检索结果-南通市图书馆

作者：薛珂上海交通大学

学位级别：硕士

核糖核酸酶t2是广泛表达在原核生物、真核生物上的一类底物非特异性核糖核酸内切酶,它参与细胞核糖核酸分解、细胞免疫应答、细胞增殖与运动等多种功能。此外,它还有肿瘤抑制作用,而这种抑制作用并不是基于它的核糖核酸酶活性,有研究发... 详细信息

核糖核酸酶t2是广泛表达在原核生物、真核生物上的一类底物非特异性核糖核酸内切酶,它参与细胞核糖核酸分解、细胞免疫应答、细胞增殖与运动等多种功能。此外,它还有肿瘤抑制作用,而这种抑制作用并不是基于它的核糖核酸酶活性,有研究发现核糖核酸酶t2的家族成员ACtIBIND可以通过与血管生成素竞争性的结合肿瘤细胞中的肌动蛋白,从而抑制细胞的生长与迁移。哺乳动物的精子中表达有丰富的肌动蛋白,并且主要表达在精子头部、颈部和尾部鞭毛部位,其对精子运动能力的产生具有重要的作用。因此我们设想核糖核酸酶t2在哺乳类精子,如小鼠和人精子上是否有表达?如有表达,情况如何?是否通过与肌动蛋白相互作用从而影响精子的运动能力?如果是,那么体外加入纯化的核糖核酸酶t2蛋白是否会影响精子的运动?鉴于上述的推测,我们通过蛋白质免疫印迹、激光共聚焦显微镜分析以及酶联免疫吸附法检测核糖核酸酶t2在雄性小鼠生殖器官表达、及其在精子上与肌动蛋白的表达关系,结果发现核糖核酸酶t2在雄性生殖系统主要定位在附睾头部和前列腺以及输精管管腔,并与肌动蛋白共表达在雄性小鼠精子的顶体部位、颈部以及尾部鞭毛区域。这说明表达在小鼠精子中的核糖核酸酶t2可能与精子活动力的调节有着密不可分的联系。因此,根据上述研究结果,我们通过从黑曲霉菌的培养液中分离、纯化出具有生物活性的核糖核酸酶t2,并将核糖核酸酶t2蛋白与小鼠附睾尾部的精子共孵育后,对小鼠精子的活动力及前向运动等指标进行检测,结果证实核糖核酸酶t2可以明显抑制小鼠精子活动力(p核糖核酸酶t2在正常生育男性精子上的表达定位以及其与actin表达共定位进行了鉴定,发现核糖核酸酶t2表达在人精子的顶体部位、颈部以及尾部鞭毛部位,与actin具有部分共定位,尤其是在与精子运动相关的尾部,并且从黑曲霉菌的培养液中分离、纯化出具有生物活性的核糖核酸酶t2同样可以明显抑制人精子活动力及前向运动力且具有时间和剂量依赖性。因此,明确核糖核酸酶对精子活动力的抑制作用可为我们进一步研究其作用的分子机制及发现临床因精子活动力低下导致的男性不育的病理机制奠定重要的理论基础并提供必要的实验依据。

关键词：核糖核酸酶t2 蛋白纯化肌动蛋白精子活动力前向运动

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日本血吸虫核糖核酸酶t2的表达及其功能分析

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中国病原生物学杂志 2013年第12期8卷 1082-1088,1092页

作者：柯雪丹余传信宋丽君菊池三惠子平山谦二王玠殷旭仁金一沈双姚媛高玒高琪苏州大学基础医学系寄生虫学教研室江苏苏州215021 江苏省血吸虫病防治研究所卫生部寄生虫病预防与控制技术重点实验室日本长崎大学热带医学研究所分子免疫遗传室

目的制备重组日本血吸虫核糖核酸酶t2蛋白(rSj RNase t2),并分析其生物学功能。方法根据编码RNase t2开放阅读的基因序列设计、合成一对5′端带有酶切位点的引物。采用PCR方法从质粒CP1412/PEU-GSt中扩增编码RNase t2蛋白成熟肽的基因片... 详细信息

