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鸡源SUMO标签蛋白的鉴定及在IBDV VP2原核表达中的促溶功能

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中国兽医学报 2019年第10期39卷 1913-1920页

作者：辛波徐琼李思洁任东兴吕传忠孙阳阳付旭彬黄灿平鲍恩东南京农业大学动物医学院江苏南京210095 天津瑞普生物技术股份有限公司研究院天津300308 天津农学院动物科学与动物医学学院天津300384

VP2蛋白是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的保护性抗原。原核表达中能否获得具有天然构象的可溶性VP2蛋白是研发IBD亚单位疫苗的关键问题。为了解是否存在鸡自体促溶标签蛋白以及外源促溶标签能否在一定程... 详细信息

VP2蛋白是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的保护性抗原。原核表达中能否获得具有天然构象的可溶性VP2蛋白是研发IBD亚单位疫苗的关键问题。为了解是否存在鸡自体促溶标签蛋白以及外源促溶标签能否在一定程度上促进蛋白的正确折叠,试验对不同物种来源的类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier,SUMO)进行比对研究。结果显示,获取到的3种鸡源SUMO蛋白与酵母源SUMO蛋白的氨基酸同源性均高于40%,其中SUMO-1与SUMO-3两种蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达;通过SUMO-1、SUMO-3与VP2蛋白的融合表达,证明了鸡源SUMO蛋白对VP2具有促溶效果,得到的重组菌株P-28A-s1-VP2和P-28A-Os3-VP2琼脂扩散效价均达到1∶16;经过纯化后,融合蛋白SUMO-1-VP2的琼脂扩散效价可达到1∶256;使用SUMO蛋白酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果表明鸡源SUMO蛋白可以被成功切割,说明试验发现的鸡源SUMO蛋白可以作为促溶标签,在亚单位疫苗关键抗原表达中具有广阔的应用前景。

关键词：鸡源SUMO蛋白 IBDV VP2 标签蛋白融合表达

Spycatcher作为一种新的促溶标签蛋白的研究

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Spycatcher作为一种新的促溶标签蛋白的研究

作者：王锟南华大学

学位级别：硕士

【目的】探究Spycatcher可作为一种新的促溶标签蛋白。【方法】1.通过分子生物学方法将Spycatcher基因与包涵体PD-1(细胞程序化死亡受体-1)、MPD-1(细胞程序化死亡受体-1突变体)、FTH-PD-1(铁蛋白重链偶联PD-1)基因融合构建到表达载体PE... 详细信息

【目的】探究Spycatcher可作为一种新的促溶标签蛋白。【方法】1.通过分子生物学方法将Spycatcher基因与包涵体PD-1(细胞程序化死亡受体-1)、MPD-1(细胞程序化死亡受体-1突变体)、FTH-PD-1(铁蛋白重链偶联PD-1)基因融合构建到表达载体PET21a中。2.将构建好的PET21a-Spycatcher-PD-1、PET21a-Spycatcher-MPD-1、PET21a-sp-ycatcher-FTH-MPD-1质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,然后通过超声破碎将裂解的细胞上清进行镍柱纯化。3.运用E LISA定性检测Spycatcher-MPD-1与其配体PD-L1的结合。先将PD-L1包被在ELISA板上,实验组和对照组分别用HRP标记的Spycatc her-MPD-1和PBS孵育,在OD450条件下用酶标仪检测其吸光度值;然后将PD-L1蛋白进行生物素化标记,用fortebio法定量检测融合蛋白与PD-L1结合力的大小,同时检测在不同p H条件下Spycatcher-M PD-1与PD-L1的结合力。4.用荧光素CY5.5标记融合蛋白PET21a-S pycatcher-PD-1、PET21a-Spycatcher-MPD-1后,在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察其与乳腺癌细胞MDA-231表面高表达的PD-L1结合情况。5.随后,在已经纯化的融合蛋白溶液中加入适量的凝血酶,再经过镍柱纯化尝试得到不带Spycatcher标签的单体蛋白。【结果】1.测序结果表明构建的质粒目的基因核酸序列无误;2.通过镍柱表达纯化蛋白,纯度较高,可达85%以上;***结果显示,实验sOD值明显高于对照组,提示实验组中Spycatcher-MPD-1和PD-L1的结合力强于空白对照组(P标签蛋白的单体蛋白。【结论】Spycatcher可以作为一种促溶标签蛋白。

