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非洲猪瘟病毒A151R蛋白核定位信号的鉴定

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中国兽医科学 2022年第12期52卷 1552-1557页

作者：王裴倪温碧钟桂芳胡伯里周继勇浙江大学动物医学中心农业农村部动物病毒学重点实验室浙江杭州310058

为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白A151R发挥功能的亚细胞定位,通过荧光显微镜观察发现,A151R蛋白能够聚集在细胞核内。使用在线软件预测A151R中存在的核定位信号(NLS),并构建缺失NLS的A151R质粒。荧光共聚焦显微镜观察结果表明,缺失... 详细信息

为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白A151R发挥功能的亚细胞定位,通过荧光显微镜观察发现,A151R蛋白能够聚集在细胞核内。使用在线软件预测A151R中存在的核定位信号(NLS),并构建缺失NLS的A151R质粒。荧光共聚焦显微镜观察结果表明,缺失NLS的重组A151R蛋白A151RΔNLS无法进入细胞核。细胞核质分离结果显示,NLS序列能够协助EGFP进入细胞核,证明了NLS的核输入能力。以上证据均表明A151R依赖于NLS进入细胞核,为进一步研究其在ASFV复制中的功能提供了重要的信息。

关键词：非洲猪瘟病毒 A151R 核定位信号亚细胞定位

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维生素D受体核定位信号的鉴定

南京医科大学学报（自然科学版） 2022年第8期42卷 1073-1079页

作者：马泽萌陈允梓南京医科大学基础医学院免疫学系江苏南京211166

目的:确定维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)的核定位信号并验证其功能。方法:通过软件分析及文献调研预测VDR核定位信号,利用点突变试剂盒构建了VDR一系列点突变体,通过蛋白质免疫印迹检测VDR在胞质和胞核里的分布,并结合免疫荧光... 详细信息

目的:确定维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)的核定位信号并验证其功能。方法:通过软件分析及文献调研预测VDR核定位信号,利用点突变试剂盒构建了VDR一系列点突变体,通过蛋白质免疫印迹检测VDR在胞质和胞核里的分布,并结合免疫荧光观察确定其预测突变点对VDR入核的影响,最后采用实时荧光定量链式聚合酶反应(quantitative real-time PCR,qPCR)检测VDR下游基因的表达,以判断VDR核定位突变体的活性。结果:确定VDR核定位信号序列为49RRSMKRKALFLT61,构建的VDR一系列核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)点突变体在细胞内的表达主要分布在胞质里,维生素D(vitamin D,VD)既不能诱导这些点突变体入核,也不能促进VD下游基因表达。结论:VDR核定位确定信号能有效控制VDR进入细胞核发挥转录因子作用,进而影响其下游基因的表达,为探索VD及VDR相关疾病的治疗提供新平台和思路。

关键词：维生素D受体维生素D 核定位信号转录调控

核定位信号在热休克蛋白70抑制氧化应激所致细胞核仁分离中的作用

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生物化学与生物物理进展 2005年第5期32卷 456-462页

作者：王慷慨鄂顺梅蒋磊张华莉刘可张玲莉肖献忠中南大学湘雅医学院病理生理学教研室长沙410078

为探讨核定位信号在热休克蛋白70(HSP70)抑制H2O2所致核仁损伤中的作用,采用分子克隆技术分别构建了4个真核表达载体,pcDNA3.1(-)-HSP70WT(HSP70野生型),pcDNA3.1(-)-HSP70ΔNLS(核定位信号缺失突变体),pEGFP-N1-HSP70WT,pEGFP-N1-HSP70ΔNLS.向传代培养的C2C12肌源细胞培养液中加入终浓度为1.0mmol/L的H2O2模拟体外氧化应激.甲苯胺蓝染色细胞核仁发现,正常细胞仅有一个位于中央的、浓染致密的核仁颗粒.过氧化氢处理后3h,可见明显的核仁分离.热休克反应处理的细胞及转pcDNA3.1(-)-HSP70WT细胞则能明显抑制氧化应激所致的核仁分离.荧光蛋白示踪及核仁蛋白质免疫印迹分析显示,H2O2处理后1h,HSP70WT由正常时的细胞浆定位转为细胞核及核仁定位,而HSP70ΔNLS在H2O2处理后仍定位于细胞浆,同时丧失了抑制核仁分离的作用.上述结果提示,野生型HSP70能显著抑制氧化应激所致细胞核仁分离,核定位信号通过介导HSP70向细胞核及核仁移位而决定HSP70对核仁损伤的保护作用.

