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2009年云南省柯萨奇病毒b3型分离株A103／KM／09全基因序列分析

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中华流行病学杂志 2013年第12期34卷 1208-1212页

作者：杨卉娟刘建生张云昆马忠飞赵卫中潘玥陈俊英邵聪文马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒b3型分离株A103／KM／09全基因序列，了解其遗传特性。方法设计针对柯萨奇病毒b3型引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．05软件... 详细信息

目的分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒b3型分离株A103／KM／09全基因序列，了解其遗传特性。方法设计针对柯萨奇病毒b3型引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．05软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及其系统进化分析，应用RDP3和SimPlot3．5．1重组软件对序列进行重组分析。结果该分离株全基因组核苷酸序列长度为7389bp。其核苷酸和氨基酸序列与其原型株Nancy的同源性分别为81．0％和95．7％；与其他柯萨奇病毒b3型毒株的各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为81．0％～88．0％和95．7％～98．0％；进化分析发现CVb3可分为5个分支（I～V），核苷酸之间的差异为16．2％-24．3％；中国分离株属V分支，又可分为A～D亚分支，核苷酸之间的差异为4．3％～11．4％。并发现A103／KM／09株基因序列在非结构区可能存在重组事件。结论柯萨奇病毒b3型分为5个基因型，云南分离株A103／KM／09属于V—D亚型，而中国分离株已经发生一定进化。

关键词：柯萨奇病毒b3型全基因序列序列分析

柯萨奇病毒b3型诱导的免疫偏离与心肌炎发病关系的研究

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微生物与感染 2007年第1期2卷 7-12,50页

作者：蒋正刚徐薇王缨岳艳徐林李宝华熊思东复旦大学免疫生物研究所

目的研究2种近交系小鼠在柯萨奇病毒b3型(CVb3)感染后辅助性T细胞(Th)免疫偏离对心肌炎发病的影响。方法用CVb3腹腔感染bALb/c和C57bL/62种近交系小鼠,感染后7d通过检测小鼠血清肌酸激酶(CK)活性,观察心脏外观变化以及心脏石蜡切片H.E... 详细信息

目的研究2种近交系小鼠在柯萨奇病毒b3型(CVb3)感染后辅助性T细胞(Th)免疫偏离对心肌炎发病的影响。方法用CVb3腹腔感染bALb/c和C57bL/62种近交系小鼠,感染后7d通过检测小鼠血清肌酸激酶(CK)活性,观察心脏外观变化以及心脏石蜡切片H.E染色观察心脏病理改变,比较2种小鼠心肌炎的发病情况;通过体外感染心肌细胞观察病毒复制情况以及体内心脏组织病毒载量的分析,比较2种小鼠对病毒感染和复制的差异;通过检测感染小鼠细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、IL-12和γ干扰素(IFN-γ)的表达,抗CVb3VP1抗体的亚型以及T-bet和Gata-3的表达,比较2种小鼠Th免疫偏离的情况。结果CVb3在体外和体内都可以感染bALb/c和C57bL/6小鼠心肌细胞,但仅bALb/c小鼠感染后可发生明显的病毒性心肌炎,C57bL/6小鼠则不能;bALb/c小鼠感染后表现为Th1型免疫反应而C57bL/6小鼠则偏向于Th2型免疫反应。结论CVb3感染2种品系小鼠表现为不同的心肌炎发生率,与其诱导了不同类型的免疫偏离密切相关。

关键词：柯萨奇病毒b3型病毒性心肌炎免疫偏离

柯萨奇病毒b3型感染引起HeLa细胞内源性小干扰RNA的变化

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微生物与感染 2020年第2期15卷 98-103页

作者：姚海兰宋娟王欣玲王瑞芳宋芹芹史冰田韩俊首都儿科研究所生物化学与免疫室北京100020 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206

探究柯萨奇病毒b3型(Coxsackie virus type b3,CVb3)感染的细胞是否诱导内源性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的产生。以CVb3接种HeLa细胞,在细胞培养箱(5%CO 2、37℃)孵育1 h。随后加入含2%血清的细胞维持液,继续培养3 h和6 ... 详细信息

