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核酸信号放大型表面增强拉曼散射（SERS）生物传感平台的构建及其在癌症标志物测定中的应用

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核酸信号放大型表面增强拉曼散射（SERS）生物传感平台的构建及其...

作者：王佳薷西南大学

学位级别：硕士

表面增强拉曼散射(SERS)具有光稳定性、无破坏性、单分子水平的超灵敏性和丰富的光谱特性等优点,已成功应用于生物医学、临床诊断、环境监测和食品安全控制等研究领域。基于SERS的生物医学诊断对于早期生物医学监测及术后监控至关重要,... 详细信息

表面增强拉曼散射(SERS)具有光稳定性、无破坏性、单分子水平的超灵敏性和丰富的光谱特性等优点,已成功应用于生物医学、临床诊断、环境监测和食品安全控制等研究领域。基于SERS的生物医学诊断对于早期生物医学监测及术后监控至关重要,尽管各种SERS活性基底可用于生物分子传感,并在生物检测中具有巨大潜力,但是等离子体SERS效应会因为热点分布不均匀、信号分子位置及方向不同、金属纳米颗粒形状的纳米级变化导致增强效应发生非常大的变化,并且这些问题常常会干扰生物检测的灵敏度和准确性。因此,解决这些问题的潜在策略是开发基于等温核酸扩增技术的超灵敏SERS检测。针对上述存在的问题,本文设计了多重信号放大策略,结合多种核酸信号放大方法,利用纳米复合材料,贵金属核壳纳米材料的优异的光学性质,构建了具有高灵敏度,易操作的生物传感平台,具体研究内容包括以下两个方面:(1)引入无酶辅助的目标物循环扩增信号放大策略,能够将基于具有过氧化氢模拟酶活性的DNA酶介导的银溶解反应结合起来用于SERS传感平台的构建,实现癌胚抗原(CEA)的灵敏检测。首先,在抑制链的作用下,发卡结构不会引发下游的链置换扩增,只有在目标物CEA存在下,才可以精准触发无酶的目标物循环放大反应,导致大量可产生催化的血红素/G-四链体DNA酶(hemin/G-quadruplex DNAzyme)的生成,将过氧化氢(HO)降解为羟基自由基(·OH)。·OH强大的氧化性会腐蚀银纳米颗粒-碳纳米点(AgNPs-CDs)SERS基底,该SERS基底免去了修饰拉曼信号分子的复杂操作,巧妙地利用了CDs独特的拉曼峰作为检测信号,实现了CEA的灵敏检测。这个基于双重信号放大策略的SERS传感平台简单高效地实现了目标物信号比为1:N的放大效果,检测限为55 pg/mL,为构建具有多重信号放大策略的传感平台提供了新的思路。(2)将级联杂交链式反应(C-HCR)的信号放大策略引入到SERS传感平台中,同时结合酶诱导形成的核壳纳米材料Au@AgNRs作为SERS基底用于构建SERS生物传感平台。首先,将总前列腺抗原(tPSA)的适体链探针设计为一端具有识别抗原能力,另一端可以引发C-HCR的序列。在C-HCR中,两个HCR(一个带有两个发夹结构,另一个带有四个生物素修饰的发夹结构)耦合在一起,从而形成了长度超过200 nm并具有鞭炮形状的超支化DNA纳米结构,这一等温核酸扩增结构可供超过四亿个链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶(SA-ALP)结合。SA-ALP催化2-磷酸-1-抗坏血酸三钠盐(AAP)产生抗坏血酸(AA),AA会还原硝酸银(AgNO)生成银单质沉积在金纳米棒(AuNRs)上,形成具有出色信号放大能力的SERS底物Au@Ag核-壳纳米结构。鉴于这些优点,开发的方法实现了tPSA的超灵敏检测,检测限低至0.94 fg/mL。并且还成功实现了临床患者血清样品的检测,与临床测试结果一致,表明在临床应用中可能具有巨大的潜力。综上所述,在本研究中,我们利用等温核酸扩增技术作为高效的辅助信号放大策略,借助具有优异性能的纳米材料,构建了简单、灵敏以及高效的SERS生物传感平台,实现了癌症标志物的超灵敏检测,为癌症病人的术前筛查,术中监测,术后预控建立了基础。

关键词：表面增强拉曼光谱核酸信号放大癌症标志物

基于功能核酸识别与信号放大的抗生素光学生物传感新策略

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基于功能核酸识别与信号放大的抗生素光学生物传感新策略

作者：宇文新月湖北师范大学

学位级别：硕士

近年来,抗生素作为一种重要的抗菌药物被广泛应用于农业、畜牧业和人类医疗卫生等多个领域。然而,抗生素药物的滥用及其在食品中的残留富集对公众健康构成了巨大威胁。目前,传统的抗生素的检测方法由于受到样品前处理繁琐、操作要求高... 详细信息