关键词：热休克蛋白70 核定位信号氧化应激核仁核仁分离

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核定位信号介导的细胞转运及其机制

中国药理学通报 2003年第10期19卷 1081-1083页

作者：付爱玲孙曼霁军事医学科学院毒物药物研究所北京100850

一些核定位信号肽 (NLS)具有通透生物膜和携带外源蛋白质、DNA、寡核苷酸等进入细胞的能力。NLS作为载体在运载外源物质时具有通用性。不同的NLS跨膜机制可能不同。

关键词：核定位信号转运机制研究

核定位信号在JC病毒样颗粒入核转运中的作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第1期27卷 9-13页

作者：屈秋民曹红梅乔晋杨华西安交通大学医学院第一附属医院神经内科 710061

目的探讨JC病毒（JCV）主要外壳蛋白VP1所含核定位信号（NLS）在JCV病毒样颗粒（VLP）入核转运中的作用。方法应用位点诱变法将JCV野生型VP1（wtVP1）氨基末端3个氨基酸：第5位赖氨酸、第6位精氨酸、第7位赖氨酸分别置换为丙氨酸、甘氨... 详细信息

目的探讨JC病毒（JCV）主要外壳蛋白VP1所含核定位信号（NLS）在JCV病毒样颗粒（VLP）入核转运中的作用。方法应用位点诱变法将JCV野生型VP1（wtVP1）氨基末端3个氨基酸：第5位赖氨酸、第6位精氨酸、第7位赖氨酸分别置换为丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸，制备成NIS变异的VP1（△NIS-VP1）。编码△NLS-VP1的基因克隆到原核表达质粒pET-15b中，体外表达、重组VP1 NLS变异的病毒样颗粒（△NLS-VLP），异硫氰基荧光素（FITC）标记后感染地高辛渗透或未渗透的SVG细胞，荧光显微镜观察VLP入核转运。结果wtVP1组成的病毒样颗粒（mtVLP）可以进入地高辛渗透或未渗透的SVG细胞核，而△NLS-VLP只能进入细胞浆，不能进入细胞核；体外转染后，wtVP1主要在SVG细胞核表达，而△NLS-VP1主要在细胞浆表达；包裹外源性DNA的VLP感染SVG细胞后，则wtVLP包裹的DNA在细胞浆和细胞核内均可检测到，而△NLS-VLP包裹的DNA只能在细胞浆检测到，不能在细胞核内检测到。VLP体外结合分析发现，wtVLP与胞浆转运因子（impomn）α、β均可结合，而△NLS-VSP与importin α、β不能结合。结论、VP1 NLS对于VLP入核转运是必需的，VLP的入核转运是由VP1 NIS与importin相互作用介导的。

关键词： JC病毒病毒样颗粒入核转运核定位信号

核定位信号肽在超声靶向微泡破坏介导基因转染中的增强效应

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中华超声影像学杂志 2016年第3期25卷 252-257页

作者：曹省周青陈金玲王益佳姜楠邓倾郭瑞强武汉大学人民医院超声影像科 430060

目的利用超声靶向微泡破坏（UTMD）技术联合核定位信号（NLS）肽促进增强型绿色荧光蛋白质粒（pEGFP）入核，提高UTMD介导基因的转染效率。方法实验分3组：UTMD＋pEGFP组（A组）、UTMD＋NLS肽’pEGFP组（B组）和阳离子脂质体Lip03000＋p... 详细信息

目的利用超声靶向微泡破坏（UTMD）技术联合核定位信号（NLS）肽促进增强型绿色荧光蛋白质粒（pEGFP）入核，提高UTMD介导基因的转染效率。方法实验分3组：UTMD＋pEGFP组（A组）、UTMD＋NLS肽’pEGFP组（B组）和阳离子脂质体Lip03000＋pEGFP组（C组）。FITC荧光标记NLS，核酸染料Cy3标记pEGFP，调整NLS肽与pEGFP不同摩尔比，观测两者最佳结合比值。以最佳超声辐照参数及NLS肽／pEGFP摩尔比转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。转染6h后，用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分别评价Cy3标记质粒的入胞率和人核率。转染48h后，用流式细胞仪检测转染效率，CCK8检测细胞存活率，RT—PCR和Western分别检测mRNA和蛋白的相对表达量，并比较三组间的差异以评价NLS肽在UTMD介导基因转染中的增强效应。结果①转染6h后，带绿色荧光的NLS肽和红色荧光的pEGFP均能在细胞同一部位显示且强度信号一致，提示两者相互结合；琼脂糖凝胶电泳示最佳NLS肽／pEGFP结合摩尔比为10^4：1。②转染6h后，A、B、C三组质粒的入胞率分别为（63±12）％、（80±10）％和（92±8）％，入核率分别为（17±3）％、（50±12）％和（35±8）％，差异均有统计学意义（P均〈0．05），B组入胞率和人核率分别为A组的1．3倍和2．9倍，C组分别为A组的1．5倍和2．1倍。③转染48h后，三组细胞活性均80％，转染效率、mRNA和蛋白表达的相对量均依次增加，差异均有统计学意义（P均〈0．05），B组分别为A组1．6倍、2．3倍和2．4倍，但仍低于C组。结论NLS联合UTMD能提高pEGFP入核率，从而提高转染效率，NLS肽发挥增强效应为UTMD介导转染提供新策略。

关键词：超声处理微气泡转染核定位信号

核糖体蛋白L6/Taxreb107的核定位信号的分析

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生物化学与生物物理进展 2002年第1期29卷 144-148页

作者：王冀姝杨曦李荣周鹏张淼丽韩骅第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室西安710032 第四军医大学解剖教研室西安710032

