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核酸等温扩增技术在水产病原体快速检测中的应用

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福建农林大学学报（自然科学版） 2018年第5期47卷 530-540页

作者：庞建虎乔龙亮朱鹏高威芳章礼萍宁波大学海洋学院浙江宁波315211 宁波海洋研究院浙江宁波315832

有别于费力和费时的传统病原体检测方法,基于靶基因的分子生物学检测方法以其快速和灵敏的特点逐渐成为现代水产病原体检测的首选.在众多分子生物学检测方法中,尤以核酸等温扩增技术备受关注.本文对各种核酸等温扩增技术在水产病原体检... 详细信息

有别于费力和费时的传统病原体检测方法,基于靶基因的分子生物学检测方法以其快速和灵敏的特点逐渐成为现代水产病原体检测的首选.在众多分子生物学检测方法中,尤以核酸等温扩增技术备受关注.本文对各种核酸等温扩增技术在水产病原体检测中的应用进行了综述,阐述了各种核酸等温扩增技术的原理,对比分析了各种核酸等温扩增技术的优劣,介绍了该技术在水产病原体检测中的应用现状,展望了该技术的发展趋势,旨在促进我国水产病原体现场快速检测技术的发展.

关键词：核酸等温扩增水产病原体快速检测

重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立

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中国血吸虫病防治杂志 2018年第3期30卷 273-277,306页

作者：赵松李婷杨坤李伟张键锋郭利川刘燕红戴洋应清界羊海涛国家卫生和计划生育委员会寄生虫病预防与控制技术重点实验室江苏省寄生虫与媒介控制技术重点实验室江苏省血吸虫病防治研究所无锡214064 江苏省奇天生物科技有限公司

目的建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(RAA)。方法以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系。应用此方法与聚合酶链式反应(PCR)同时扩增梯... 详细信息

目的建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(RAA)。方法以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系。应用此方法与聚合酶链式反应(PCR)同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性。结果建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成。以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为0.01 ng/μL。建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值。

关键词：日本血吸虫基因片段核酸等温扩增重组酶

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

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中国血吸虫病防治杂志 2019年第5期31卷 468-473页

作者：张强丁昕吴小珉刘燕红刘剑峰徐祥珍应清界曹俊戴洋国家卫生健康委员会寄生虫病预防与控制技术重点实验室、江苏省寄生虫与媒介控制技术重点实验室、江苏省血吸虫病防治研究所无锡214064 江南大学公共卫生研究中心江苏省奇天生物科技有限公司

目的建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法(RAA)。方法以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重... 详细信息

目的建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法(RAA)。方法以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力。结果成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39℃20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力。结论成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。

关键词：华支睾吸虫核酸等温扩增重组酶检测效能

基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫基因检测方法的建立

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中国血吸虫病防治杂志 2020年第4期32卷 335-339,344页

作者：赵松刘燕红叶钰滢李伟张键锋郭利川应清界羊海涛杨坤国家卫生健康委员会寄生虫病预防与控制技术重点实验室、江苏省寄生虫与媒介控制技术重点实验室、江苏省血吸虫病防治研究所无锡214064 江苏省奇天生物科技有限公司

目的建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(Recombinase-aided amplification,RAA)。方法以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光... 详细信息

目的建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(Recombinase-aided amplification,RAA)。方法以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系。分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性。结果建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL。以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性。结论成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DN A检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好。

关键词：曼氏血吸虫基因检测核酸等温扩增荧光探针重组酶

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基于微流控芯片的核酸等温扩增技术研究进展

中国生物工程杂志 2021年第2期41卷 116-128页

作者：时忠林崔俊生杨柯胡安中李亚楠刘勇邓国庆朱灿灿朱灵安徽大学合肥230601 中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所安徽省生物医学光学仪器工程技术研究中心安徽省医用光学诊疗技术与装备工程实验室合肥230031

核酸等温扩增技术是一种在恒温体系内对核酸进行高效扩增的分子扩增技术,它能够在短时间内实现目的基因的指数增长。微流控芯片(microfluidic chip)技术是把研究样品制备、核酸富集、纯化和检测等多个操作步骤集成到一块"微型化"的芯片... 详细信息

