸适配体技术的发展现状、自身优势和存在问题进行综述，探讨其在法医学精阴混合斑检验鉴定中的应用前景，以期为混合DNA样本的检验鉴定、结果及时的证据化提供新的研究思路，促进科学化检验鉴定结果的诉讼效益最大化。

关键词：法医物证混合样本核酸适配体应用前景证据化

核酸适配体电化学传感技术在食品安全中的应用

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食品安全导刊 2025年第6期 173-176页

作者：刘欢汪恩婷陈玉皎骆小方刘方菁丁龙重庆市食品药品检验检测研究院重庆401121 重庆大学生物工程学院重庆400044 国家市场监管重点实验室(调味品监管技术) 重庆401121 重庆市计量质量检测研究院重庆401121 金凤实验室重庆401329 西北农林科技大学食品科学与工程学院陕西咸阳712100

本文论述核酸适配体、电化学传感技术等的原理和特点,并分析核酸适配体电化学传感技术在食品中塑化剂等污染物、赭曲霉毒素A等真菌毒素、卡那霉素和氯霉素等抗生素检测中的应用。通过探讨核酸适配体电化学传感技术的高特异性、高灵敏度... 详细信息

本文论述核酸适配体、电化学传感技术等的原理和特点,并分析核酸适配体电化学传感技术在食品中塑化剂等污染物、赭曲霉毒素A等真菌毒素、卡那霉素和氯霉素等抗生素检测中的应用。通过探讨核酸适配体电化学传感技术的高特异性、高灵敏度和快速检测等优点,提出筛选稳定核酸适配体、优化电极材料、高通量筛查等发展方向,以期为核酸适配体电化学传感技术在食品安全中的进一步应用提供有益参考。

关键词：核酸适配体电化学传感器食品安全

核酸适配体封盖的介孔二氧化硅纳米颗粒用于肌红蛋白的检测

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高等学校化学学报 2017年第2期38卷 187-192页

作者：高蕾王青羊小海王柯敏邓鹏张华李志平湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室化学化工学院生物纳米与分子工程湖南省重点实验室长沙410082

利用核酸适配体封盖的介孔二氧化硅纳米颗粒构建了一种新型、简便及免标记的肌红蛋白定量检测方法.首先,用肌红蛋白核酸适配体将荧光小分子罗丹明6G封盖在介孔颗粒内,当存在目标物肌红蛋白时,由于介孔颗粒上的核酸适配体可特异性结合肌... 详细信息

利用核酸适配体封盖的介孔二氧化硅纳米颗粒构建了一种新型、简便及免标记的肌红蛋白定量检测方法.首先,用肌红蛋白核酸适配体将荧光小分子罗丹明6G封盖在介孔颗粒内,当存在目标物肌红蛋白时,由于介孔颗粒上的核酸适配体可特异性结合肌红蛋白而脱离介孔颗粒表面,进而释放介孔颗粒内的罗丹明6G,使溶液荧光强度增强.实验结果表明,荧光强度与肌红蛋白的浓度呈正相关,通过荧光强度的变化可实现对肌红蛋白的定量检测.该方法的检出限低至1.1 nmol/L,且选择性好,可满足临床医学的检测要求.

关键词：核酸适配体肌红蛋白介孔二氧化硅纳米颗粒

核酸适配体功能化近红外量子点结合流式细胞术快速检测白血病细胞

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高等学校化学学报 2014年第10期35卷 2093-2099页

作者：汤进录石慧何晓晓王柯敏李朵颜律安雷艳丽刘剑波湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室长沙410082 湖南大学化学化工学院长沙410082 湖南大学生物纳米与分子工程湖南省重点实验室长沙410082 湖南大学生物学院长沙410082

利用作为肿瘤细胞识别分子的核酸适配体(Aptamer)的高特异性和高亲和力以及作为信号报告单元的近红外量子点(QDs)的高荧光发射强度和低生物背景干扰特性,构建了一种基于Aptamer功能化近红外QDs的新型纳米荧光探针,并进一步结合流式细胞... 详细信息

利用作为肿瘤细胞识别分子的核酸适配体(Aptamer)的高特异性和高亲和力以及作为信号报告单元的近红外量子点(QDs)的高荧光发射强度和低生物背景干扰特性,构建了一种基于Aptamer功能化近红外QDs的新型纳米荧光探针,并进一步结合流式细胞术在单细胞荧光分析方面的高通量、简便和快速等优势,建立了一种检测白血病细胞的新方法.以基于Cell-SELEX(Cell-based systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术针对CCRF-CEM人急性白血病细胞筛选的特异性Aptamer Sgc8c为模型,构建了Sgc8c-QDs探针,其仅需与细胞样品培育30 min即可实现对缓冲液和血清中靶细胞的简单、快速和高特异性检测.与传统荧光染料标记技术相比,该方法不仅大大提高了分析灵敏度,还显示出对血清等复杂生物样品的高适用性和优良检测性能.鉴于Cell-SELEX技术在其它白血病细胞Aptamer筛选领域的应用潜力,该方法有望作为一种通用技术在白血病诊断及预后监测等方面发挥重要作用.