探究柯萨奇病毒b3型(Coxsackie virus type b3,CVb3)感染的细胞是否诱导内源性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的产生。以CVb3接种HeLa细胞,在细胞培养箱(5%CO 2、37℃)孵育1 h。随后加入含2%血清的细胞维持液,继续培养3 h和6 h后收集细胞。用高通量测序(二代测序)试剂盒提取细胞RNA,并反转录合成cDNA,构建文库,上机测序。过滤数据,去除插入片段过长的序列、低质量序列、poly A序列和小片段序列,与已知的小RNA数据库比对鉴定siRNA。通过茎-环反转录-聚合酶链反应,证实内源性siRNA在感染CVb3后的表达。结果显示,感染CVb33 h和6 h后,HeLa细胞产生了多种内源性siRNA。其中内源性siRNA(novel_sir3502和novel_sir2806)在感染后3 h和6 h均可持续表达。经比对,novel_sir3502和novel_sir2806均可以识别45S和28S核糖体前体RNA。结果提示,CVb3感染可能干扰核糖体成熟。

关键词：柯萨奇病毒b3型 HeLa细胞内源性小干扰RNA

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柯萨奇病毒b3型3D蛋白抗体的制备

微生物与感染 2017年第3期12卷 172-178页

作者：王玉徐维祯穆宇松王天楹闫碧莹颜学勤赵文然钟照华哈尔滨医科大学微生物学教研室及伍连德研究所哈尔滨150081 哈尔滨医科大学细胞生物学教研室哈尔滨150081

肠道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶。柯萨奇病毒b3型(coxsackievirus b3,CVb3)主要感染心脏,其3D蛋白在心肌表达中的时序和分布尚不清楚。本研究将通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的CVb 3D片段插入pET28a(+)的表达框,获... 详细信息

肠道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶。柯萨奇病毒b3型(coxsackievirus b3,CVb3)主要感染心脏,其3D蛋白在心肌表达中的时序和分布尚不清楚。本研究将通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的CVb 3D片段插入pET28a(+)的表达框,获得pET28a(+)-3D重组质粒。异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导pET28a(+)-3D表达3D-His蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,切胶,获得3D-His蛋白。3D-His蛋白加佐剂免疫新西兰大白兔制备3D蛋白多克隆抗体,蛋白免疫印迹法检测抗体效价及特异性。结果显示,本研究获得了高效价且特异性好的抗CVb3 3D蛋白抗体,可用于CVb3 3D蛋白功能的后续研究。

关键词：柯萨奇病毒b3型 3D聚合酶抗体原核表达

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大黄抗柯萨奇病毒b3型有效成份的筛选

大黄抗柯萨奇病毒B3型有效成份的筛选

作者：孙慧武汉大学

学位级别：硕士

目的:将不同产地的中药大黄(大黄a和大黄b)分别用不同的方法提取分离各自的活性成分,再筛选这些药物成分抗柯萨奇病毒b3的有效成分,并观察其抗病毒效果。方法:将大黄a用4种方法分离提取:方法1、方法2、方法3和方法4;大黄 b用3种方法... 详细信息

