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H5N1亚型禽流感病毒核蛋白np的原核表达及抗体制备

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中国人兽共患病学报 2008年第3期24卷 202-204,209页

作者：罗孟成陶攀肖庚富潘兹书武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室武汉430072

目的制备H5N1亚型禽流感病毒np重组蛋白和抗体,为研制含np组分的人禽流感亚单位疫苗和建立评价方法提供检测抗原和抗体。方法以H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)np基因cDNA克隆质粒pMD-np为模板,PCR扩增获得np基因抗... 详细信息

目的制备H5N1亚型禽流感病毒np重组蛋白和抗体,为研制含np组分的人禽流感亚单位疫苗和建立评价方法提供检测抗原和抗体。方法以H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)np基因cDNA克隆质粒pMD-np为模板,PCR扩增获得np基因抗原区片段,克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-Δnp,转化大肠杆菌BL21-Condonplus(DE3)-RIL,IPTG诱导重组蛋白表达。采用Ni亲和层析方法纯化np重组蛋白,免疫家兔,收集免疫血清,ELISA测定抗体效价;间接免疫荧光检测所制备抗体与真核细胞表达np蛋白的反应性。结果与结论成功的制备了高效价兔抗np抗体,抗体效价在105以上,该抗体能与原核和真核系统中表达的np蛋白特异性反应,为研制以np蛋白为抗原组分的人禽流感亚单位疫苗和建立评价方法奠定了基础。

关键词： H5N1A型流感病毒核蛋白np 原核表达多克隆抗体

禽流感病毒基质蛋白M1、核蛋白np单克隆抗体的制备及鉴定

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禽流感病毒基质蛋白M1、核蛋白NP单克隆抗体的制备及鉴定

作者：戴晓光内蒙古农业大学

学位级别：硕士

本研究利用纯化的H9N2亚型禽流感病毒以及重组真核表达质粒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得三株能稳定传代并分泌抗H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体... 详细信息

本研究利用纯化的H9N2亚型禽流感病毒以及重组真核表达质粒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得三株能稳定传代并分泌抗H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的杂交瘤细胞3G8、2F6、5F2以及能稳定传代并分泌抗H9亚型禽流感病毒核蛋白np单克隆抗体的杂交瘤细胞3G4、1C6。用间接ELISA方法测得这五株单克隆抗体的小鼠腹水间接ELISA效价达10以上。

关键词： H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1 核蛋白np 单克隆抗体

核蛋白np对H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫效果的影响

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核蛋白NP对H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗免疫效果的影响

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白np原核表达载体的构建与表达

中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会

作者：薛春宜陈娴娴马军陈峰毕英佐曹永长中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室华南农业大学动物科学学院

前言禽流感(AI)是由A型流感病毒(AIV)引起的一种禽鸟的高度接触性传染病。与其他病毒性疾病一样,应用疫苗免疫是进行预防的最有效手段。病毒样颗粒(VLPs)具有病毒的外壳,但其内部不含遗传物质,从而不具传染性,因此可发展成为新型的疫苗... 详细信息

前言禽流感(AI)是由A型流感病毒(AIV)引起的一种禽鸟的高度接触性传染病。与其他病毒性疾病一样,应用疫苗免疫是进行预防的最有效手段。病毒样颗粒(VLPs)具有病毒的外壳,但其内部不含遗传物质,从而不具传染性,因此可发展成为新型的疫苗。本课题组利用重组杆状病毒表达了AIV的结

关键词：核蛋白np 禽流感疫苗免疫病毒样颗粒动物实验特异性抗体

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江苏预防医学 2014年第1期25卷 16-18页

作者：张文帅张黎温恬迟莹黄超彭海燕焦永军史智扬江苏省疾病预防控制中心南京210009

目的构建甲型H7N9禽流感病毒np基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒np基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-np质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-np质粒转化表达菌BL2... 详细信息

目的构建甲型H7N9禽流感病毒np基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒np基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-np质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-np质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达np重组蛋白。应用western blot法鉴定np蛋白的表达。结果成功构建np基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的np重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9np重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。

关键词： H7N9亚型禽流感病毒核蛋白np 原核表达

H7N9流感病毒核蛋白（np）的细胞定位及其对病毒毒力的影响

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H7N9流感病毒核蛋白（NP）的细胞定位及其对病毒毒力的影响

第四届全国人畜共患病学术研讨会2014年中国狂犬病年...

