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转豇豆胰蛋白酶CPTI基因棉花检测用标准分子的制备

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中国生物工程杂志 2011年第8期31卷 85-91页

作者：王旭静董雷苗猛猛唐巧玲王志兴中国农业科学院生物技术研究所北京100081

利用PCR的方法克隆豇豆胰蛋白酶基因CPTI、基因表达调控元件35S启动子、NOS终止子以及棉花内标基因Sad1,连接到克隆载体上,构建成质粒标准分子pGB。PCR检测过程中,质粒标准分子和转基因棉花中能扩增出4个目的条带,而非转基因棉花中不能... 详细信息

利用PCR的方法克隆豇豆胰蛋白酶基因CPTI、基因表达调控元件35S启动子、NOS终止子以及棉花内标基因Sad1,连接到克隆载体上,构建成质粒标准分子pGB。PCR检测过程中,质粒标准分子和转基因棉花中能扩增出4个目的条带,而非转基因棉花中不能扩增出相应的条带,证明构建好的质粒标准分子能用于转基因棉花的定性检测。荧光定量PCR绘制4个目的基因片段的标准曲线,各标准曲线的相关系数均达到0.985以上,说明建立的PCR具有很好的Ct值-初始浓度相关性,达到定量分析的需求,而且荧光定量PCR反应具有很好的重复性和稳定性,可用于实际样品的定量检测。

关键词：标准分子转基因棉花定性检测定量检测

转cry1Ab基因棉花质粒标准分子的构建与分析

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中国生物防治学报 2013年第2期29卷 277-285页

作者：金荣愉崔海峰俞晓平叶子弘中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室杭州310018

为缓解转基因检测用标准品严重缺乏的现状,本研究构建了含转基因棉花cry1Ab基因序列及棉花fsACP(fiber-specific acyl carrier protein)内标基因序列的质粒标准分子,经PCR、酶切、测序等方法的验证,证明了所构建质粒的正确性。利用荧光... 详细信息

为缓解转基因检测用标准品严重缺乏的现状,本研究构建了含转基因棉花cry1Ab基因序列及棉花fsACP(fiber-specific acyl carrier protein)内标基因序列的质粒标准分子,经PCR、酶切、测序等方法的验证,证明了所构建质粒的正确性。利用荧光定量PCR技术系统地分析了所建质粒的重复性、特异性、均匀性、均一性和不同温度下处理不同时间的质粒标准分子的稳定性。结果表明,所构建质粒的重复性、特异性、均匀性及均一性良好,质粒溶液在低温条件(70℃、20℃和4℃)下可稳定储存6个月,且具有稳定的质粒量值,不宜高温(20℃和40℃)保存。本研究为质粒标准分子的制备、性状分析及保存环境等相关研究提供了试验依据。

关键词：转cry1Ab基因棉花质粒标准分子稳定性均匀性

小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌检测标准分子构建

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微生物学通报 2010年第10期37卷 1541-1547页

作者：李小焦王中康章桂明陈枝楠殷幼平程颖慧王颖向才玉缪建锟重庆大学生物工程学院重庆市功能基因及调控技术重点实验室重庆400030 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心广东深圳518045 深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室广东深圳518045 中国农业大学北京100094

以小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌为研究对象,采用分子克隆技术,分别构建了该两种真菌分子检测的标准分子。前者包括线粒体2297 bp的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列,后者包括线粒体2.3kb的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列。分别... 详细信息

以小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌为研究对象,采用分子克隆技术,分别构建了该两种真菌分子检测的标准分子。前者包括线粒体2297 bp的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列,后者包括线粒体2.3kb的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列。分别对该两个标准分子进行了性能评估试验,测试结果显示所构建的标准分子具有良好的特异性、均匀性和稳定性,能够满足小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌分子检测需求。

