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病毒学报 2023年第5期39卷 1369-1376页

作者：王迁迁段笑笑刘枢清葛栋孟海蓝李彦刘拂晓青岛农业大学动物医学院青岛266109 内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010018 青岛市动物疫病预防控制中心青岛266199 青岛立见生物科技有限公司青岛266114

A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)5’非编码区包含一个内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES),其下游假结结构与起始密码子(AUG)之间具有高度保守的13-nt序列,称为“13-nt基序”。为研究其核苷酸数量增加是否影响SVA... 详细信息

A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)5’非编码区包含一个内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES),其下游假结结构与起始密码子(AUG)之间具有高度保守的13-nt序列,称为“13-nt基序”。为研究其核苷酸数量增加是否影响SVA复制,本研究在该基序末端逐个插入核苷酸,从而构建了11个SVA cDNA克隆,将所有重组质粒分别转染至BSR-T7/5细胞,以拯救具有复制能力的重组病毒,进而分析重组病毒的遗传稳定性及生长动力学。结果表明,只有1~2 nt插入的cDNA克隆转染BSR-T7/5细胞后能够拯救出SVA。病毒在体外连续传代十次后测序表明,插入的核苷酸具有完全的基因稳定性。然而,与野生型病毒相比,插入1~2 nt的拯救病毒生长动力学均受到了抑制,表明IRES下游假结与起始密码子之间序列长度对于SVA复制至关重要。本研究为将来揭示SVA复制的分子调控机制奠定了理论基础。

关键词： A型塞尼卡病毒 13-nt基序核苷酸插入反向遗传学生长动力学

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绿脓杆菌噬菌体PaP1 DNA聚合酶通过DNA损伤的动力学机制研究

绿脓杆菌噬菌体PaP1 DNA聚合酶通过DNA损伤的动力学机制研究

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作者：顾仕苓重庆理工大学

学位级别：硕士

绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种条件致病的耐药菌,可引起人类多种感染性疾病。近年来由于抗生素的不合理使用甚至滥用,临床治疗比较困难,缺乏有效的抗菌制剂。噬菌体具有宿主特异性的特点,可以应用噬菌体治疗多重耐药菌的感... 详细信息

绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种条件致病的耐药菌,可引起人类多种感染性疾病。近年来由于抗生素的不合理使用甚至滥用,临床治疗比较困难,缺乏有效的抗菌制剂。噬菌体具有宿主特异性的特点,可以应用噬菌体治疗多重耐药菌的感染。最近本实验室分离出一株绿脓杆菌的裂解性噬菌体PaP1,它能有效侵染并裂解绿脓杆菌,噬菌体基因90编码的蛋白（gp90）是DNA聚合酶,其可以快速复制产生大量子代噬菌体,并杀死其宿主。但噬菌体DNA复制时会遇到DNA损伤,可能影响DNA复制,进一步会影响噬菌体侵染和裂解绿脓杆菌的能力。为了更好的理解噬菌体的侵染机制和复制效率,我们在体外表达纯化噬菌体PaP1的DNA聚合酶gp90,研究DNA聚合酶进行DNA复制以及通过8-oxoG和O-MeG两种DNA损伤的动力学机制。研究目的:本课题研究目的在于构建、表达和纯化没有外切酶活性的绿脓杆菌噬菌体PaP1的DNA聚合酶,在分子层面上研究其进行DNA复制以及跨DNA损伤复制的动力学机制,有助于噬菌体药物的研发以及指导合理用药。研究方法:（1）构建、表达和纯化没有外切酶活性的gp90。本课题组前期已经发现噬菌体PaP1 DNA聚合酶gp90具有单链DNA和双链DNA外切酶活性。进行体外动力学实验,为了排除对错配切除的影响,仅仅研究聚合酶本征的性质,需要去除外切酶活性。首先构建质粒,其可以表达消除外切酶的DNA聚合酶突变体,然后用IPTG诱导表达,利用镍柱纯化带有组氨酸标签的gp90及其突变体。（2）DNA聚合酶参与DNA复制以及通过8-oxoG损伤的动力学机制研究。通过稳态动力学方法,研究全长延伸、单个核苷酸插入和下一位碱基延伸中8-oxoG对DNA复制效率和保真度的影响;采用稳态前动力学方法研究DNA复制通过8-oxoG损伤时单点插入效率;采用生物物理相互作用研究方法,研究8-oxoG对DNA聚合酶与DNA相互作用的影响。（3）DNA聚合酶通过O-MeG的动力学机制研究。通过稳态动力学方法,研究全长延伸、单个核苷酸插入以及下一位碱基延伸中O-MeG对DNA复制效率和保真度的影响;利用稳态前动力学方法,研究单个核苷酸插入的效率;采用生物物理相互作用研究方法,研究O-MeG对聚合酶和DNA相互作用的影响;采用stopped-flow Auto SF-120快速荧光动力学方法研究O-MeG对聚合酶构象改变的影响机制。研究结果:（1）根据生物信息学分析预测外切酶活性位点,通过点突变试剂盒将gp90第60位谷氨酸、第137位天冬氨酸和第234位天冬氨酸分别突变成丙氨酸。然后低温诱导蛋白表达并用镍柱纯化。用32P同位素标记技术检测外切酶和聚合酶活性。结果发现只有gp90 D234A既消除了外切酶活性又保留相当的聚合酶活性,称为gp90 exo-。（2）DNA聚合酶gp90 exo-进行DNA复制时,与正常模板G相比,DNA聚合酶通过8-oxoG和O-MeG时,延伸产物明显减少,并伴随着中间产物生成,这说明DNA氧化损伤和甲基化损伤都会部分抑制gp90 exo-聚合反应。（3）DNA聚合酶在正常模板G上插入dNTP时,采用稳态动力学方法,相对于正配dCTP,发现单个核苷酸错配插入的催化效率kcat基本没变,而Km值增加了103倍,导致错配率在10-4-10-5之间。对于8-oxoG,DNA聚合酶插入四种核苷酸的效率都降低,但错配率依然保持在10-4-10-5之间,错配时Km增加且kcat值减小。通过O-MeG损伤时,DNA聚合酶插入四种核苷酸的效率降低,错配率也增加,尤其是更倾向于错误插入dTTP,其插入效率是正配dCTP的67倍,原因是Km减小且kcat值增加。（4）对于错配与正配对下一位碱基延伸反应的影响,相对于G:C配对,发现G:A配对导致下一位碱基延伸效率降低8倍,G:T配对效率降低50倍,其中Km基本没有改变,kcat值降低;对于8-oxoG,不管错配与否,对下一位碱基插入基本没有任何影响;O-MeG错误插入dTTP,反而促进下一位碱基的延伸。（5）DNA聚合酶进行单个dNTP插入的稳态前动力学研究,相对于其它错配dNTP,正配dCTP优先插入到G的对位,并显示出快速相,说明dCTP插入速率快于DNA聚合酶从DNA上解离的速率。在G的对位插入dATP、dTTP和dGTP,其延伸产物随着时间呈线性关系。dCTP和dATP优先插入8-oxoG的对位并产生快速相,而插入dTTP和dGTP时,其延伸产物随着时间呈线性关系;dCTP和dTTP优先插入O-MeG的对位并产生快速相,而插入dATP和dGTP时,其延伸产物随着时间呈线性关系。（6）DNA聚合酶与DNA的解离常数（Kd,DNA）用SPR方法测定,研究发现8-oxoG和O-MeG损伤不影响gp90 exo-与DNA的相互作用;但是存在dNTP和Mg2+时有助于DNA聚合酶与DNA的结合,而与正常

关键词：绿脓杆菌噬菌体PaP1 DNA聚合酶稳态动力学稳态前动力学核苷酸插入

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抗体多样性的研究进展

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国际检验医学杂志 2014年第9期35卷 1147-1149页

作者：何涛君陆学东深圳市福田区人民医院检验科广东深圳518033

关于抗体多样性的遗传起因,科学家曾经提出了2种解释理论：一是生殖系理论,认为所有抗体都由专一基因负责,该理论的问题在于,面对如此众多的抗体,生物体内的基因数目无法满足需求;二是体细胞突变理论,认为抗体基因可以发生突变和重组,... 详细信息

关于抗体多样性的遗传起因,科学家曾经提出了2种解释理论：一是生殖系理论,认为所有抗体都由专一基因负责,该理论的问题在于,面对如此众多的抗体,生物体内的基因数目无法满足需求;二是体细胞突变理论,认为抗体基因可以发生突变和重组,该理论能够解释较少的基因即可产生大量微小差异的抗体。目前这2个理论都缺乏相关的实验支持。

关键词：抗体多样性基因重排突变核苷酸插入

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