目的制备重组日本血吸虫核糖核酸酶t2蛋白(rSj RNase t2),并分析其生物学功能。方法根据编码RNase t2开放阅读的基因序列设计、合成一对5′端带有酶切位点的引物。采用PCR方法从质粒CP1412/PEU-GSt中扩增编码RNase t2蛋白成熟肽的基因片段,亚克隆到表达载体pEt28a(+)中,构建重组表达质粒Sj RNase t2-pEt28a。将重组表达质粒转化到*** BL21中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPtG)进行诱导表达,用镍螯合亲和层析胶在变性条件下纯化rSj RNase t2蛋白。纯化蛋白通过尿素浓度梯度透析的方法进行复性,制备可溶性rSj RNase t2。以酵母RNA为底物进行消化,采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测rSj RNase t2酶活性。用纯化的rSj RNase t2免疫小鼠,采用酶联免疫法(ELISA)检测小鼠血清特异抗体水平,观察其抗原性;采用检测Western blot抗rSj RNase t2抗体IgG与成虫可溶性虫抗原、成虫外分泌抗原、虫卵可溶性抗原和虫卵外分泌抗原的反应性,并观察Sj RNase t2在虫体中的分布。以rSj RNase t2刺激巨噬细胞RAW264.7,通过流式分析观察RAW264.7细胞表面标志物CD16/32、CD206表达水平的变化,采用Rt-PCR检测RAW264.7细胞内诱导型一氧化氮合酶与精氨酸酶基因mRNA的表达水平,采用ELISA检测RAW264.7细胞培养上清液中IL-12及IL-10水平的变化,以观察Sj RNase t2的免疫调节功能。结果重组表达质粒Sj RNase t2-pEt28a构建成功,经IPtG诱导,能表达重组Sj RNase t2蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,经过复性能获得部分可溶性蛋白。rSj RNase t2具有酶活性,能够水解酵母RNA。ELISA检测rSj RNase t2免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1︰200 000,该抗血清能识别来源于血吸虫虫卵及虫卵外分泌抗原中的天然RNase t2。rSj RNase t2可诱导巨噬细胞向M2型方向转化,表达高水平的IL-10、精氨酸酶及CD206表面分子。结论 rSj RNase t2表达成功。该蛋白具有天然的酶学特性和抗原性,能调节巨噬细胞向M2型方向分化。

关键词：血吸虫,日本核糖核酸酶t2 表达功能分析免疫调节

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日本血吸虫核糖核酸酶AY841845蛋白的表达与功能分析

日本血吸虫核糖核酸酶AY841845蛋白的表达与功能分析

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作者：刘茜江苏省血吸虫病防治研究所

学位级别：硕士

血吸虫病是一种广泛流行于热带与亚热带地区的人兽共患病,全世界有6-7亿人生活在血吸虫病流行区,血吸虫感染者人数超过了2亿,我国流行的是日本血吸虫病。血吸虫感染对人体最严重的危害是在患者肝脏中产生虫卵肉芽肿炎症,随后形成肝纤维... 详细信息