关键词：克隆分子检测标准分子

转OsDREB3基因大豆外源基因拷贝数的确定及标准分子的构建

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甘肃农业大学学报 2015年第3期50卷 61-67页

作者：孙喆刘营张明辉李璐高学军农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心(哈尔滨) 东北农业大学农业生物功能基因重点实验室黑龙江哈尔滨150030

为建立抗逆转OsDREB3基因大豆快速稳定的品系特异性检测方法,本试验通过实时Real-time PCR方法,以大豆凝集素基因(lectin)作为内源参照基因,确定了外源基因OsDREB3在转OsDREB3基因大豆基因组中的拷贝数为单拷贝,为建立快速、有效的品系... 详细信息

为建立抗逆转OsDREB3基因大豆快速稳定的品系特异性检测方法,本试验通过实时Real-time PCR方法,以大豆凝集素基因(lectin)作为内源参照基因,确定了外源基因OsDREB3在转OsDREB3基因大豆基因组中的拷贝数为单拷贝,为建立快速、有效的品系特异性检测方法奠定基础.同时,在原有构建的含4种转基因大豆品系特异性序列的标准分子载体上又增加了转OsDREB3基因大豆品系特异性序列,新构建了含有5种转基因大豆品系特异性序列的标准分子及大豆内参照基因(lectin),已完全满足对现有国内覆盖面最大的5种转基因大豆同时、快速筛查检测工作的需要.

关键词：转OsDREB3基因大豆外源基因拷贝数标准分子

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转基因水稻华恢1号检测用质粒标准分子研制

生物技术通报 2013年第1期29卷 96-101页

作者：李亮王晶臧超隋志伟赵正宜中国计量科学研究院北京100013

质粒标准分子作为阳性标准品已广泛用于转基因作物及产品的核酸定量检测。但是目前多数质粒标准分子只用于研究,未能成为国家级标准物质。因此,按照国家一级标准物质技术规范,研制了用于检测转基因水稻华恢1号的质粒标准分子,内容包括... 详细信息

质粒标准分子作为阳性标准品已广泛用于转基因作物及产品的核酸定量检测。但是目前多数质粒标准分子只用于研究,未能成为国家级标准物质。因此,按照国家一级标准物质技术规范,研制了用于检测转基因水稻华恢1号的质粒标准分子,内容包括质粒分子的构建、纯度分析、特异性检测、可替代性研究、均匀性检验、稳定性考察、定值与不确定度评估。结果表明,该质粒分子标准物质半年内稳定,可替代基因组作为华恢1号定量的阳性标准。

关键词：华恢1号转基因水稻实时荧光定量PCR 标准分子

适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子构建及其适用性鉴定

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生物技术通报 2011年第4期27卷 76-83页

作者：李俊毅李想褚庆华吕蓉张舒亚潘良文黄新朱水芳华东理工大学生物工程学院上海200237 上海出入境检验检疫局上海200135 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所北京100029

针对目前转基因产品检测标准物质缺乏的难题,构建适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子pEASY-RT73,其包含转基因油菜RT73品系3'端侧翼序列,油菜内标准基因HMG和PEP片段。对其在定性和定量检测中的适用性进行了实验室内部验证,结... 详细信息

针对目前转基因产品检测标准物质缺乏的难题,构建适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子pEASY-RT73,其包含转基因油菜RT73品系3'端侧翼序列,油菜内标准基因HMG和PEP片段。对其在定性和定量检测中的适用性进行了实验室内部验证,结果表明,标准分子pEASY-RT73高度特异于转基因油菜RT73品系。以标准分子为标准品的普通PCR扩增中,3个目标片段的检测下限(LOD)均为10拷贝。实时荧光PCR检测的LOD均为25拷贝,定量下限(LOQ)均为50拷贝。以标准分子为标准品构建的标准曲线反应效率介于0.96-1.02间,相关系数均大于0.999。分别以PEP和HMG为内标准基因对5个盲样的测试结果显示,测量值与设定值间偏差(Bias)介于-14.13%-14.29%间,SD小于0.20,RSD小于18.0%。因此,标准分子pEASY-RT73可很好地替代植物来源阳性标准品用于转基因油菜RT73及其来源产品品系特异性检测。