近年来,抗生素作为一种重要的抗菌药物被广泛应用于农业、畜牧业和人类医疗卫生等多个领域。然而,抗生素药物的滥用及其在食品中的残留富集对公众健康构成了巨大威胁。目前,传统的抗生素的检测方法由于受到样品前处理繁琐、操作要求高、设备昂贵等因素限制,仅适用于实验室条件下的分析检测。与之相比,基于功能核酸所构建的光学生物传感器,由于能特异性的将靶标物识别信息转换成便于分析和检测的光学信号,近年来成为了分析化学学科领域的研究热点。然而,实际样品中的抗生素含量通常较低,如何建立灵敏度高、可靠性好且能够实现靶标物现场检测的分析方法显得尤为重要。幸运的是,功能核酸的可编程性使其能够在游离态、靶标结合态以及DNA双链三种状态中自由切换,这种特性可以与多种等温核酸信号放大技术相结合,从而显著提高检测方法的灵敏度。基于此,本论文将基于功能核酸识别的光学生物传感与核酸酶、DNA纳米结构自组装及纳米材料等多种信号放大策略相结合,设计并构建了两种用于实际样品中抗生素的高选择性、高灵敏度的光学生物传感方法:1.基于双重核酸外切酶催化循环放大的比率型抗生素荧光传感本工作基于两个目标物敏感的荧光探针产生相反的信号响应,成功发展了一种比率型博来霉素荧光生物传感新方法。其中,一个信号产生于目标物识别触发的核酸外切酶III(Exo III)催化释放的G-四链体序列。这将会导致G-四链体与硫黄素T(Th T)复合,实现该方法的“Signal-on”荧光输出。另外一个信号来自于目标物识别和Exo III催化反应诱导的ROX荧光基团标记链与其猝灭基团标记链之间的DNA杂交,引起ROX荧光猝灭,从而实现该方法的“Signal-off”荧光输出。同时,Exo III催化双循环反应极大程度上放大了基于Th T和ROX的荧光响应。通过测定两种相反信号响应并转化为比值,从而成功构建起该比率型荧光生物传感策略。该方法可在50 p M至5μM的宽线性范围内均相测定BLM,检出限低至15.8 p M。由于该方法具有优良的分析性能好、操作简便、检测成本低等性能优势,因而具有广阔的应用前景。2.基于双重级联核酸循环放大组装超支化DNA纳米结构的抗生素比色传感本工作基于目标物识别触发的双重级联核酸循环放大组装超支化DNA纳米结构,开发了一种卡那霉素比色可视化生物传感新方法。其中,目标物与适配体之间的特异性识别反应可触发基于链置换反应所形成的第一重循环,进而触发基于两种核酸酶辅助催化反应所形成的第二重循环,同时释放出一个输出DNA链,以用于触发DNA纳米结构的组装。由于该DNA纳米结构可高含量捕获碱性磷酸酶(ALP),这样即可利用ALP诱导的金纳米锥(Au NBPs)局部表面等离子体共振变化,建立一种超灵敏比色信号转导策略。通过测量Au NBPs的特征吸收波长的偏移量,从而构建其表面等离子体共振吸收峰变化值与卡那霉素浓度之间的定量关系。在最佳条件下,该方法具有从10 fg m L到1 ng m L的宽线性范围,检出限低至1.4 fg m L。同时,Au NBPs明显的多色变化还可用于Kana残留的可视化半定量分析,这些性能优势决定了该方法在未来应用中的较好发展潜力。

关键词：生物传感器功能核酸核酸信号放大 DNA纳米结构抗生素检测

基于新型光电材料结合核酸信号放大构建光电化学生物传感器的研究

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基于新型光电材料结合核酸信号放大构建光电化学生物传感器的研究

作者：牛现康曲阜师范大学

学位级别：硕士

疾病的发生发展与某些生物标志物的异常存在紧密联系,因此,疾病标志物的灵敏检测对疾病的早期发现和治疗具有重要意义。光电化学(Photoelectrochemical,PEC)分析是一种基于电分析和光分析方法而发展建立的分析检测方法,具有响应速度快... 详细信息

