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作者：杨琼华中农业大学

学位级别：硕士

DNA拓扑异构酶是一类广泛存在的核酸代谢酶,它在维持DNA的超螺旋状态方面发挥重要作用。许多抗癌药物都是通过拓扑异构酶干扰DNA复制、重组和基因表达从而发挥疗效的。因此,拓扑异构酶已经成为一种重要的潜在药物靶标。本课题是以结核... 详细信息

DNA拓扑异构酶是一类广泛存在的核酸代谢酶,它在维持DNA的超螺旋状态方面发挥重要作用。许多抗癌药物都是通过拓扑异构酶干扰DNA复制、重组和基因表达从而发挥疗效的。因此,拓扑异构酶已经成为一种重要的潜在药物靶标。本课题是以结核分枝杆菌的拓扑异构酶I (Rv3646c, TopA)为基础,筛选和鉴定了与之相互作用的两个蛋白质,并进一步研究了它们之间的功能性的调控关系,主要取得以下几方面的结果：(1)采用细菌双杂交和SPR等技术证实了分枝杆菌(结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌)中3-甲基腺嘌呤DNA糖苷水解酶和核糖激酶等两个蛋白质与TopA之间保守的物理相互作用,进一步通过随机突变分别鉴定了这两对蛋白相互作用必要的氨基酸残基。(2)体外酶功能分析表明,TopA能够增强糖苷水解酶对含有次黄嘌呤损伤DNA底物的切割活性;相反,糖苷水解酶能够抑制DNA拓扑异构酶松弛质粒超螺旋的功能。当两个蛋白质的物理相互作用丧失,这种功能性的相互影响也发现随之丢失。(3)TopA能够增强核糖激酶对D-核糖的磷酸化活性;相反,核糖激酶却减弱了DNA拓扑异构酶的解螺旋活性。类似地,这种功能性的调控也依赖两个蛋白质之间的物理相互作用。(4)免疫共沉淀实验证实,3-甲基腺嘌呤DNA糖苷水解酶和核糖激酶两个蛋白质分别能与TopA在耻垢分枝杆菌细胞内发生物理相互作用,暗示这些蛋白质相互作用可以具有生理学上的意义。3-甲基腺嘌呤DNA糖苷水解酶、核糖激酶以及DNA拓扑异构酶都是重要的核酸代谢酶,它们在DNA复制以及转录和修复等过程中发挥不可或缺的重要作用。本研究首次鉴定了它们之间的物理的和功能性的相互作用,这些结果为我们深入理解分枝杆菌中DNA拓扑异构酶的功能及其调控机制提供了重要信息,有关相互作用位点也是潜在的抗结核药物新靶标。

关键词：结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌蛋白质-蛋白质相互作用 DNA拓扑异构酶 3-甲基腺嘌呤DNA糖苷水解酶核糖激酶

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结核分枝杆菌核糖激酶有潜在的血清学诊断价值

结核分枝杆菌核糖激酶有潜在的血清学诊断价值

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作者：易小妹南华大学

学位级别：硕士

研究背景:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)能引起慢性人畜共患传染病——结核病(Tuberculosis,TB)。目前,实验室诊断TB的常用方法均有其各自的优缺点,其中血清学检测其方法简单、低廉、高效,是体外诊断TB较常用的方法,成... 详细信息