关键词： PCR RT73 标准分子品系特异性检测实时荧光PCR

转Bt基因棉花及水稻检测用质粒标准分子的构建、定值与分析

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转Bt基因棉花及水稻检测用质粒标准分子的构建、定值与分析

作者：金荣愉中国计量学院

学位级别：硕士

自转基因作物研制成功以来，转基因产业飞速发展，由转基因产品引起的安全性问题备受瞩目，转基因检测技术及其标准物质的研究日显重要。为缓解转基因检测用标准品严重缺乏的现状，本研究通过分析转基因作物的分子特征，选取启动子CaMV... 详细信息

自转基因作物研制成功以来，转基因产业飞速发展，由转基因产品引起的安全性问题备受瞩目，转基因检测技术及其标准物质的研究日显重要。为缓解转基因检测用标准品严重缺乏的现状，本研究通过分析转基因作物的分子特征，选取启动子CaMV35S、终止子NOS、标记基因NPTII、水稻内标基因SPS、棉花内标基因fsACP及抗虫基因cry1Ab作为靶标序列，并克隆到pEASY-T3载体上，构建了含cry1Ab、fsACP及含cry1Ab、SPS、fsACP、35S、NOS和NPTII的质粒标准分子。并采用PCR鉴定、酶切、测序等方法验证了所构建质粒的正确性。本研究所构建的质粒标准分子可用于定量转基因水稻及转基因棉花的转基因成分含量，亦可用于检测含cry1Ab、35S、NOS、NPTII的转基因材料。本文中的质粒构建、制备、正确性验证方法可为转基因检测用质粒标准分子的研制提供参照。针对质粒标准分子的定值方法不统一的现状，本文比较了紫外分光光度法、 PicoGreen试剂盒法及数字PCR法对质粒标准分子的定值结果。结果表明：数字PCR法对质粒标准分子的定量准确度最高，PicoGreen试剂盒法次之，紫外分光光度法定量准确性较差。本研究优化了转基因检测的PCR及荧光定量PCR体系，分析了质粒标准分子的可替代性，并以Cq值为特性量值对质粒标准分子的重复性、均匀性、均一性、稳定性及特异性进行了检测。结果表明：1）、本文所采用的转基因检测的序列具有良好的序列特异性，所使用的引物及探针亦具有较好的特异性;2）、所构建质粒标准分子的均匀性、均一性及实验重复性均十分良好，符合标准物质候选物的要求;3）、所制备的质粒标准分子溶液可在低温条件（-70℃、-20℃、4℃）下稳定储存3个月以上，不宜高温（20℃和40℃）保存或运输;4）、含较短插入片段的质粒标准分子的稳定性高于含较长插入片段的质粒标准分子;5）、质粒标准分子可较好地替代基因组DNA作为转基因检测用标准品。本研究的重复性、均匀性、均一性、稳定性及可替代性等的分析结果可为质粒标准分子申报国家标准物质提供实验依据，可为质粒标准分子的性状分析及保存环境等相关研究提供实验依据。质粒标准分子的检测灵敏度实验结果表明：本研究的普通PCR体系检测限为50copies/μL，可检测转基因成分含量为0.5%的转基因材料;本研究的qPCR体系检测限为10copies/μL，可检测转基因成分含量为0.5%的转基因材料。转基因成分含量检测的灵敏度达到了各国家最低检测阈值（0.9%）的要求。

关键词：转基因技术质粒标准分子标准物质稳定性均匀性核酸定量

基于锁核酸技术转基因棉花多重PCR定量检测方法的研究以及标准分子的研制和验证

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基于锁核酸技术转基因棉花多重PCR定量检测方法的研究以及标准分...