作者：侯力丹刘文军中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫重点实验室

＜正＞流行性感冒是由流感病毒引起的具有高度传染性的急性呼吸道疾病,由于其较高的自然感染率和抗原变异性,使流感的防控面临很大挑战。而2013年爆发的H7N9禽流感,出现对人的感染及致死能力,为人类健康和养殖业发展带来严重威胁。np蛋... 详细信息

＜正＞流行性感冒是由流感病毒引起的具有高度传染性的急性呼吸道疾病,由于其较高的自然感染率和抗原变异性,使流感的防控面临很大挑战。而2013年爆发的H7N9禽流感,出现对人的感染及致死能力,为人类健康和养殖业发展带来严重威胁。np蛋白作为流感病毒中含量丰富的核蛋白,在流感病毒的感染和复制过程中扮演着重要角色。同时,调节np蛋白在细胞内入核、出核的因素在影响病毒毒力和病毒的跨种间传播方面中起着关键作用。本研究中,我们主要选用WSN（A/WSN/1933（H1N1））,Anhui（A/Anhui/1/2013（H7N9））两

关键词：细胞定位核蛋白np 病毒毒力

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Dhori病毒核蛋白抗原表位的筛选及鉴定

中国人兽共患病学报 2022年第11期38卷 956-962页

作者：张敏古丽娜孜·沙都汉刘利平王岚孙素荣张渝疆丁军涛新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室乌鲁木齐830046 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心乌鲁木齐830001

目的研究鉴定DHOV核蛋白(np)的最小线性B细胞表位(BCEs),为DHOV的疫苗研制和预防奠定基础。方法本研究针对DHOV-GRT169毒株np蛋白进行生物信息学分析,采用改良生物合成肽法鉴定其BCEs。首先将DHOV np蛋白截短为4个片段并鉴定其抗原性,... 详细信息

目的研究鉴定DHOV核蛋白(np)的最小线性B细胞表位(BCEs),为DHOV的疫苗研制和预防奠定基础。方法本研究针对DHOV-GRT169毒株np蛋白进行生物信息学分析,采用改良生物合成肽法鉴定其BCEs。首先将DHOV np蛋白截短为4个片段并鉴定其抗原性,将阳性片段继续截短成相互重叠8个氨基酸的16肽,将16肽序列分别克隆至原核表达载体pXXGST-3中表达,兔抗融合蛋白np蛋白多克隆抗体作为一抗,用Western blotting检测16肽的抗原性,将检测出的阳性16肽都截短成相互重叠7个氨基酸的8肽,用同样的方法诱导表达及检测。最后用生物信息学方法分析每个BCEs在np蛋白三维结构中的位置。结果从np蛋白中最终鉴定出9个BCEs,分别为Enp1(^(3)npTPKR^(8))、Enp2(^(7)KRAEPGD^(13))、Enp3(^(83)YUFFFL^(88))、Enp4(^(111)NQTLTDE^(117))、Enp5(^(224)QSQKAMLK^(231))、Enp6(^(227)KAMLKQIF^(234))、Enp7(^(418)LNAEFEEY^(425))、Enp8(^(421)EFEEYSKL^(428))、Enp9(^(432)GTGAFYER^(439)),均位于np蛋白表面。结论这些鉴定的表位将提高对DHOV表位分布和致病机制的认识,为DHOV多表位检测抗原的开发提供基础,也可为DHOV感染与免疫机制研究提供理论依据。

关键词：蜱传Dhori病毒核蛋白np 改良生物合成肽法最小抗原表位

鸡CCT5蛋白与禽流感病毒np、PB2蛋白互作促进病毒复制的研究

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鸡CCT5蛋白与禽流感病毒NP、PB2蛋白互作促进病毒复制的研究

作者：张筱涵华中农业大学

学位级别：硕士

禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于正黏病毒科,禽流感病毒属。禽类是禽流感病毒的易感宿主,但部分亚型的禽流感病毒也可以感染人。在家禽中流行的部分H5亚型流感病毒属于高致病性禽流感（High pathogenic avian influenza,H... 详细信息

禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于正黏病毒科,禽流感病毒属。禽类是禽流感病毒的易感宿主,但部分亚型的禽流感病毒也可以感染人。在家禽中流行的部分H5亚型流感病毒属于高致病性禽流感（High pathogenic avian influenza,HPAI）,对人类健康和禽类养殖业均带来严重威胁和巨大挑战,因此,研究并认识禽流感病毒致病机制,对流感病毒防控具有重要理论指导意义。禽流感病毒与宿主蛋白之间的相互作用是病毒复制和致病的关键环节,近20年来,大量研究结果阐述了人源宿主因子在流感病毒生命周期中发挥关键作用。然而,人们对禽源宿主因子在流感病毒复制过程中的作用了解甚少。对此,本研究采用免疫沉淀-质谱联用法,挖掘与流感病毒互作的禽源宿主因子,结果发现鸡的CCT5蛋白（一种含有TCP1亚基5的胞质伴侣蛋白）与禽流感病毒np和PB2有直接相互作用。进一步的研究表明,病毒感染显著促进DF-1（鸡胚成纤维细胞）内CCT5的表达水平,上调的CCT5反过来促进np蛋白的核输出,进而促进禽流感病毒的增殖。综上结果,显示禽类CCT5在支持禽流感病毒复制方面具有重要作用。本课题的主要研究内容如下:1.免疫沉淀-质谱联用技术筛选与病毒蛋白互作的禽源宿主因子本研究构建了p CAGGS-HA-np质粒转染DF1细胞,在用流感病毒H5N6感染表达了np蛋白的DF1细胞后,通过免疫沉淀技术特异性np抗体垂钓互作蛋白,利用SDS-PAGE电泳并进行银染,找到差异蛋白,并对差异蛋白条带进行蛋白质谱分析,鉴定了72个潜在的np蛋白互作宿主因子。与文献报道的np互作蛋白进行筛查比对,发现CCT5,FARSA,MTHFD1L,NOP56和RUVBL1五个蛋白有可能与np蛋白互作。接下来本研究利用si RNA分别沉默这五个候选宿主因子,检测其对流感病毒np蛋白及m RNA含量的影响。结果显示,CCT5,FARSA,MTHFD1L三个基因的沉默对流感病毒np蛋白的表达都具有明显的抑制作用,其中,CCT5基因沉默对np/PA/PB2表达量的抑制效果最为明显。2.构建CCT5表达质粒、验证CCT5与病毒结构蛋白的互作关系实验中克隆了禽源CCT5基因,并将其连接到p3Xflag载体上,将其与HAnp/PB2表达质粒共转染到DF1细胞中,通过免疫共沉淀技术分别使用HA,Flag抗体相互垂钓并检验互作关系;单独表达CCT5-Flag蛋白感染病毒后使用内源性抗体CCT5和np/PB2相互垂钓。同时免疫荧光技术验证了这一结果,CCT5与np、PB2蛋白无论是过表达还是在感染流感病毒条件下都会产生互作,因此有这样一种猜测,即CCT5可能是np、PB2蛋白的配体,并参与流感病毒的复制过程。3.验证CCT5与流感病毒复制的关系根据荧光定量的结果说明,si-CCT5对流感病毒np、PA、PB2蛋白的表达都具有明显抑制作用,使用流式分析方法后发现,CCT5沉默的DF1细胞能够抑制带GFP荧光标记的H5N6流感病毒的复制,后续的结果表明,CCT5的表达量随H5N6以及H1N1（HM/DW）流感病毒感染时间以及感染梯度的增加而增殖,这说明流感病毒促进了CCT5的表达。当研究CCT5对流感病毒RNA生成的影响时,发现CCT5的沉默能够抑制流感病毒RNA的合成,反之,CCT5表达能够促进流感病毒RNA的合成。为了进一步证实,实验采用间接免疫荧光实验证实CCT5与np在细胞中存在共定位,并对np蛋白的出核起到促进作用。

关键词：流感病毒核蛋白np 聚合酶PB2 胞质伴侣蛋白CCT5 蛋白互作