疾病的发生发展与某些生物标志物的异常存在紧密联系,因此,疾病标志物的灵敏检测对疾病的早期发现和治疗具有重要意义。光电化学(Photoelectrochemical,PEC)分析是一种基于电分析和光分析方法而发展建立的分析检测方法,具有响应速度快、背景信号低、操作简单等优势,在生物分析领域引起了广泛关注并成为研究热门之一。光电材料和生物识别单元是PEC生物传感器的重要组成部分,其中,光电材料的光电转化效率直接影响到生物传感器的分析性能,生物识别体系中信号放大关系到传感器的检测灵敏度。因此,开发分析性能优异的PEC生物传感器,制备、选择优异的光电材料和设计高效的信号放大策略是至关重要的。鉴于此,本文以性质优异且稳定的光电材料为基础,核酸探针为识别元件,结合核酸信号放大策略,构建了具有优异分析性能的PEC生物传感器,实现了对不同癌症标志物micro RNAs的灵敏检测。主要研究内容如下:(1)具有较大禁带宽度的光电材料对光的利用率较低,且单一光电材料光电转化效率较低,严重限制了其在PEC生物传感器中的应用。近年来,缺陷工程可在宽带隙中引入新的缺陷带,提高光的利用率。构建异质结可有效促进光生-电子对的分离,提高光电转化效率。基于此,本工作通过缺陷工程策略在宽带隙的Zn S中引入新的离子缺陷带,间接性地降低了带隙,介导形成了Z型异质结Cd S/Zn S-V。该异质结构不仅可以增强了可见光区的光捕获和利用,也能有效抑制光生电子-空穴对的复合,显著提高了光电转化效率,得到增强的PEC响应信号。并以Cd S/Zn S-V为光电材料,Si O为信号猝灭剂,结合酶辅助信号放大策略,构建了一种新型的PEC生物传感器,成功应用于检测异常表达与肝癌相关的micro RNA-122。该传感器分析性能优异,灵敏度高,线性范围为10 amol/L～100 pmol/L,检测限低至3.3 amol/L。该传感器在高效核酸检测和体外诊断方面显示出巨大的应用潜力。(2)近年来,信号“增强”或“猝灭”型生物传感器面临着假阳性或假阴性信号的困扰,严重限制了其检测的灵敏度。极性反转模式型PEC生物传感器可有效消除测试过程假阳性或假阴性信号的干扰,有利于提高传感器的分析性能。基于此,在本研究中以5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉(Tph-2H)为光活性材料,Cd S量子点为PEC响应信号方向的诱导剂,结合链置换反应和酶辅助信号放大策略,构建了极性反转模式型PEC生物传感器,成功应用于检测异常表达与乳腺癌相关的micro RNA-141。通过有机光敏材料与无机半导体材料的结合,拓宽了光的吸收范围,提高了光电转换效率。该传感器具有出色的抗干扰能力及可完全消除负面背景信号影响等优势,分析性能优异,灵敏度高,线性范围为1 fmol/L～1 nmol/L,检测限低至0.33 fmol/L。为micro RNAs的检测开辟了一条新的路径,在医学早期分析和疾病诊断中检测其它生物标志物方面具有巨大的潜力。

关键词： PEC生物传感器光电材料核酸信号放大极性反转 MicroRNA

基于核酸信号放大的抗生素生物传感新策略研究

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基于核酸信号放大的抗生素生物传感新策略研究

作者：王晓君湖北师范大学

学位级别：硕士

近年来,抗生素滥用造成的残留污染问题以及抗生素耐药性的出现已经给人类身体健康和公众安全造成了严重危害。因此,开发快速、简便、灵敏的抗生素残留检测方法具有非常重要的意义。目前,常用的检测方法有色谱法和免疫学方法等,但是这些... 详细信息

近年来,抗生素滥用造成的残留污染问题以及抗生素耐药性的出现已经给人类身体健康和公众安全造成了严重危害。因此,开发快速、简便、灵敏的抗生素残留检测方法具有非常重要的意义。目前,常用的检测方法有色谱法和免疫学方法等,但是这些方法存在灵敏度低、耗时较长、需要熟练的人员和昂贵的设备等缺点。作为一种新兴的分析工具,生物传感器可方便用于各种目标分析物的简单、低成本、高选择和高灵敏分析。其中,基于核酸适配体构建的生物传感器因其独特的性能优势而受到人们的广泛关注。除了具有良好的特异性和稳定性之外,核酸适配体与其目标物之间的生物识别反应还可以引起其自身或相关核酸序列的构象变化,从而可以在此基础上结合各种核酸信号放大技术来构建各种具有较高分析灵敏度的生物传感新策略。为此,本论文将基于核酸适配体的高特异性生物识别反应与核酸内切酶、DNA酶等核酸信号放大技术相结合,设计和构建了两种可用于卡那霉素(Kana)抗生素检测的高灵敏光、电生物传感新方法:1.双重DNA酶催化G-四链体组装诱导纳米金聚集用于抗生素均相生物传感基于目标物生物识别反应诱导G-四链体组装和金纳米粒子(Au NPs)聚集,本工作发展了一种可用于Kana检测的新型比色生物传感方法。反应体系中的G-四链体结构由两个设计在镁离子DNA酶(MNAzyme)的两个发夹底物中的1/2劈开碱基序列组装而成。除了与适配体(Aptamer)链杂交外,MNAzyme序列也被分成两个1/2劈开碱基序列并设计在它的两个发夹底物中。在Kana与其核酸适配体生物识别反应后,MNAzyme链可以被定量释放,从而催化其分别修饰在Au NPs上的两个底物的裂解。这将导致G-四链体的两个1/2劈开碱基序列暴露在两个核酸修饰的Au NPs上,并同时释放MNAzyme的两个1/2劈开碱基序列。然后,K辅助的G-四链体自折叠可以引起两个Au NPs的交联,从而实现基于Au NPs聚集的比色信号输出。同时,第二个MNAzyme的自组装还可以进一步显著放大信号响应。在最佳条件下,该方法具有5个数量级宽的线性范围,检出限低至76 fg m L。实际样品加标回收实验的回收率在98.4%到105.4%之间,与ELISA方法的相对误差均小于4.1%。此外,这一方法还具有选择性高、重复性好、稳定性好和操作简单等优点,因而具有良好的应用前景。2.基于核酸内切酶驱动DNA步行作用的双模式抗生素生物传感本工作基于磁珠(MB)表面修饰设计了一种DNA步行机,并利用目标物触发和核酸内切酶驱动的步行反应发展了一种可用于Kana检测的新型比色和电化学双模式生物传感方法。实验首先基于DNA步行反应释放的端粒引物链经端粒酶扩增生成G-四链体/hemin DNA酶来构建其比色信号转导策略。由于DNA步行和端粒酶扩增的双信号扩增技术,使得该方法可在0.1 pg m L至1 ng m L的范围内实现对Kana的灵敏检测,检出限低至22 fg m L。同时,还将目标物触发DNA步行反应产生的MB复合物设计为多足DNA步行机,从而在此基础上构建了该方法的电化学信号转导策略。利用另一个核酸内切酶来驱动此步行机在制备的DNA发夹修饰电极上进行步行,即可引起其二茂铁标记物的定量释放及电极的电化学信号降低。基于双重核酸内切酶驱动DNA步行的信号放大,该方法可在0.01 pg m L至1 ng m L线性范围内实现对Kana的高灵敏检测,检出限低至8.4 fg m L。由于这两种策略都具有操作简单,仪器成本低廉等优点,因此使得此生物传感方法在抗生素残留的现场半定量筛选和准确检测方面具有很好的应用潜力。