作者：汪秀秀华东理工大学

学位级别：硕士

在本研究中,针对目前未获得我国农业部《转基因生物安全证书(进口)》的转基因棉花品系GHB119和T304-40,在基于锁核酸(LNA)技术的基础上建立了同时定量检测转基因棉花品系GHB119、T304-40、棉花内源酰基载体蛋白1基因(ACPl)以及GHB119插... 详细信息

在本研究中,针对目前未获得我国农业部《转基因生物安全证书(进口)》的转基因棉花品系GHB119和T304-40,在基于锁核酸(LNA)技术的基础上建立了同时定量检测转基因棉花品系GHB119、T304-40、棉花内源酰基载体蛋白1基因(ACPl)以及GHB119插入的外源抗虫基因Cry2Ae的实时荧光四重PCR方法。并以单重实时荧光PCR作对照,对建立的实时荧光四重PCR定量检测方法进行了测试。测试结果表明,该方法高度特异于转基因棉花品系GHB119和T304-40以及外源抗虫基因Cry2Ae;三个目标片段的检测下限(LOD)均低于25拷贝品系基因组DNA;定量下限(LOQ)均低于50拷贝的品系基因组DNA。同时,在此基础上本研究构建了适用于10种转基因棉花(MON531281-24-236、3006-210-2、MON15985、GBH614、MON1445、GHB119、LLcotton25、 MON88913和T304-40)品系特异性检测的质粒标准分子pUC57,并对其作为阳性标准物质在实时荧光PCR检测中的适用性进行了本实验室内部的验证。验证结果显示,构建的质粒标准分子pUC57可以替代常规基质标准物质用于对转基因棉花实时荧光PCR定性和定量检测分析。另外,本研究还采用数字PCR技术(ddPCR)针对已构建完成的适用于转基因油菜品系RT73的品系特异性检测的质粒标准分子pEASY-RT73中的3个目标片段进行了进一步的片段定值测试,并对引物和探针进行了筛选和优化,增强了pEASY-RT73质粒标准分子作为阳性物质定量检测转基因油菜品系RT73成分的可靠性和稳定性。

关键词：转基因棉花多重实时荧光定量PCR 标准分子数字PCR 片段定值

转基因油菜品系特异性检测方法研究及其标准分子研制

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转基因油菜品系特异性检测方法研究及其标准分子研制

作者：李俊毅华东理工大学

学位级别：硕士

本研究对我国进口油菜籽进行转基因成分检测并分析了各品系组成情况,结果显示,我国农业部颁发农业转基因生物安全生产证书的七个转基因油菜品系(RT73、MS8×RF3、MS1×RF1、MS1×RF2、T45、Oxy235和Topas19/2品系)均有进口,其中以RT73和... 详细信息

本研究对我国进口油菜籽进行转基因成分检测并分析了各品系组成情况,结果显示,我国农业部颁发农业转基因生物安全生产证书的七个转基因油菜品系(RT73、MS8×RF3、MS1×RF1、MS1×RF2、T45、Oxy235和Topas19/2品系)均有进口,其中以RT73和MS8×RF3品系为主。本研究构建了适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子pEASY-RT73和适于七种转基因油菜品系特异性检测的通用标准分子pCanola9,对其在定性和定量检测中的适用性进行了实验室内部验证。结果表明两种标准分子具有高特异性;在普通PCR扩增中,检测下限(LOD)均低于20拷贝;在实时荧光PCR扩增中,检测下限均低于25拷贝;定量下限(LOQ)均低于为50拷贝。针对以上体系制作的标准曲线具有很好线性关系和较高反应效率。基于此,本研究进一步对标准分子进行可重复性、均匀性、热稳定性和盲样测试。建立了适用于转基因油菜品系特异性检测的方法,研制成功的标准分子可很好的替代植物来源阳性标准品用于转基因油菜及其来源产品品系特异性检测,并为解决转基因产品检测标准物质缺乏的难题提供有力的技术支持。

关键词：转基因油菜标准物质标准分子品系特异性实时荧光PCR