研究背景:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)能引起慢性人畜共患传染病——结核病(Tuberculosis,TB)。目前,实验室诊断TB的常用方法均有其各自的优缺点,其中血清学检测其方法简单、低廉、高效,是体外诊断TB较常用的方法,成为近年来TB诊断的研究热点[3]。为了研制特异、敏感的血清学诊断试剂,必须从MTB的全基因组范围内筛选到能用于TB血清学诊断的免疫优势抗原,以进一步评价其在TB血清学诊断中的应用价值。研究目的:从T7噬菌体展示的MTB基因组DNA文库中筛选能与TB阳性血清特异结合的蛋白,原核表达并纯化该蛋白后检测其在TB血清学诊断中的应用价值,以便为从全基因组范围内找到比较理想的能用于TB临床血清学诊断的候选抗原奠定实验基础。研究方法:(1)采用饱和硫酸铵法初步纯化TB阳性血清,以此为靶分子对T7噬菌体展示的MTB基因组DNA文库进行3轮生物淘选。(2)将末次淘选产物铺板培养,随机挑取噬菌体克隆,用PCR法扩增插入到噬菌体的外源性DNA片段,对PCR产物进行DNA测序和BLAST比对分析,并对外源性DNA序列的一致性进行分组。(3)分别用间接ELISA法和斑点免疫印迹试验鉴定代表性噬菌体能否与TB阳性血清特异结合。(4)以MTB基因组DNA为模板,采用PCR法扩增插入到重复出现次数最高的代表性噬菌体的核糖激酶(Ribokinase,RK)基因后与p ET-28a(+)连接以构建重组载体,将其转化入宿主菌***(DE3)后用IPTG诱导表达重组RK。(5)用Ni-NAT亲和层析柱纯化重组RK,并用Westernblot对其进行鉴定。(6)间接ELISA检测RK与不同临床血清的反应情况,并绘制受试者工作特征(Receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲线,评价其灵敏度、特异度与曲线下面积(Areaundercurve,AUC)。研究结果:(1)经过3轮生物淘选,噬菌体的产量和产率逐步升高,说明与TB阳性血清特异结合的噬菌体得到了明显的富集。(2)成功扩增随机挑取的19个阳性噬菌体的外源性DNA片段,BLAST分析的结果表明这些噬菌体的外源性DNA序列共包括4种不同的序列(代表性噬菌体P1～P4),其中以含有RK基因部分序列的代表性噬菌体P1重复出现的次数最高,其重复率为68.42%。(3)间接ELISA和斑点免疫印迹试验的结果表明筛选到的4个代表性噬菌体均能与TB阳性血清特异结合。(4)成功扩增RK基因的DNA序列并构建了原核表达载体p ET-28a(+)/RK,将其转化入宿主菌*** Rosetta(DE3)后用IPTG诱导表达出重组RK。(5)用Ni-NAT亲和层析柱成功纯化出重组RK,Westernblot的结果表明重组RK能与抗6×His抗体和TB阳性血清特异结合。(6)间接ELISA的结果表明,重组RK与TB阳性血清的OD450值明显高于其与TB阴性血清的OD值。重组RK用于检测临床血清时其特异度为90%,灵敏度为86%,说明具有较高的特异性和敏感性,其中AUC为0.9741。研究结论:(1)成功筛选到能与TB阳性血清特异结合的4种抗原,其中RK可能为能与TB阳性血清特异结合的优势抗原。(2)MTB的RK在TB血清学诊断中具有较高的特异性和敏感性。

关键词：结核分枝杆菌 T7噬菌体基因组DNA文库核糖激酶结核病血清学诊断

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重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷

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生物工程学报 2024年第3期40卷 799-811页

作者：王倩倩刘亚琦屈琰刘欢高歌徐庆阳陈宁范晓光天津科技大学生物工程学院天津300457 天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,... 详细信息

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,质粒过表达内源的假尿苷-5-磷酸糖苷酶、核糖激酶和核糖核苷水解酶,构建出尿苷到假尿苷的代谢途径,实现了假尿苷的积累;然后,筛选内源的高活性核糖核苷水解酶,促进了尿苷的水解,为假尿苷的合成提供了更多前体;接着,对底物与产物的转运途径进行改造,提升假尿苷产量的同时避免了副产物尿苷的积累。最终获得的重组菌株Ψ-7在24 h内可以全细胞催化30 g/L尿苷产生27.24 g/L假尿苷,转化率为90.8%,生产效率为1.135 g/(L·h),假尿苷产量和生产效率为现有酶催化法报道的最高值。

关键词：假尿苷大肠杆菌全细胞催化假尿苷-5-磷酸糖苷酶核糖激酶核糖核苷水解酶

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