关键词：生物传感器核酸适配体抗生素检测核酸信号放大 DNA步行机

基于介孔二氧化硅纳米通道和核酸信号放大的电化学microRNA检测研究

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基于介孔二氧化硅纳米通道和核酸信号放大的电化学microRNA检测研...

作者：彭佳鑫湖南大学

学位级别：硕士

MicroRNAs（miRNAs）是一类长度一般为18-25个核苷酸的非编码小RNA,其在细胞活动中发挥了重要的调节作用。研究表明,miRNAs与多种人类疾病的发生和发展有关,其表达水平可作为某些疾病诊断、治疗及预后的重要依据。因此,发展特异性好、... 详细信息

MicroRNAs（miRNAs）是一类长度一般为18-25个核苷酸的非编码小RNA,其在细胞活动中发挥了重要的调节作用。研究表明,miRNAs与多种人类疾病的发生和发展有关,其表达水平可作为某些疾病诊断、治疗及预后的重要依据。因此,发展特异性好、灵敏度高的miRNA检测方法具有十分重要的意义。固体纳米通道是一类具有与生物纳米通道相类似孔道结构的纳米材料,目前已广泛应用于催化、载药、分离及分析传感等领域。介孔二氧化硅纳米通道（Mesoporous Silica Nanochannels,MSNs）是研究比较成熟的一种固体纳米通道材料,其具有高孔隙率和高比表面积等特点。用MSNs作为电极修饰的材料时,其表面含有丰富的硅羟基易于修饰各种官能团,孔道中负载的信号分子可以在电极表面进行高效率的电子传输,这为电化学分析传感提供了可能。本论文以miRNA的高灵敏检测为目的,将MSNs与核酸信号放大技术相结合分别构建了两种电化学生物传感器,主要研究内容如下:一、基于介孔二氧化硅纳米通道及末端介导的链置换信号放大技术用于miRNA-21的电化学检测利用高电子传输效率的介孔二氧化硅纳米通道（MSNs）和末端介导链置换反应,构建了一种高灵敏的电化学传感体系用于miRNA-21检测。首先在氧化铟锡（ITO）电极表面原位生长一层MSNs,然后将锚定链（anchor DNA）、互补链（cDNA）与触发链（trigger DNA）三条链杂交组成的门控分子通过酰胺反应连接在MSNs纳米孔道表面。当miRNA-21不存在时,带负电的电活性分子[Fe（CN）6]3-/4-与带负电的DNA门控分子会发生静电排斥现象,无法接近电极导电层,此时电信号较低。当miRNA-21存在时,miRNA-21与cDNA杂交互补,暴露出来的末端可以使Fuel链与cDNA结合形成双链DNA远离MSNs表面,同时释放miRNA-21,此时门控分子被打开,电活性分子[Fe（CN）6]3-/4-可以进入MSNs孔道内部,产生电化学信号。此外,释放的miRNA-21又可进行循环,导致更多的门控分子被打开,从而增强电化学信号,最终实现了miRNA-21的高灵敏检测。该传感器可以定量检测miRNA-21,检测限达到13 fM,线性检测区间为0.02到0.2 pM。同时在复杂样品检测中也有较好的应用价值。二、基于介孔二氧化硅纳米通道及脱氧核酶介导的信号放大技术用于miRNA-155的电化学检测利用介孔二氧化硅纳米通道（MSNs）结合核酶（DNAzyme）介导的信号放大反应,构建了一种高灵敏的电化学传感体系用于miRNA-155检测。首先设计可以被DNAzyme特异性识别并切割的发夹型底物链DNA（Substrate DNA）作为门控分子。Substrate DNA通过其末端标记的羧基与MSNs表面的氨基基团发生酰胺化学反应而修饰在MSNs表面。同时,通过一段与DNAzyme互补杂交的Locker链将DNAzyme的活性位点进行封闭,此时DNAzyme无法被释放切割Substrate DNA,导致电活性分子[Fe（CN）6]3-/4-无法接近电极表面,此时电化学信号较低。在有目标物miRNA-155存在时,可以与Locker链互补杂交,并释放DNAzyme。释放的DNAzyme在Mn2+作用下,可以特异性识别切割Substrate DNA,电信号分子[Fe（CN）6]3-/4-可以进入MSNs内部,产生电化学信号。同时DNAzyme可以循环切割Substrate DNA,打开更多的DNA门控分子,达到信号放大的作用。该传感器可以缩短检测时间,定量检测靶标miRNA-155,检测限达到 40 pM,线性检测区间为 0.2 到 10 nM。该检测方法为开展高灵敏的miRNA检测提供了新思路,并且在临床诊断方面具有良好的应用潜力。