血吸虫病是一种广泛流行于热带与亚热带地区的人兽共患病,全世界有6-7亿人生活在血吸虫病流行区,血吸虫感染者人数超过了2亿,我国流行的是日本血吸虫病。血吸虫感染对人体最严重的危害是在患者肝脏中产生虫卵肉芽肿炎症,随后形成肝纤维化、肝硬化,患者的肝功能受到严重损害。随着感染的发展,宿主免疫反应平衡逐渐由th1向th2反应方向漂移,最后形成以th2反应为主的极化状态。形成这一病理变化过程的分子机制依然未完全阐明,显然,虫源性的抗原分子对宿主免疫系统功能的调节在这一过程中发挥了至关重要的作用。国外众多的研究结果表明,寄生虫的核糖核酸酶分子(如肝吸虫、曼氏血吸虫,等等)具有强力的th2型免疫反应极化作用,曼氏血吸虫虫卵中的Omega-1蛋白分子已被证明是曼氏血吸虫虫卵中最主要的th2型免疫反应诱导成分,去除曼氏血吸虫虫卵中的Omega-1分子会显著下调虫卵抗原分子的th2极化作用。本课题组前期的研究工作证明虫卵特有的外分泌蛋白Sj CP1412是日本血吸虫虫卵抗原中主要的th2免疫反应极化分子,其免疫调节作用与其核糖核酸酶活性相关。我们的生物信息学分析结果显示,在已发表的日本血吸虫基因序列中存在多个核糖核酸酶t2家族成员,它们都具有核糖核酸酶t2家族的保守功能基团序列。为进一步研究核糖核酸酶t2家族成员在日本血吸虫感染免疫调节中的作用,本研究对Genbank中登录号为AY841845的蛋白分子进行了基因克隆、蛋白表达、纯化与功能分析。研究内容主要包括以下几个方面。一、Sj AY841845蛋白基因克隆、蛋白表达与纯化根据已发表的Sj AY841845基因序列,合成基因特异性引物,采用PCR技术从日本血吸虫成虫c DNA文库中扩增出编码Sj AY841845蛋白成熟肽的基因片段,其长度为636bp。再通过限制性内切酶Bam H1和Sal1位点将编码Sj AY841845的基因片段亚克隆到表达质粒p Et41a(+)中,构建重组表达质粒p Et41a-Sj AY841845。经过限制性酶切分析和DNA测序证实目的基因片段已正确插入,并与载体上的谷胱甘肽转移酶基因(Glutathione S-transferase,GSt)进行了框内融合。随后,将重组表达质粒p Et41a-Sj AY841845转化到大肠杆菌BL21(DE3)中形成表达工程菌p Et41a-Sj AY841845/***21(DE3),在LB培养基中用IPtG对表达工程菌p Et41a-Sj AY841845/***21(DE3)进行诱导,获得重组表达的GSt-Sj AY841845融合蛋白,分子量为57.2k Da。将表达产物用8M尿素溶解,采用镍柱亲和层析法对表达产物中的重组GSt-SjAY841845融合蛋白进行纯化,获得了纯化的重组GSt-Sj AY841845融合蛋白。然后,将变性条件下纯化的重组GSt-Sj AY841845蛋白用梯度尿素PBS进行透析,并加入0.5 M精氨酸,使变性状态的GSt-Sj AY841845融合蛋白复性成可溶性蛋白。用肠激酶(Enterokinase,EK)将复性后得到的可溶性GSt-Sj AY841845融合蛋白进行酶切,切除GSt标签。酶切产物再过镍亲和层析柱,收集穿透液,获得去除GSt标签的纯化重组Sj AY841845蛋白,电泳结果显示其大小与预测的Sj AY841845蛋白成熟肽大小(24.9k Da)相似。二、Sj AY841845核糖核酸酶活性及其表达谱分析用纯化的Sj AY841845蛋白对酵母t RNA进行消化,结果显示随着重组Sj AY841845蛋白量的增加,其水解酵母t RNA的能力也提高,表明纯化的重组Sj AY841845蛋白具有核糖核酸酶活性。分别制备日本血吸虫不同发育阶段虫体(虫卵、尾蚴、成虫)的m RNA和可溶性蛋白,以等量的m RNA为模板和等量的蛋白抗原,分别进行Rt-PCR扩增和免疫印渍分析,以检测Sj AY841845在日本血吸虫不同发育阶段的表达水平。PCR产物的电泳结果显示在日本血吸虫的成虫,尾蚴及虫卵阶段都可以扩增出大小与Sj AY841845预期大小(636bp)基因片段相同的特异性DNA片段。免疫印渍结果也显示Sj AY841845在日本血吸虫的不同发育阶段均有表达。三、Sj AY841845蛋白的免疫调节功能分析:以纯化的重组Sj AY841845刺激巨噬细胞RAW264.7,采用ELISA检测受刺激巨噬细胞培养上清液中IL-12、IL-10的表达水平,用Rt-PCR检测巨噬细胞中i NOS、Arg-1 m RNA的表达水平,流式分析检测巨噬细胞表面CD206、CD16/32的表达水平。检测结果显示重组Sj AY841845能刺激巨噬细胞分泌高水平的IL-10,

关键词：日本血吸虫核糖核酸酶t2 AY841845蛋白免疫调节虫卵肉芽肿病变

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RNA酶t2在雄性小鼠生殖系统中的表达及对精子活动力的影响

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中国男科学杂志 2014年第7期28卷 3-7,18页

作者：薛珂凡永刘悦丁之德上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系上海200025

目的：检测核糖核酸酶t2（ribonuclease t2, RNaset2）在雄性小鼠生殖系统和精子中的表达、定位及其对精子活动力及前向运动的影响。方法运用免疫荧光染色鉴定RNaset2蛋白在小鼠生殖系统中的表达、定位及其与肌动蛋白（actin）在精子中... 详细信息

目的：检测核糖核酸酶t2（ribonuclease t2, RNaset2）在雄性小鼠生殖系统和精子中的表达、定位及其对精子活动力及前向运动的影响。方法运用免疫荧光染色鉴定RNaset2蛋白在小鼠生殖系统中的表达、定位及其与肌动蛋白（actin）在精子中的共定位关系，通过Real-time PCR检测RNaset2 mRNA在小鼠生殖系统中的相对表达水平，借助计算机辅助精液分析（CASA）仪检测RNaset2对小鼠精子的活动力、前向运动的影响。结果（1） RNaset2蛋白及其mRNA在小鼠附睾头、体、尾组织以及输精管、前列腺及精囊腺分泌液中均有表达，而在睾丸组织中极低表达或未见表达。（2）在小鼠精子上，该蛋白定位于顶体、颈部、尾部鞭毛并与actin的表达定位具有一定的相似性。（3）体外纯化的RNaset2蛋白可明显抑制小鼠精子的活动力及前向运动，且抑制具有时间及剂量依赖性。结论在雄性生殖系统中，RNaset2蛋白作为精子运动的调节因子对精子的活动力及前向运动具有明显的抑制作用。

关键词：核糖核酸酶t2 雄性生殖系统精子活动力小鼠

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