核酸等温扩增技术是一种在恒温体系内对核酸进行高效扩增的分子扩增技术,它能够在短时间内实现目的基因的指数增长。微流控芯片(microfluidic chip)技术是把研究样品制备、核酸富集、纯化和检测等多个操作步骤集成到一块"微型化"的芯片上,经自动化处理,得出实验结果,即"样品进,结果出"。将核酸等温扩增技术与微流控芯片相结合,不仅可以实现核酸快速扩增,还可以降低对实验器材的依赖。在床边即时诊断、病原体快速筛查中具有广阔的应用前景。综合国内外相关研究报道,综述了各种等温扩增技术原理,以及基于微流控芯片的核酸等温扩增技术应用,展望了集成化微流控芯片的发展趋势和应用前景。

关键词：微流控芯片核酸等温扩增床边即时诊断

结合重组酶介导的核酸等温扩增和荧光探针快速检测日本血吸虫基因片段

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2019年第1期37卷 23-27页

作者：赵松刘燕红李婷李伟张键锋郭利川应清界羊海涛杨坤国家卫生和计划生育委员会寄生虫病预防与控制技术重点实验室江苏省寄生虫与媒介控制技术重点实验室江苏省血吸虫病防治研究所无锡214064 江苏省奇天基因生物科技有限公司无锡214064

目的结合重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)和荧光探针方法建立日本血吸虫特异性基因片段的快速检测方法。方法以日本血吸虫G28 (Sj G28)基因片段作为靶序列,应用DNAMAN 7.0软件设计合成引物及荧光探针,... 详细信息

目的结合重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)和荧光探针方法建立日本血吸虫特异性基因片段的快速检测方法。方法以日本血吸虫G28 (Sj G28)基因片段作为靶序列,应用DNAMAN 7.0软件设计合成引物及荧光探针,建立荧光RAA反应体系。扩增不同拷贝数的Sj G28重组质粒,评价荧光RAA检测的敏感性;分别以日本血吸虫、曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫基因组为模板进行荧光RAA检测,以评价该方法的特异性。采用荧光RAA分别检测500、 200和50条日本血吸虫尾蚴感染的兔粪中虫卵DNA。分别在50只阴性钉螺中混入1、 2、 3、 4、 5、 10只阳性钉螺,并提取DNA进行荧光RAA检测。结果以不同拷贝数的Sj G28重组质粒为模板进行荧光RAA扩增,在5 min时即可观察到明显的荧光信号,随着拷贝数的不断降低,检测到荧光信号的时间也随之延长,不同拷贝数的扩增均在10 min内完成,最低可检出的质粒浓度为10拷贝/μl。以曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。不同数量尾蚴感染的兔粪中提取的DNA样品经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在15 min内完成。含不同数量阳性钉螺的50只阴性钉螺提取的日本血吸虫DNA经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在10 min内完成。结论本研究建立的可检测日本血吸虫核酸片段的荧光RAA方法,反应快捷,敏感性和特异性均较高。

关键词：日本血吸虫基因检测核酸等温扩增荧光探针重组酶

基于重组酶介导等温扩增技术的细粒棘球绦虫核酸检测方法的建立

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中国血吸虫病防治杂志 2020年第4期32卷 340-344页

作者：丁昕刘燕红倪碧娴王晓婷徐祥珍应清界戴洋曹俊国家卫生健康委员会寄生虫病预防和控制技术重点实验室、江苏省寄生虫与媒介控制技术重点实验室、江苏省血吸虫病防治研究所、江南大学公共卫生研究中心无锡214064 江苏省奇天生物科技有限公司

目的建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷... 详细信息

目的建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度细粒棘球绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果成功建立了细粒棘球绦虫荧光RAA检测法,在39℃条件下20 min内可以实现对细粒棘球绦虫基因组DNA特异性扩增,最低可以检测出10拷贝/μL含靶序列的重组质粒DN A和0.1 ng/μL细粒棘球绦虫基因组DN A样本,具备较高敏感性;对多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA均无阳性扩增,具备较高特异性;且该荧光RAA法可成功检出细粒棘球绦虫包囊中DNA。结论成功建立了一种快速、灵敏、特异的可用于细粒棘球绦虫核酸检测的荧光RAA法。