关键词：介孔二氧化硅纳米通道核酸信号放大电化学生物传感器 miRNA检测

核酸信号放大技术在生物检测中的应用研究进展

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质量安全与检验检测 2024年第2期34卷 58-63页

作者：占忠旭朱应飞蔡玉霞熊丽霞翟平平范宏伟欧阳思雨江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院江西南昌330052

近年来,核酸扩增技术在食品安全控制、环境监测和医药领域都发挥着越来越重要的作用。本文介绍了部分核酸扩增技术,阐述了这些核酸扩增技术的原理,综述了这些核酸扩增技术在生物检测中的应用,并对生物样品快速检测的应用前景进行展望,... 详细信息

近年来,核酸扩增技术在食品安全控制、环境监测和医药领域都发挥着越来越重要的作用。本文介绍了部分核酸扩增技术,阐述了这些核酸扩增技术的原理,综述了这些核酸扩增技术在生物检测中的应用,并对生物样品快速检测的应用前景进行展望,以期为相关研究提供参考。

关键词：核酸信号放大生物检测

基于信号放大技术的试纸条用于核酸标志物的检测

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基于信号放大技术的试纸条用于核酸标志物的检测

作者：李沙沙郑州大学

学位级别：硕士

核酸分子在蛋白质的合成中起着储存和传递遗传信息的作用,被称为“生命的密码”。核酸分子的异常表达往往与身体的疾病紧密相关,甚至在表现出明显的病征前,体内疾病相关核酸分子的含量已经偏离了正常水平。核酸标志物的高灵敏检测不仅... 详细信息