目的:将不同产地的中药大黄(大黄a和大黄b)分别用不同的方法提取分离各自的活性成分,再筛选这些药物成分抗柯萨奇病毒b3的有效成分,并观察其抗病毒效果。方法:将大黄a用4种方法分离提取:方法1、方法2、方法3和方法4;大黄 b用3种方法分离提取:方法1、方法2和方法4;分离提取后,中药大黄a和b共分离得到35种成份。药效学实验部分主要通过观察病毒所致的特异性细胞病变效应和 MTT染色法,观察药物成分加入细胞后对细胞的毒性作用,以及药物对病毒吸附后在 Hep-2细胞内增殖的过程中所起的作用,通过计算每种药物成分的细胞存活率和病毒抑制率,根据相应的量效曲线分别求得50%细胞毒性浓度(TC)、50%病毒抑制浓度(IC)和治疗指数(treatment index, TI),以此为标准,衡量不同成分的细胞毒性强弱和抗病毒效果。比较不同产地以及不同方法提取的大黄成分抗柯萨奇病毒的效果, 并初步探讨其中2种有效成分可能的抗病毒机制。结果:对2种产地的大黄(大黄a 和大黄b)的35种成分进行体外抗柯萨奇病毒b3有效成分的筛选,根据药物体外抑制病毒增殖的TI(治疗指数)的不同,可将它们归为4类:高效低毒:TI>5的有 1a-4,2a-5,4a-1,4a-2,4a-3,4b-5;有效有毒:2b-2,2b-1,2b-6, 4a-5,4a-6,4b-1,4b-2,4b-6;低效有毒:TIb-3,1b-4,2b-2,2b-3,2b-4,4b-3,4a-4;无效:TIb-1,4b-4。对不同产地的大黄提取物抗柯萨奇病毒b3效果的比较发现,在方法2中,大黄b的提取成分抗病毒效果要比大黄a好;而方法4中,大黄a的提取成分抗病毒效果好于大黄b;可见中药大黄的不同产地对其品质和抗病毒活性有较大影响,说明对不同产地的大黄应选择不同的提取方法,大黄a适合用方法4提取,而大黄b则适合用方法2 提取。对用不同方法提取的相同大黄的成份抗柯萨奇病毒b3的效果进行比较发现, 相同大黄的不同提取成分抗柯萨奇病毒的作用会受到提取方法的影响,不同成分需要用各自适宜的方法提取,用方法4提取大黄a的成份1～3效果较好;用方法1提取大黄a的成分4效果较好;因此针对不同的目标成分采用适合的方法有助于发挥出药物成分的最大抗病毒效果。对大黄a和大黄b的2种成分抗病毒机制的研究结果显示, 药物抑制病毒的主要环节是病毒进入细胞后在胞内增殖的阶段。

关键词：大黄柯萨奇病毒b3型抗病毒作用筛选

四种靶向因子与柯萨奇病毒b3 VP1融合基因疫苗免疫效果的比较

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第2期26卷 103-106页

作者：刘贵霞蓝佳明揣侠高志云金玉怀张永红谢立新殷长甫王永祥河北医科大学基础医学院病原生物学教研室河北石家庄050017

目的:比较巨噬细胞源趋化因子(MDC)、补体片段C3d3、志贺毒素b亚单位(STxb)和小鼠β-防御素2(mbD2)分别与柯萨奇病毒b3(CVb3)VP1构建的融合基因疫苗及VP1基因疫苗对小鼠的免疫效果。方法:将雄性bALb/c小鼠随机分为6组,每组22只,分别于... 详细信息

目的:比较巨噬细胞源趋化因子(MDC)、补体片段C3d3、志贺毒素b亚单位(STxb)和小鼠β-防御素2(mbD2)分别与柯萨奇病毒b3(CVb3)VP1构建的融合基因疫苗及VP1基因疫苗对小鼠的免疫效果。方法:将雄性bALb/c小鼠随机分为6组,每组22只,分别于股四头肌注射pcDNA3、pcDNA3/VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1-C3d3、pcD-NA3/STxb-VP1和pcDNA3/mbD2-VP1,接种剂量为每次100μg/只,3周免疫1次,共3次。每次免疫后第14天内眦静脉取血,用微量中和试验滴定血清中和抗体滴度。第3次免疫后第21天,每组随机取3只小鼠,制备脾淋巴细胞,用CCK-8细胞计数法检测特异性CTL的杀伤活性;每组取3只小鼠以3LDLD50CVb3病毒攻击,第7天取血处死,检测血清病毒滴度;其余小鼠以5LDLD50的CVb3攻击,观察各组的生存情况。结果:除了pcDNA3对照组,其他各组的中和抗体滴度均随免疫次数的增加而提高(PbD2-VP1组的抗体滴度明显高于pcDNA3/VP1组(Pb-VP1和pcDNA3/mbD2-VP1组CTL杀伤活性显著高于其他各组(P病毒攻击后,pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1-C3d3和pcDNA3/mbD2-VP1组小鼠血中病毒滴度显著低于其他组(P病毒滴度,获得较高的小鼠生存率;整体效果优于其他组。

