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核酸适体探针对血液肿瘤细胞的识别及其稳定性研究

核酸适体探针对血液肿瘤细胞的识别及其稳定性研究

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作者：邓珂湖南大学

学位级别：硕士

血液肿瘤是威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一。对血液肿瘤细胞的准确分型,有利于实现血液肿瘤的早期诊断和治疗并提高血液肿瘤的治愈率。基于SELEX技术筛选的核酸适体探针不仅具有类似于抗体的高亲和力和高特异性,在许多方面更优于抗体,... 详细信息

血液肿瘤是威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一。对血液肿瘤细胞的准确分型,有利于实现血液肿瘤的早期诊断和治疗并提高血液肿瘤的治愈率。基于SELEX技术筛选的核酸适体探针不仅具有类似于抗体的高亲和力和高特异性,在许多方面更优于抗体,有望作为一种新型的“诊断抗体”,应用于血液肿瘤的诊断与治疗。本论文瞄准这一前沿研究方向,围绕基于细胞-SELEX技术筛选的核酸适体探针对血液肿瘤细胞的识别及其在血液中的稳定性研究,开展了以下三个方面工作:1、基于细胞-SELEX技术筛选的核酸适体探针对不同环境中恶性淋巴瘤细胞的识别研究采用流式细胞术,系统地考察了基于细胞-SELEX技术筛选的用于特异性识别恶性淋巴瘤Ramos细胞的核酸适体探针TD05对置于不同环境中的体外培养Ramos细胞和原代培养Ramos细胞的识别效果,并与针对Ramos细胞细胞膜表面抗原的特异性抗体CD19识别Ramos细胞的情况进行比较。结果表明:TD05能有效识别置于不同环境中不同来源的Ramos细胞,显示出优越的反应条件适应性。它有望作为一种新型“诊断抗体”,在血液肿瘤的早期诊断与临床检测中发挥重要作用。2、基于细胞-SELEX技术筛选的核酸适体探针血液稳定性研究分别采用20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和流式细胞术,对核酸适体探针TD05在血液中的稳定性进行了考察。在不影响核酸适体探针识别肿瘤细胞的亲和力和特异性的前提下,通过反转T碱基和锁核酸这两种化学修饰方法分别对TD05进行修饰,并对修饰后的TD05的血液稳定性进行了考察。在此基础上,采用流式细胞术检测了修饰后的TD05对肿瘤细胞的亲和力和特异性的变化。结果表明:反转T碱基和锁核酸的修饰能有效提高TD05的血液稳定性,使TD05的半衰期从0.5小时延长至3小时以上,并且不影响其识别Ramos细胞的亲和力和特异性,为进一步实现核酸适体探针TD05在活体检测中的应用提供了技术支持。3、基于细胞-SELEX技术筛选的核酸适体探针识别构型的初步探讨通过对基于细胞-SELEX技术筛选的用于特异性识别急性白血病细胞的核酸适体探针sgc8c分别进行荧光淬灭、荧光共振能量转移标记以及PEG和互补序列修饰,通过采用流式细胞术对经修饰的sgc8c识别急性白血病CCRF-CEM细胞的情况考察,对sgc8c识别细胞时所形成的三维构型进行了初步探讨。结果表明:sgc8c在识别CCRF-CEM细胞时,其5′端和3′端很可能形成杂交,且此杂交部分对识别CCRF-CEM细胞起着十分重要的作用。这些结果的获得为进一步实现核酸适体探针sgc8c应用于肿瘤的诊断检测提供了参考依据。

关键词：核酸适体探针细胞-SELEX 血液肿瘤血液稳定性三维空间构型

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基于荧光纳米标记与介电泳技术的细胞体系检测研究

基于荧光纳米标记与介电泳技术的细胞体系检测研究

引用

作者：郭倩湖南大学

学位级别：硕士

细胞体系的检测与食品安全检测、疾病诊断、环境监测等领域息息相关,因此,快速、准确地检测细胞体系具有举足轻重的意义。目前,细胞体系检测的常用方法主要包括荧光分析法、酶联免疫分析法、生物传感器、流式细胞术等。这些方法在缩短... 详细信息