关键词：细粒棘球绦虫重组酶核酸等温扩增荧光探针诊断效能

Bst聚合酶介导核酸等温链置换扩增技术的初步研究与应用

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Bst聚合酶介导核酸等温链置换扩增技术的初步研究与应用

作者：李恒轩天津大学

学位级别：硕士

核酸作为遗传信息载体和蛋白质编码器,是组成生命体最基本的物质之一,许多疾病、肿瘤的发生往往伴随着生物体内核酸水平的变化,但核酸常以微量甚至痕量形式存在,因此开发灵敏度高、特异性强的核酸扩增技术对生物分析和医学研究具有重大... 详细信息

核酸作为遗传信息载体和蛋白质编码器,是组成生命体最基本的物质之一,许多疾病、肿瘤的发生往往伴随着生物体内核酸水平的变化,但核酸常以微量甚至痕量形式存在,因此开发灵敏度高、特异性强的核酸扩增技术对生物分析和医学研究具有重大意义。核酸等温链置换扩增技术凭借其链迁移原理相对简单、扩增高效、动力学上高度可控等优势在近年来受到广泛关注。而随着分子生物学的发展,利用基因工程设计的、具有链置换活性的Bst聚合酶为链置换扩增技术带来了新方向。因此,本文的主要研究思路在于介导Bst聚合酶参与核酸等温链置换扩增技术,改变传统链置换扩增的反应模型,转变信号输出类型,提高扩增效率。本文的具体研究内容如下:(1)开发了一种Bst聚合酶介导的杂交链式反应(pHCR),相较于杂交链式反应(HCR)的线性增长,pHCR的指数型扩增模式使得效率大幅提升。Bst聚合酶的介入改变了反应的信号类型,将成百乃至上千bp的ds DNA输出为固定长度,为信号应用方式带来了新的设计空间。优化了反应条件,使pHCR直接检测核酸的灵敏度达到pM级别。(2)开发了一种Bst聚合酶介导的多重自折叠链置换策略(pMTHSP),基于多重链置换扩增原理,改变信号输出类型的同时提高了扩增效率。证明了在自折叠链置换扩增反应中,相较于dSpacer修饰,PS修饰引发的扩增效率更高,同时pMTHSP相比PS-THSP可适用的温度条件更广泛。结合流式细胞技术对miRNA定量检测,检测限可达pM级别,并且实现了两种miRNA的同时检测。pMTHSP在实际血清样本中的检测适用性良好,检测结果与qRT-PCR无显著性差异。综上所示,本文以核酸等温链置换扩增技术为基础,结合Bst聚合酶高效的扩增性能与强大的链置换能力,发展了在Bst聚合酶介导下的等温链置换扩增技术,显著提升扩增效率,改善信号定性定量能力,为核酸的扩增和检测带来了新的研究思路。

关键词：核酸等温扩增链置换反应 Bst聚合酶核酸检测

重组酶介导的核酸等温扩增技术（RAA）快速检测日本血吸虫基因片段的研究

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重组酶介导的核酸等温扩增技术（RAA）快速检测日本血吸虫基因片...

作者：李婷江苏省血吸虫病防治研究所

学位级别：硕士

目前,日本血吸虫病仍然是一种危害严重的人兽共患寄生虫病,也是我国长江中下游地区的一个主要的公共卫生问题。诊断是血吸虫病防治工作的中心环节,化疗对象的确定及化疗效果评价,防治活动计划、实施和防治效果评价等血吸虫病防治工作的... 详细信息