关键词：巨噬细胞源趋化因子补体片段C3d 志贺毒素b亚单位小鼠β-防御素2 柯萨奇病毒b3型基因疫苗

GYY4137通过bcl-2/bax/Cleaved caspase-3信号通路改善柯萨奇病毒b_3引起的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡

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华中科技大学学报（医学版） 2014年第4期43卷 371-375页

作者：吴祖波彭华白燕林雯张志泉刘亚黎华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科武汉430022

目的探讨外源性H2S对柯萨奇病毒b3引起的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法培养SD大鼠乳鼠原代心肌细胞,建立病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)体外模型,随机分为正常组、模型组、模型组+50μmol/L GYY4137组、正常组+50... 详细信息

目的探讨外源性H2S对柯萨奇病毒b3引起的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法培养SD大鼠乳鼠原代心肌细胞,建立病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)体外模型,随机分为正常组、模型组、模型组+50μmol/L GYY4137组、正常组+50μmol/L GYY4137组。Hoechst 33342染色法及流式细胞术分别检测心肌细胞凋亡,TbA法及酶标法分别检测各组细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的表达,Western blot法检测各组细胞bcl-2、bax、Cleaved caspase-3蛋白的表达。结果与模型组比较,给予50μmol/L GYY4137后,心肌细胞凋亡明显好转(P型组心肌细胞MDA显著降低、SOD明显增加(均P型组心肌细胞bcl-2蛋白表达增加、bax蛋白表达明显降低(均P0.05)。结论GYY4137可显著改善柯萨奇病毒b3引起的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡,其作用机制与抑制bcl-2/bax/Cleaved caspase-3信号通路激活有关。

关键词：硫化氢病毒性心肌炎柯萨奇病毒b3型心肌细胞凋亡

m6A修饰的LONP1抑制CVb3复制的分子机制研究

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m6A修饰的LONP1抑制CVB3复制的分子机制研究

作者：王燕江苏大学

学位级别：硕士

背景:柯萨奇病毒b3（Coxsackievirus b3,CVb3）属Picornaviridae病毒科,肠病毒属,是引起病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎和胰腺炎的重要病原体。然而,目前临床上治疗CVb3感染的策略十分有限。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,mA）是RNA分... 详细信息