细胞体系的检测与食品安全检测、疾病诊断、环境监测等领域息息相关,因此,快速、准确地检测细胞体系具有举足轻重的意义。目前,细胞体系检测的常用方法主要包括荧光分析法、酶联免疫分析法、生物传感器、流式细胞术等。这些方法在缩短检测时间、提高检测灵敏度和准确性等方面作出了重要贡献。然而,在将这些方法用于细胞体系检测时,通常还存在着样品需要预富集、信号强度受限制等缺陷。因此,待测样品在同步检测过程中实现有效分离与富集以及增强检测过程中获取信号的强度对于建立快速、灵敏的细胞体系检测新技术十分必要。近年来,具有高荧光强度和较好光稳定性的荧光纳米粒颗粒已被广泛应用于生物医学分析领域,相对于传统的标记方法,功能化荧光纳米颗粒标记技术能大大提高检测灵敏度和光稳定性;同时,介电泳理论和微电加工技术的快速发展,为样品中少量细胞作为对象的超灵敏检测提供了新的契机。本论文瞄准细胞体系的快速、灵敏检测这一重要研究方向,在对细胞体系主要是病原菌细胞和肿瘤细胞检测方法进行简要综述的基础上,以荧光纳米颗粒标记、核酸适体探针识别特性与介电泳富集技术用于大肠杆菌O157：H7、CEM细胞等重要细胞的快速、灵敏检测为主线,主要开展了以下几个方面的研究工作： 1、生物修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒对大肠杆菌O157：H7介电性质的影响设计并利用抛物线电极研究了生物修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒结合到大肠杆菌O157：H7表面后对大肠杆菌O157：H7介电性质所产生的影响。通过考察50KHz-100MHz的频率范围内大肠杆菌O157：H7和表面结合了生物修饰的二氧化硅纳米颗粒后的大肠杆菌O157：H7的介电泳行为,发现大肠杆菌O157：H7在50KHz-80MHz频率范围内表现为正介电泳行为,在90MHz-100MHz频率范围内表现为负介电泳行为;结合了生物修饰的二氧化硅纳米颗粒后的大肠杆菌O157：H7在50KHz-60MHz频率范围内表现为正介电泳行为,在70MHz-100MHz频率范围内表现为负介电泳行为。研究结果表明结合生物修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒后,大肠杆菌O157：H7的正负介电泳的临界频率从90MHz变成70MHz,生物修饰的纳米颗粒结合在大肠杆菌O157：H7表面后对大肠杆菌O157：H7的介电性质产生了一定影响。该研究工作为用介电泳富集技术快速、灵敏检测大肠杆菌O157：H7细胞打下了实验基础。 2、基于介电泳富集技术和荧光纳米颗粒信号增强的微流控大肠杆菌O157：H7检测研究在研究生物修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒对大肠杆菌O157：H7介电性质的影响基础上,提出了一种结合荧光纳米颗粒标记和介电泳在线富集技术的快速、灵敏、方便的微流控检测病原菌新方法。以大肠杆菌0157：H7为检测对象,通过采用具有信号增强作用的包裹钌吡啶荧光染料的羧基化二氧化硅纳米颗粒修饰识别大肠杆菌0157：H7的特异性抗体,实现对大肠杆菌0157：H7的选择性结合与识别,在此基础上,在特定频率的交流电场下,利用设计的微流控芯片对标记生物修饰的荧光纳米颗粒的大肠杆菌0157：H7进行定向富集,再通过测量富集区域荧光信号的强度,实现对大肠杆菌0157：H7进行定量检测。由于未与大肠杆菌0157：H7结合的纳米颗粒不会表现正介电泳行为,在微流控芯片中直接被冲走。因此,这种新方法成功地将需要去除多余荧光纳米颗粒的分离与洗涤过程整合到检测过程中。该方法对大肠杆菌0157：H7检测的线性范围为4.2×102～4.2×106cfu/mL,对去离子水中大肠杆菌0157：H7的检测限为64cfu/mL。同时,我们在人工污染的实际水样品中能精确检测到420cfu/mL的大肠杆菌0157：H7。该方法的整个检测过程可以在80min内完成,为实现在食物、水中和环境样品快速、灵敏、低成本地检测病原菌的方法提供了契机。 3、基于介电泳富集技术和Aptamer识别特性的CEM细胞检测研究将核酸适体探针（Aptamer）对肿瘤细胞的特异性识别与结合作用和介电泳富集技术相结合,发展了一种新型的基于核酸适体探针识别特性与介电泳富集技术的CEM细胞检测方法。通过采用FAM-sgc8c核酸适体探针对目标CEM细胞进行特异性识别后,将其加入到设计好的电极芯片上,用波形/函数发生器提供一定的电压与频率,通过介电泳力将FAM-sgc8c识别的CEM细胞富集在检测区域,采用荧光显微镜对聚集的CEM细胞进行荧光成像检测。结果表明,该方法可以成功应用于在缓冲液体系中检测CEM细胞,检测线性范围是8.1×104-1.2×106cells/mL,在10μL5%蔗糖溶液的缓冲液中最低可检测到1200个CEM细胞。整个检测步骤包括样品预处理可在4h内完成,有望应用于临床实际标本中肿瘤细胞的检测。

关键词：介电泳富集荧光纳米颗粒细胞体系大肠杆菌0157 H7 CEM细胞核酸适体探针

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