目前,日本血吸虫病仍然是一种危害严重的人兽共患寄生虫病,也是我国长江中下游地区的一个主要的公共卫生问题。诊断是血吸虫病防治工作的中心环节,化疗对象的确定及化疗效果评价,防治活动计划、实施和防治效果评价等血吸虫病防治工作的各个环节都需要诊断提供必要的信息和依据。传统的血吸虫病诊断是病原学方法,被称为血吸虫病检测的“金标准”。然而目前已有的病原学检测方法,其敏感性与特异性均不够理想,且多数粪检法病人的依从性较低。免疫学诊断的敏感性和特异性虽较好,但更适用于对疫区化疗对象的大规模筛查和血清流行病学调查。常用的血吸虫抗体检测,由于抗体在体内的水平和转归具有个体差异性,检测结果不能区别现症感染和既往感染,疗效考核价值不理想。随着分子生物学技术的发展,已有多种核酸检测方法应用于血吸虫感染检测。如PCR(Polymerase chain reaction)技术灵敏度高,特异性强,但依赖仪器设备、高温变性反应时间较长,对操作人员的技术要求较高,难以在现场防治工作中推广应用。近年来核酸等温扩增技术逐步发展成熟,如LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)因其高特异性和灵敏度成为当前研究和应用相对广泛的等温扩增技术之一。但LAMP法的引物设计较复杂,数量多、难度大,需根据6个特定区域设计4对引物,且其扩增产物是一些大小不等的片段,易形成气溶胶而造成实验室的环境污染。因此,LAMP反应极易受到污染而产生假阳性结果,对操作人员及检测环境都有较高要求。重组酶介导的等温扩增反应(Recombinase Aided Amplification,RAA)是一种新型的等温核酸体外扩增技术,其引物设计简单,反应在37-42℃下进行50 min即可得到与传统PCR反应相当,可用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。RAA反应简单快速,不需要高温循环,对仪器的需求大大降低,在现场检测显示出突出的优越性。本研究针对血吸虫病诊断的敏感性、特异性及可操作性的需求,基于重组酶介导的等温扩增技术原理建立日本血吸虫特异性基因片段RAA快速检测方法,开展以下三个部分工作:一、重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增(RAA)基础反应体系的建立筛选日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,从反应温度、引物浓度、醋酸镁浓度3个方面优化RAA反应体系。应用此方法与PCR同时扩增不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒和倍比稀释的不同浓度的日本血吸虫基因组样品,评价该方法敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫、细粒棘球绦虫及华支睾吸虫不同虫种基因组DNA及健康人血基因组DNA,评价其特异性。建立的基础RAA法可特异性扩增日本血吸虫(中国大陆株)成虫及虫卵基因组DNA,反应条件为37℃,30 min,凝胶电泳1h完成检测。对RAA反应体系优化结果表明,基础RAA反应最佳扩增温度为37℃,最优引物浓度为0.4μmol/L,最优醋酸镁浓度为14mmol/L。以重组质粒为模板,50μL反应体系中RAA法最低可检测到1000个拷贝,敏感性与PCR法相当;以日本血吸虫成虫基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为1 ng的基因组DNA。RAA法可特异性扩增日本血吸虫成虫基因组,与其他相关寄生虫基因组DNA均无交叉反应。二、重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增荧光法(荧光RAA法)的建立结合荧光探针和重组酶介导的核酸等温扩增技术,建立日本血吸虫特异性基因片段的荧光RAA检测方法。应用荧光RAA法扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒和倍比稀释的不同浓度的日本血吸虫基因组样品,评价其敏感性;同样对荧光RAA法进行特异性评价,以曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫、细粒棘球绦虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA检测;分别应用此方法检测从日本血吸虫感染的实验兔粪便(42d)、实验兔血清(0-7d)及感染性钉螺中提取的基因组DNA。荧光RAA法反应条件为39℃,30min,核酸扩增过程与荧光检测同步进行,缩短了时间。以不同拷贝数的SjG28重组质粒为模板进行荧光RAA扩增,可在5min内观察到明显的荧光信号,在50μL反应体系中最低可检出10拷贝的重组质粒,敏感性比RAA法和PCR法提高了100倍;以日本血吸虫成虫基因组DNA为模板,RAA法最低可检测出浓度为1fg的基因组DNA。以曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫、细粒棘球绦虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增,只有日本血吸虫成虫得到阳性扩增。日本血吸虫成虫、虫卵、感染的实验兔粪便、血清、感染性钉螺提取的基因组DNA为模板进行的荧光RAA检测,均能得到特异性扩增。500条、200条、50条尾蚴感染42d的家兔粪中提取的DNA样品经荧光RAA检测,均能得到有效扩增,可在15 min

关键词：日本血吸虫重组酶核酸等温扩增荧光探针钉螺