关键词： Spycatcher PD-1 PD-L1 标签蛋白

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重组标签蛋白在蛋白质纯化中的研究进展

现代生物医学进展 2014年第32期14卷 6372-6378,6359页

作者：崔超呼延霆尹大川西北工业大学生命学院空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室陕西西安710072

重组蛋白的表达纯化是研究蛋白质结构与功能的重要环节之一,表达重组蛋白宿主细胞的监测筛选和重组蛋白低水平可溶性表达、低回收率以及不稳定易水解等问题一直是蛋白质高通量纯化工艺中的难题。近年来,将多肽或蛋白质作为标签,与目标... 详细信息

重组蛋白的表达纯化是研究蛋白质结构与功能的重要环节之一,表达重组蛋白宿主细胞的监测筛选和重组蛋白低水平可溶性表达、低回收率以及不稳定易水解等问题一直是蛋白质高通量纯化工艺中的难题。近年来,将多肽或蛋白质作为标签,与目标蛋白共表达的方法已经很大程度地解决了这一问题。因此,针对不同特性的蛋白质选择合适的标签纯化策略在重组蛋白纯化研究中是相当关键的环节。本文回顾了几种传统标签蛋白的研究概况(His-tag,Arg-tag,Flag-tag,GST-tag,MBP-tag等),着重对近年来新开发的了几种标签蛋白(Si-tag,Halo-tag,Intein-CBD-tag,ELPs-tag等)进行了深入探讨,并对新标签蛋白在蛋白质纯化中的应用前景作以展望。

关键词：重组蛋白标签蛋白 Si-tag Halo-tag Intein-CBD-tag ELPs-tag

HA/Myc/Flag-Smads系列系列标签蛋白融合蛋白表达质粒的构建及其应用

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HA/Myc/Flag-Smads系列系列标签蛋白融合蛋白表达质粒的构建及其...

HA/Myc/Flag-TGF-β受体系列标签蛋白融合蛋白表达质粒的构建及其应用

第十五届全国泌尿外科学术会议

作者：李伟王惠强邢金春福建医科大学附属厦门第一医院泌尿外科暨厦门市泌尿系统疾病诊治中心

目的:构建HA/Myc/Flag-Smads系列标签蛋白融合蛋白表达质粒。方法:应用PCR技术,酶切技术,蛋白印迹技术构建HA/Myc/Flag-Smad2,Smad3,Smad4,Smad7等不同标签融合蛋白真核表达质粒并检测其表达。结果:从原始质粒中用PCR克隆技术克隆出全长... 详细信息

目的:构建HA/Myc/Flag-Smads系列标签蛋白融合蛋白表达质粒。方法:应用PCR技术,酶切技术,蛋白印迹技术构建HA/Myc/Flag-Smad2,Smad3,Smad4,Smad7等不同标签融合蛋白真核表达质粒并检测其表达。结果:从原始质粒中用PCR克隆技术克隆出全长Smad2,Smad3,Smad4,Smad7基因,在引物中加入酶切位点,

关键词： Smad2 Smad3 Smad4 Smad7 标签蛋白融合蛋白真核表达质粒

来源： cnki会议评论

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HA/Myc/Flag-TGF-β受体系列标签蛋白融合蛋白表达质粒的构建及其...

Spycatcher作为一种新的高效促溶标签蛋白的探讨

第十五届全国泌尿外科学术会议

作者：李伟王惠强邢金春福建医科大学附属厦门第一医院泌尿外科暨厦门市泌尿系统疾病诊治中心

目的:构建HA/Myc/Flag-TGF-β受体系列标签蛋白融合蛋白表达质粒。方法:应用PCR技术,酶切技术,蛋白印迹技术构建HA/Myc/Flag-TGF-β受体系列等不同标签融合蛋白真核表达质粒并检测其表达。结果:从原始质粒中用PCR克隆技术克隆出全长TGF... 详细信息