核酸分子在蛋白质的合成中起着储存和传递遗传信息的作用,被称为“生命的密码”。核酸分子的异常表达往往与身体的疾病紧密相关,甚至在表现出明显的病征前,体内疾病相关核酸分子的含量已经偏离了正常水平。核酸标志物的高灵敏检测不仅可以对疾病进行早期诊断和治疗,在某些情况下,还能对疾病进行针对性预防,避免疾病的大范围的扩散,提高公共卫生的安全性。目前,常规的核酸检测技术仍存在对检测仪器要求苛刻,操作复杂和成本高等缺点,故急需开发更加便携和低成本的核酸检测平台。横向流动试纸条(LFTS)是一种利用便携式的分析设备和配套的检测试剂,在现场快速得到结果的即时检测(POCT)平台,具有分析快速、操作简单和成本低等优点,在临床疾病的即时诊断中有很大的应用潜力。但是,由于在疾病早期阶段,相关核酸分子的表达量往往较低,因此开发高灵敏度的核酸横向流动试纸条(NALFTS)是临床疾病即时检测中迫切需要解决的关键问题。提高NALFTS灵敏度的主要方式有信号标签放大技术,核酸扩增技术和核酸信号放大技术。荧光微球(FNs)是一种负载或包裹大量荧光染料和量子点(QDs)等荧光材料的荧光纳米粒子,有较高的荧光强度和稳定性。作为信号标签,与常用的胶体金纳米颗粒(AuNPs)或QDs相比,可有效提高NALFTS的灵敏度。除此之外,与依赖蛋白酶的核酸扩增技术相比,无酶核酸信号放大技术不依赖于对环境敏感且价格昂贵的蛋白酶,而且操作更加简单,可以极大地降低成本,提高检测的准确性与重现性。基于此,本文从无酶核酸信号放大技术和信号标签放大两方面入手构建NALFTS平台,实现了甲型H1N1流感病毒核酸标志物(H1N1-RNA)和肿瘤标志物miRNA-21的高灵敏检测。主要研究内容如下:1.基于熵驱动放大的荧光试纸条用于核酸分子的高灵敏检测。在本工作中,首次设计了一种基于无酶等温的熵驱动放大策略的荧光试纸条用于灵敏地检测疾病核酸标志物。首先,由报告探针FNs-DNA、生物素修饰的连接链和副产物链组成三链杂交的复合物底物链。当目标核酸存在时,启动熵驱动反应,释放出大量FNs-DNA。然后报告探针FNs-DNA在试纸条上通过毛细作用沿NC膜迁移并与链霉亲和素固定的捕获探针杂交,使FNs在检测线上积累,产生明显的荧光条带,以此实现目标核酸的检测,对目标DNA和H1N1-RNA的检测限分别为1.43 pM和2.02pM。熵驱动放大利用系统熵的增加来驱动反应的进行,碱基对保持不变,可以大大降低其它物质的干扰。此外,双链探针的使用,不仅可以灵活地设计探针,发展通用的核酸分子检测平台,还提高了探针的稳定性。该方法在早期疾病核酸的即时检测方面展现出巨大的应用潜力。2.基于无酶级联放大的荧光试纸条用于miRNA的高灵敏检测。在本工作中,基于无酶级联放大技术,构建了一种荧光试纸条用于肿瘤标志物miRNA-21的高灵敏检测。无酶的级联放大反应由HCR和DNAzyme两个放大反应构成,其中DNAzyme最初被封闭在H2中,当存在miRNA-21时,触发级联放大反应,释放出大量的DNAzyme,将底物链切断,切断的底物链不能与报告探针FNs-DNA杂交并被捕获探针捕获到检测线上,检测线上没有荧光信号。然而当靶标不存在时,底物链与报告探针FNs-DNA和捕获探针杂交形成三明治夹心结构,检测线上呈现明亮的荧光信号。通过测定检测线上的荧光信号强度,以实现目标分子的检测,检测限为0.79pM。本工作在单步核酸信号放大的基础上,将多步级联放大技术与NALFTS结合,进一步提高了检测的灵敏度和准确度,在疾病核酸标志物的即时诊断领域显示出很大的潜力。3.基于信号标签放大的双模试纸条用于miRNA的快速和高灵敏检测。在本工作中,设计了基于信号标签放大的比色荧光双模NALFTS用于肿瘤标志物miRNA-21的超灵敏检测。报告探针FNs-DNA和报告探针AuNPs-DNA通过report DNA 1和report DNA 2杂交形成网状结构,作为NALFTS的双模放大报告探针。在试纸条的NC膜上,用链霉亲和素固定了生物素化的捕获探针。当miRNA-21存在时,双模放大报告探针与其杂交并被捕获到检测线上,检测线富集了大量的AuNPs和FNs,同时产生明显的红色条带和荧光条带,以此实现目标分子的双模检测,检测限为lpM。该方法将FNs和AuNPs两种信号标签结合起来,不仅实现了信号的放大,而且实现了双模检测,进一步提升试纸条的灵敏度和应用能力。

关键词：核酸检测即时检测核酸横向流动试纸条核酸信号放大信号标签放大

基于核酸工具酶辅助信号放大技术检测肿瘤标志物的荧光传感新方法研究

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基于核酸工具酶辅助信号放大技术检测肿瘤标志物的荧光传感新方法...

作者：李小婷广西师范大学

学位级别：硕士

癌症是一类严重危害人类健康的疾病。至今为止,癌症的早期诊断与治疗依然是全球最关注的热点问题。大量研究表明,癌症病人的细胞、组织和器官中某些特定的核酸或蛋白质等物质与健康人相比具有很大的表达差异,一般会发生上调或下调,因此... 详细信息