核糖体蛋白L6 (RpL6 ,Taxreb10 7)含有三个具有核定位信号特征的基序 .用作者构建的核定位信号捕获系统分析了这些核定位信号是否具有介导蛋白质进行核转位的功能 .将RpL6 /Taxreb10 7分段插入核定位信号捕获载体的克隆位点后转化宿主酵... 详细信息

核糖体蛋白L6 (RpL6 ,Taxreb10 7)含有三个具有核定位信号特征的基序 .用作者构建的核定位信号捕获系统分析了这些核定位信号是否具有介导蛋白质进行核转位的功能 .将RpL6 /Taxreb10 7分段插入核定位信号捕获载体的克隆位点后转化宿主酵母 ,发现其前两个核定位信号可以介导融合蛋白进入细胞核 ,而第三个核定位信号无此作用 .将RpL6 /Taxreb10 7分段与绿色荧光蛋白融合后转染培养的哺乳类细胞 ,证实了以上在酵母中所得的结果 .进一步发现RpL6 /Taxreb10 7的前两个核定位信号同时具有核仁定位的功能 .当在细胞中表达的早期 ,进入核内的融合蛋白优先定位于核仁 .这些结果一方面有助于理解RpL6 /Taxreb10 7核转位的机理 ,同时说明作者构建的核定位信号捕获系统也可用在蛋白质中寻找核定位信号 .

关键词：核定位信号核糖体蛋白L6 核转位绿色荧光蛋白

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在活细胞上研究核定位信号介导核移位的方法

南方医科大学学报 2012年第8期32卷 1148-1150页

作者：邓鹏龚小卫姜勇南方医科大学病理生理学教研室//广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的建立一种在活细胞上研究核定位信号(NLS)介导核移位机制的新方法。方法利用67 mg/L 3[-(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)处理细胞后,用1 g/L麦胚凝集素(WGA)与细胞孵育,来观察能否阻断干扰素γ(IFN-γ)诱导的信号转导子和... 详细信息

目的建立一种在活细胞上研究核定位信号(NLS)介导核移位机制的新方法。方法利用67 mg/L 3[-(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)处理细胞后,用1 g/L麦胚凝集素(WGA)与细胞孵育,来观察能否阻断干扰素γ(IFN-γ)诱导的信号转导子和转录激活子1(STAT1)移位入核。结果 CHAPS处理细胞后,对于IFN-γ本身诱导的STAT1核移位没有影响,而进一步用WGA处理则阻断了IFN-γ诱导的STAT1核移位。结论利用CHAPS在细胞膜上打孔的方法,建立了一种简单有效的、在活细胞上研究NLS介导核移位机制的新方法。

关键词：核移位核定位信号 CHAPSd~转导

Waardenburg综合征致病蛋白MITF核定位信号的鉴定及其功能研究

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中华医学遗传学杂志 2015年第6期32卷 805-809页

作者：张华冯娟陈红胜李家大罗浑金冯永新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科 830011 上海交通大学医学院附属仁济医院耳鼻咽喉科中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科医学遗传学国家重点实验室

目的对MITF蛋白核定位信号（nuclear localization signals，NLS）进行鉴定并探讨其功能异常在Waardenburg综合征（Waardenburg syndrome，WS）发病中的作用。方法通过分子克隆技术设计突变引物，以野生型真核细胞表达质粒pcMv_MITF_Fla... 详细信息

目的对MITF蛋白核定位信号（nuclear localization signals，NLS）进行鉴定并探讨其功能异常在Waardenburg综合征（Waardenburg syndrome，WS）发病中的作用。方法通过分子克隆技术设计突变引物，以野生型真核细胞表达质粒pcMv_MITF_Flag（MITF）为模板构建突变型真核细胞表达质粒pCMV-MITFANLS-Flag（MITFANLS），并将二者瞬时单转或共转染UACC903细胞进行荧光素酶活性检测，观察其对靶基因酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）转录活性的影响。将MITFNLS核苷酸序列5f_GAAcGAAGAAGAAGATTT＇3’克隆到真核细胞表达质粒pEGFP-N1上，构建重组真核细胞表达质粒pEGFP-N1-MITF-NLS（’pEGFP-N1-NLS）。将MITF、MITF／kNLS、pEGFP-N1和pEGFP-N1-NLS分别瞬时转染NIH3T3细胞后，利用免疫荧光检测对其亚细胞定位进行观察。结果成功构建了MITF／kNLS和pEGFP-N1-NLS的真核细胞表达质粒，前者缺失MITF的NLS核心序列213ERRRRF218，后者则偶联了MITFNLS。与野生型MITF相比，MITF△NLS完全失去了激活TYR启动子作用，并且不影响野生型MITF的正常功能。与野生型MITF仅在细胞核分布相比，MITF△NLS仅在细胞质分布。pEGFP—N1在细胞核与细胞质中均有分布，而pEGFP—N1-NLS主要在细胞核分布。结论验证并明确了213ERRRRF218在MITF蛋白中的NLS核心序列，缺失NLS的MITF突变蛋白出现异常亚细胞定位而失去调控靶基因TYR转录活性功能可导致WS临床表型。

关键词： MITF蛋白 Waardenburg综合征核定位信号