目的:构建HA/Myc/Flag-TGF-β受体系列标签蛋白融合蛋白表达质粒。方法:应用PCR技术,酶切技术,蛋白印迹技术构建HA/Myc/Flag-TGF-β受体系列等不同标签融合蛋白真核表达质粒并检测其表达。结果:从原始质粒中用PCR克隆技术克隆出全长TGF-β受体I型和II型基因,在引物中加入酶切位点,基因全长PCR

关键词： TGF-β受体I型 TGF-β受体II型标签蛋白融合蛋白真核表达质粒

来源： cnki会议评论

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解剖科学进展 2017年第4期23卷 356-359页

作者：王锟李日飞何伟国谢远杰石金凤谭思杰莫中成李美香南华大学医学院组织胚胎学教研室湖南衡阳421001 南华大学医学院细胞与组织工程研究室湖南衡阳421001 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

目的探究spycatcher可作为一种新的高效促溶标签蛋白。方法通过分子生物学方法将spycatcher基因与包涵体PD1及MPD1基因融合构建到表达载体PET21a中,然后通过ELISA和fortebio验证其融合蛋白活性。结果 spycatcher与包涵体靶蛋白PD1及MPD... 详细信息

目的探究spycatcher可作为一种新的高效促溶标签蛋白。方法通过分子生物学方法将spycatcher基因与包涵体PD1及MPD1基因融合构建到表达载体PET21a中,然后通过ELISA和fortebio验证其融合蛋白活性。结果 spycatcher与包涵体靶蛋白PD1及MPD1融合后为可溶性表达,融合蛋白纯化后能够与其配体PDL1有效结合。结论 Spycatcher可作为一种新的高效促溶标签蛋白,这将为不可溶表达蛋白的表达纯化带来诸多便利。

关键词： spycatcher 标签蛋白 PD1 PDL1

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白植物表达载体的构建

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安徽农业科学 2011年第34期39卷 20949-20950,21006页

作者：申宇欢陈艳红南通大学生命科学学院江苏南通226019

[目的]研究MYB类基因At3g11280和At5g05790的详尽功能。[方法]利用农杆菌将标签蛋白融合的At3g11280和At5g05790基因转化拟南芥,利用转基因植株中标签蛋白的抗体进行染色体免疫共沉淀(ChIP)试验,挖掘两基因所调控的下游基因。[结果]首... 详细信息

[目的]研究MYB类基因At3g11280和At5g05790的详尽功能。[方法]利用农杆菌将标签蛋白融合的At3g11280和At5g05790基因转化拟南芥,利用转基因植株中标签蛋白的抗体进行染色体免疫共沉淀(ChIP)试验,挖掘两基因所调控的下游基因。[结果]首先扩增了At3g11280和At5g05790基因的CDS片段,随后经过一系列的亚克隆过程将两个基因和标签蛋白的融合基因片段克隆到载体pWM101上,位于35S启动子的下游,转录受35S启动子的调控。[结论]成功地构建了标签融合蛋白植物表达载体,两个基因分别携带HA和Flag标签,载体的成功构建将为ChIP试验奠定基础。

关键词： MYB基因标签蛋白载体构建

基于抗独特型纳米抗体的伏马菌素B1绿色免疫层析试纸条构建

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基于抗独特型纳米抗体的伏马菌素B1绿色免疫层析试纸条构建

作者：夏裕恒南昌大学

学位级别：硕士

伏马菌素B1（Fumonisin B1,FB1）主要是由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）产生具有高毒性、致癌性的次级代谢产物,会对人体造成较大伤害。因此,建立FB1快速检测和监控技术具有重要意义。抗独特型纳米抗体（anti-idiotypic nanobody,... 详细信息