癌症是一类严重危害人类健康的疾病。至今为止,癌症的早期诊断与治疗依然是全球最关注的热点问题。大量研究表明,癌症病人的细胞、组织和器官中某些特定的核酸或蛋白质等物质与健康人相比具有很大的表达差异,一般会发生上调或下调,因此通常可以被当作肿瘤标志物应用于临床诊断。肿瘤标志物的传统检测方法步骤繁琐,仪器成本较高,灵敏度较低。发展新型高灵敏度、高选择性方法用于核酸、蛋白质等肿瘤标志物的检测对于癌症等重大疾病的早期诊断和相关生物医学研究具有重要意义,也是目前生命分析领域的研究热点。近年来,为了实现肿瘤标志物的高灵敏检测,各种信号放大技术被引入到新型生物传感分析方法构建研究中,以提高分析的灵敏度。本论文利用核酸工具酶辅助的信号放大技术,发展了三种高选择性、高灵敏度的荧光生物传感分析新方法分别用于微小RNA(miRNA)和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)等具有重要癌症指示价值的生物标志分子的检测。具体研究内容分别如下:1.miRNA与人类各种肿瘤等重大疾病的发生发展密切相关。在第二章研究中,以miRNA-141为模型分析靶标,发展了一种基于聚苯乙烯纳米球和T7核酸外切酶辅助双循环信号放大的荧光偏振方法用于高灵敏检测miRNA。当没有靶标miRNA存在时,发夹结构的识别探针不能与5’末端修饰有FAM荧光团且3’末端修饰有生物素的单链信号报告探针杂交。该信号报告探针可通过生物素-链霉亲和素作用与链霉亲和素修饰的聚苯乙烯纳米球连接,从而极大增加了FAM荧光团的质量/体积,荧光偏振信号显著增强。而当加入靶标miRNA至检测体系时,miRNA与发夹探针杂交形成双链结构,触发T7核酸外切酶识别并降解发夹探针,释放出目标miRNA,同时产生未被降解的发夹探针片段。释放的miRNA可以参加下一轮的杂交-酶切-释放循环,产生大量的发夹探针片段;而新生成的发夹探针片段可与信号报告探针杂交,启动T7核酸外切酶对信号报告探针的5’端进行降解,释放出发夹探针片段参与下一轮杂交-酶切-释放过程并产生大量的游离FAM荧光团。游离的FAM不能与链霉亲和素修饰的聚苯乙烯纳米球连接,此时体系的荧光偏振值较低。因此,通过荧光偏振值的变化便可以实现对靶标miRNA-141的测定。通过T7核酸外切酶辅助信号放大及聚苯乙烯纳米球的荧光偏振增强效应,该方法显示出了较高的灵敏度高,其检测限为0.001 nM。此外,还利用该方法开展了总miRNA提取物的测定,并比较了人前列腺癌细胞(22Rv1)和宫颈癌细胞(Hela)中miRNA-141的表达差异。因此,本章所提出的方法有望用于miRNA相关的肿瘤疾病检测及生物医学研究。2.在第三章中,以miRNA-155为模型分析物,基于双链特异性核酸酶辅助靶标循环以及催化发夹自组装聚集增强荧光偏振信号策略,构建了另一种荧光偏振分析方法用于miRNA的高灵敏检测。该研究设计了三个发夹探针HP2、HP3和HP4作为核酸纳米结构组装元件,其中HP2末端标记有FAM荧光团,HP3和HP4末端标记有生物素分子。当靶标miRNA存在时,靶标可与发夹探针HP1形成HP1/miRNA异源双链体,启动双链特异性核酸酶特异性降解HP1/miRNA中的HP1。从而释放靶标miRNA进行下一轮杂交-降解循环;同时产生未被降解的HP1片段作为引物链触发HP2、HP3和HP4自组装形成Y型核酸结构,并在链霉亲和素作用下形成质量/体积较大的核酸/蛋白纳米复合结构,使得荧光偏振信号显著增加。而当靶标miRNA不存在时,HP2、HP3和HP4无法相互打开组装,此时荧光偏振信号较小。根据荧光偏振信号变化差异实现了对miRNA的灵敏检测。此外,该方法也适用于对人宫颈癌细胞(Hela)提取的总miRNA样品的测定。因此,本章建立的荧光偏振miRNA测定方法有望用于miRNA相关的临床诊断和研究中。3.脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)是DNA碱基切除修复过程中一种重要的核酸内切酶,和肿瘤的发生发展及抗肿瘤药物敏感性关系密切。在第四章研究中,建立了一种基于末端脱氧核苷酸转移酶辅助扩增策略的高灵敏APE1活性荧光测定方法。本研究设计了一个在茎部修饰有四氢呋喃结构(作为脱碱基位点)的发夹探针作为APE1底物。当无APE1存在时,完整的发夹探针由于3’末端修饰了倒位碱基从而不能被末端脱氧核苷酸转移酶催化聚合延伸,此时的荧光信号比较微弱。而当APE1存在时,发夹探针中的脱碱基位点将被切割,从而产生新鲜3’羟基和5’磷酸末端,并且由于切割造成茎部熔链温度降低释放出具有3’羟基末端的短链片段。以该短链片段为引物,在dATP/dGTP存在下,末端脱氧核苷酸转移酶催化聚合延伸产生大量的G-四链体序列。在K的辅助下,硫磺素T嵌入G-四链体结构使得荧光信号增强。根据荧光强度变化实现对APE1活性的测定。该方法具有简单、快速、灵敏度高等优势,还能应用于药物对APE1活性的抑制研究,因此有望用于AP

关键词：核酸酶荧光传感核酸信号放大肿瘤标志物

基于外切酶和纳米材料信号放大技术的核酸修饰酶活性检测新方法研究

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基于外切酶和纳米材料信号放大技术的核酸修饰酶活性检测新方法研...