关键词：核酸适配体量子点流式细胞术白血病癌细胞检测

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核酸适配体在多肽研究中的应用

分析化学 2017年第12期45卷 1795-1803页

作者：覃诗雅陈南迪王青黄晋何晓晓刘剑波郭秋平羊小海王柯敏湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室化学化工学院生物纳米与分子工程湖南省重点实验室

多肽在生命体的生理过程中发挥着重要作用,其生理功能一直是生物学、药理学和医学等领域的重要研究内容。核酸适配体是经体外筛选获得的单链DNA或RNA,能与靶标高亲和力、高特异性地结合,有"化学抗体"或"化学家的抗体"之称。以多肽为靶... 详细信息

多肽在生命体的生理过程中发挥着重要作用,其生理功能一直是生物学、药理学和医学等领域的重要研究内容。核酸适配体是经体外筛选获得的单链DNA或RNA,能与靶标高亲和力、高特异性地结合,有"化学抗体"或"化学家的抗体"之称。以多肽为靶标筛选获得的核酸适配体主要有两大用途:一是基于其识别功能,作为亲和试剂来建立分析检测方法或开展生物成像研究;二是基于它们的生物学活性,作为拮抗剂在活体水平影响靶标多肽的正常功能,阻碍下游信号通路,从而对疾病进行治疗。本文总结了近年来以多肽为靶标筛选的核酸适配体在体内及体外的用途,并探讨了其在筛选、表征及应用中存在的问题,并对其未来的发展趋势进行了展望。

关键词：多肽核酸适配体分析检测生物成像拮抗剂评述

核酸适配体纳米金共振散射光谱检测血清中钾离子

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光谱学与光谱分析 2010年第11期30卷 3115-3118页

作者：刘庆业范燕燕李廷盛梁爱惠蒋治良广西师范大学环境与资源学院广西环境工程与保护评价重点实验室广西桂林541004

在pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中,纳米金与适配体(aptamer)结合形成较稳定的aptamer-Au复合物,且不被NaCl聚集。在85℃水浴中,K+与aptamer作用后折叠形成稳定的G-四分体结构复合物且释放出纳米金。在高浓度盐作用下,纳米金聚集成较... 详细信息

在pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中,纳米金与适配体(aptamer)结合形成较稳定的aptamer-Au复合物,且不被NaCl聚集。在85℃水浴中,K+与aptamer作用后折叠形成稳定的G-四分体结构复合物且释放出纳米金。在高浓度盐作用下,纳米金聚集成较大粒径的纳米金颗粒,导致体系563nm处的共振散射强度增大,其平均粒径为120nm。文章研究了K+ -随机单链DNA1(ssDNA1)-纳米金、K+ -ssD-NA2-纳米金和K+ -aptamer-纳米金体系的共振散射光谱特性,并用圆二色光谱技术证明了核酸适配体结构的变化。考察了pH、NaCl浓度、aptamer浓度、纳米金用量以及Cu2+、Mg2+、Pb2+、Ca2+、Al3+、Zn2+Fe3+等常见重金属离子等对测定K+的影响,结果显示这些离子不干扰测定,该法具有较好的选择性。在选定条件下,K+浓度在0.67～3350μmol·L-1范围与共振散射峰值ΔI呈良好的线性关系,回归方程、相关系数、检出限分别为ΔI=0.167c-0.7,0.9932,0.3μmol·L-1 K+。该法用于血清样品分析,结果与离子选择电极法一致。

关键词：核酸适配体 K+ 纳米金共振散射光谱

核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展

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化工学报 2013年第1期64卷 233-242页

作者：李晓佩杨良嵘黄昆李文松孙西同刘会洲中国科学院过程工程研究所中国科学院绿色过程与工程重点实验室北京100190 中国科学院研究生院北京100190

核酸适配体是一种能够特异性地识别目标物的寡聚核苷酸,可以是RNA也可以是DNA。较其他识别分子而言,适配体具有性质稳定、易合成、易标记、分子量较小和目标分子广泛等优势。目前核酸适配体主要被应用在检测、分离纯化和医疗三大领域,... 详细信息

核酸适配体是一种能够特异性地识别目标物的寡聚核苷酸,可以是RNA也可以是DNA。较其他识别分子而言,适配体具有性质稳定、易合成、易标记、分子量较小和目标分子广泛等优势。目前核酸适配体主要被应用在检测、分离纯化和医疗三大领域,本文主要论述了适配体在生化分离及检测领域中的研究进展。

关键词：核酸适配体识别分子生化分离检测