伏马菌素B1（Fumonisin B1,FB1）主要是由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）产生具有高毒性、致癌性的次级代谢产物,会对人体造成较大伤害。因此,建立FB1快速检测和监控技术具有重要意义。抗独特型纳米抗体（anti-idiotypic nanobody,AId Nb）具备制备简单、性质稳定等优势,可作为免疫分析中化学合成完全抗原替代物,不仅无需复杂、低效的化学合成完全抗原过程,同时能减少检测过程中高毒完全抗原的使用,可为真菌毒素免疫学检测技术提供无污染、绿色、批次稳定、价格低廉的核心元件。本研究以实验室前期研制的FB1抗独特型纳米抗体（B26）为对象,主要研究内容如下:1)将B26蛋白分别与五种标签蛋白（MBP、GST、SUMO、TrxA、SF-tag）通过柔性连接肽（GS）和半刚性连接肽（EK）进行融合表达,获得十种B26融合标签蛋白。研究表明,MBP融合表达蛋白与FB1单克隆抗体（FB1Monoclonal antibody,FB1-mAb）结合能力最强,SF-tag融合表达蛋白检测灵敏度最佳,TrxA融合表达蛋白热稳定性最佳（较B26蛋白提高约10℃）。此外,GS融合蛋白与FB1-mAb的结合活性较EK融合蛋白高2～3倍,且具有较高的结构稳定性。结果表明融合标签对于B26的免疫分析性能具有调节作用。2)基于SpyTag/SpyCatcher自连接体系,根据不同连接方式设计了四种融合蛋白,并以此构建四种双价FB1抗独特型纳米抗体。所构建的八种蛋白均与FB1-mAb具有良好的结合能力,研究结果表明SpyTag/SpyCatcher蛋白的N端构建策略可有效提高检测灵敏度。此外,基于小鼠IgG1 Fc片段构建的B26-小鼠IgG1 Fc融合蛋白提升了其作为捕获抗原在固相载体上的免疫性能,约2.5倍。3)基于膜载体固定能力最强的MBP-GS-B26蛋白作为捕获抗原,建立胶体金定性试纸条和时间分辨荧光定量试纸条。胶体金层析试纸条对小麦、玉米样本中的FB1定性检测限为800μg/kg,裸眼检出时间为6 min。时间分辨荧光层析试纸条能够在10 min内定量检测小麦和玉米样本中的FB1含量,检出限分别为36.063和42.687μg/kg,线性范围均为25～400μg/kg。加标实验和保存稳定性测试结果表明两类层析试纸条均具有良好的准确度,室温下至少能够保存6月。

关键词：伏马菌素B1 抗独特型纳米抗体标签蛋白双价免疫层析试纸条

Gibson Assembly系统构建双标签原核类泛素蛋白表达载体

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国际呼吸杂志 2018年第6期38卷 435-440页

作者：张雨晴刘毅张旭霞李传友首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所耐药结核病重点实验室细菌免疫室 101149

目的体外构建表达原核类泛素蛋白（prokaryoticubiquitin-likeprotein,Pup）的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础,为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸（his6）和链霉素（strep）标签的Pup蛋白表达载体,为后续研究Pup-... 详细信息

目的体外构建表达原核类泛素蛋白（prokaryoticubiquitin-likeprotein,Pup）的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础,为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸（his6）和链霉素（strep）标签的Pup蛋白表达载体,为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础。方法设计合成his6-strep片段,扩增富集his6-strep片段,从结核分枝杆菌 H37Rv基因组扩增Pup片段;应用GibsonAssembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和Pup片段依次连接到载体上,构建带双标签的原核表达载体 pET28a-his6-strep-Pup和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261-his6-strep-Pup表达载体,经酶切和聚合酶链反应验证,分别导入大肠杆菌（***）和耻垢分枝杆菌（***）中,鉴定和测序获得正确单克隆菌株。培养富集菌株,超声破碎离心收集上清和沉淀,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳,用免疫印迹法（Westernblot）验证标签蛋白在***和***中的表达。结果经聚合酶链反应鉴定及测序,证实成功构建了双标签Pup表达载体并导入目的菌株,诱导后蛋白表达,Westernblot结果表明标签蛋白在***和***中均可得到正确表达,在***中可发现多种靶蛋白被Pup化结合。结论快速高效地构建了表达his6-strep-Pup蛋白的双标签重组载体,可以应用于后续Pup的表达纯化及Pup化蛋白的功能分析,为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础。

关键词：印迹法蛋白质 Gibson Assembly 同源重组标签蛋白原核类泛素蛋白