作者：马业菲广西师范大学

学位级别：硕士

生物传感技术由于具有分析时间短、成本较低、选择性好、灵敏度高等优点,极大的推动了分析化学在生命科学领域的应用。荧光生物传感技术因其无需分离、操作简单、可进行原位测定、分析成本低等优点而备受关,目前,已广泛用于核酸、蛋白... 详细信息

生物传感技术由于具有分析时间短、成本较低、选择性好、灵敏度高等优点,极大的推动了分析化学在生命科学领域的应用。荧光生物传感技术因其无需分离、操作简单、可进行原位测定、分析成本低等优点而备受关,目前,已广泛用于核酸、蛋白质、生物活性小分子、病毒等的分析检测。纳米材料具有独特的光学和电化学性质,为构建生物传感方法提供了新的思路。近年来,核酸介导的信号放大方法为高灵敏生物检测提供了重要的技术支持,在各类生物分子的检测中得到了广泛应用。基因的修饰过程与癌症的发生发展有着密切关系,而基因修饰受到各种核酸修饰酶的协同调控。因此,建立核酸修饰酶活性检测的新方法新技术,在癌症等重大疾病的早期诊断与治疗,以及癌症发病机理研究中具有重要意义。本论文将纳米材料和核酸信号放大技术应用于荧光生物传感构建,发展了三种荧光生物检测体系,分别用于Dam甲基转移酶、碱基切除修复酶等酶活性测定。具体研究内容如下：1.发展了一种基于氧化石墨烯和T7核酸外切酶辅助循环信号放大的荧光方法用于DNA甲基转移酶(MTase)的活性检测和抑制剂筛选。研究中使用Dam甲基转移酶作为模型分析物。在Dam甲基转移酶存在时,发夹结构DNA底物探针被甲基化,然后被DpnI核酸限制性内切酶识别并进行切割,释放出单链DNA片段。随后释放的单链DNA与FAM荧光团标记的信号探针(DP探针)杂交。在形成的杂交体中,DP探针的5’端为钝末端,而被释放的单链DNA5’端多出4个碱基。此时,T7核酸外切酶能够对杂交体中DP探针进行降解并释放出单链DNA。释放的单链DNA引发下一轮的杂交-降解循环。最终大量的FAM荧光团从DP探针5’端释放。由于较低的亲和力,释放的FAM不能被吸附到氧化石墨烯表面,荧光信号被保留。相反,在没有Dam甲基转移酶存在时,DP探针可被氧化石墨烯吸附,导致荧光猝灭。将T7核酸外切酶高效的降解能力与氧化石墨烯超强的荧光猝灭效率相结合,从而获得较大的信号背景比,提高了Dam甲基转移酶活性测定的灵敏度。并且该方法不需要设计特定的酶识别位点,也不需要进行荧光团/淬灭团的双标记,使得实验设计简单,成本低廉。此外,该方法也适用于Dam甲基转移酶抑制剂的测定。2.构建了一种基于二硫化钨纳米片及核酸外切酶Ⅲ共辅助信号增强策略的DNA糖基化酶荧光偏振检测方法。在本工作中,我们以尿吡啶DNA糖基化酶(UDG)和8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)为研究模型。底物探针HP颈部含受损的碱基,在DNA糖基化酶存在情况下会切除受损的碱基,此时HP熔链温度降低,并且打开。打开后的HP会与FAM标记的单链DNA(DP)杂交,在杂交体中,DP的3’端是凹末端,Exo Ⅲ会对杂交体中DP进行消化,通过DP不断的杂交与释放过程,大量的FAM被释放,释放的FAM不会吸附到WS2纳米片表面,荧光偏振信号值很小。没有DNA糖基化酶活时,DP与HP不会杂交,因此ExoⅢ不会降解DP。单链DP能够吸附到WS2纳米片表面,质量变大,偏振增强。结合WS2纳米片和ExoⅢ共同辅助信号放大作用,可实现对DNA糖基化酶的高灵敏测定。此外,该方法也实现了对细胞粗提取物中UDG活性测定。并实现对UDG活性的抑制试验。最后,该方法设计简单,易于操作,选择性好,有望用于DNA糖基化酶相关机制研究和疾病诊断中。3.利用SG I作为荧光信号分子,基于核酸外切酶I (Exonuclease I, Exo I)的信号放大构建了一种简单、经济、高灵敏的荧光方法用于UDG活性检测。本工作中,以茎部区域含有四个尿嘧啶碱基的发夹探针(HP)作为UDG的底物。在没有UDG存在时,SG I染料可以与HP结合,荧光大大增强。UDG作用后,尿嘧啶碱基将被从核酸骨架上移除,形成脱碱基位点,从而降低发夹底物探针的解链温度,使得发夹底物探针会在我们实验设定的温度下分开,荧光信号降低。当使用Exo I切割ssDNA,会进一步降低荧光强度。从而实现对UDG的高灵敏检测,其检测下限为0.0070 U/mL。此外,该方法在复杂的生物样品具有检测的可能性,并且可用于研究5-氟尿嘧啶对UDG活性的抑制作用。

关键词：荧光传感外切酶纳米材料核酸信号放大 DNA甲基转移酶碱基切除修复酶