背景:柯萨奇病毒b3（Coxsackievirus b3,CVb3）属Picornaviridae病毒科,肠病毒属,是引起病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎和胰腺炎的重要病原体。然而,目前临床上治疗CVb3感染的策略十分有限。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,mA）是RNA分子中最普遍的化学修饰,可通过调节mRNA及其编码蛋白的表达来影响基因功能。mA甲基化修饰的宿主细胞转录本在调节病毒复制和传染性方面有重要作用,但其在CVb3感染期间扮演的角色尚不清楚。目的:为阐明mA修饰的宿主转录本对CVb3感染的重要性,本研究以CVb3感染后mA修饰水平显著差异的基因LONP1为研究对象,拟在He La细胞（CVb3易感细胞系）内分析病毒感染期间LONP1 mA修饰动态变化的分子机制及其对转录表达的调节作用;并初步探讨mA修饰的LONP1对CVb3复制的影响及作用机制,为CVb3感染的诊断和治疗提供新的理论依据。方法:1.利用RNA甲基化免疫共沉淀-高通量测序（Methylated RNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq）技术筛选CVb3感染后mA修饰水平显著差异的宿主转录本—LONP1,并用SRAMP数据库对LONP1的潜在mA修饰位点进行定位,随后通过RNA甲基化免疫共沉淀-实时荧光定量聚合酶链反应（Methylated RNA immunoprecipitation-quantitative real time polymerase chain reaction,MeRIP-qRT-PCR）实验验证LONP1 mRNA的mA修饰情况以及CVb3感染前后LONP1的mA水平变化;同时分析CVb3感染前后LONP1的转录表达变化。2.构建LONP1野生型（LONP1 3'UTR WT）及mA位点突变型（LONP1 3'UTR mA-Mut）双荧光素酶载体,分析CVb3感染期间LONP1 mA甲基化修饰位点对其转录表达的调节作用。3.通过western blot、qRT-PCR、MeRIP-qRT-PCR和双荧光素酶实验综合分析CVb3感染期间mA相关蛋白介导LONP1甲基化修饰及转录表达的机制。4.通过RIP-qRT-PCR、qRT-PCR和western blot方法筛选与LONP1 mRNA结合的mA甲基化阅读蛋白,并利用放线菌素D（5μg/m L）分析CVb3感染对LONP1 mRNA和蛋白稳定性的影响,探讨病毒感染期间mA修饰调控LONP1转录表达的作用机制。5.过表达/沉默LONP1,通过细胞病变观察实验、western blot、病毒噬斑实验和荧光病毒实验分析LONP1对CVb3复制增殖的调控作用。6.利用western blot实验、细胞内铁离子含量测定试剂盒、ROS含量测定试剂盒分析CVb3感染期间LONP1对相关铁死亡指标的影响,进一步探讨LONP1影响CVb3复制及宿主细胞病变的分子机制。结果:***1 3'UTR区（2946bp处）存在高可信度的mA修饰位点,CVb3感染导致LONP1 mRNA的mA修饰水平显著下降（Pb3感染7 h时明显升高（P3感染可显著上调LONP1 3'UTR WT的荧光素酶活性（P3'UTR mA-Mut的荧光素酶活性无明显影响（P>0.05）。***3感染显著抑制了甲基化酶WTAP的表达（P3'UTR WT的荧光素酶活性（P3'UTR mA-Mut的荧光素酶活性无明显影响（P>0.05）;CVb3感染增加了LONP1表达,但在CVb3感染的同时过表达WTAP则可使LONP1基本恢复到未感染时的水平。***修饰的LONP1 mRNA可结合甲基化阅读蛋白YTHDF2;CVb3的感染增强了LONP1的稳定性,减缓了其在ActD处理时的衰变速率（Pb3所致的细胞病变,并抑制CVb3 VP1表达和噬斑形成,减弱CVb3-e GFP的荧光强度（Pb3所致的细胞病变,促进CVb3 VP1表达和噬斑形成,同时增强CVb3-e GFP的荧光强度（Pb3感染期间,过表达LONP1促进了铁死亡抑制基因GPX4的表达,抑制了铁死亡促进基因ACSL4的表达,同时降低细胞内铁离子含量和ROS含量（P<0.05）;沉默LONP1则抑制了GPX4的表达,促

关键词：柯萨奇病毒b3型 CVb3 肠道病毒 LONP1

重组水疱性口炎病毒载体疫苗皮下免疫效应的初步研究

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现代免疫学 2015年第2期35卷 89-95页

作者：吴飞范兴娟熊思东董春升苏州大学生物医学研究院苏州215123

柯萨奇b组病毒(CVb3)是导致人类急慢性心肌炎、扩张性心肌病的重要病原体之一。目前还没有疫苗或有效的药物防治病毒性心肌炎,我们观测了以水疱性口炎病毒VSV为载体的疫苗皮下免疫诱导的CVb3特异性免疫应答及保护效果,并比较了与传统蛋... 详细信息

柯萨奇b组病毒(CVb3)是导致人类急慢性心肌炎、扩张性心肌病的重要病原体之一。目前还没有疫苗或有效的药物防治病毒性心肌炎,我们观测了以水疱性口炎病毒VSV为载体的疫苗皮下免疫诱导的CVb3特异性免疫应答及保护效果,并比较了与传统蛋白疫苗之间的差异。以VSV为载体的病毒疫苗在小鼠模型中通过皮下免疫可以诱导强劲的体液免疫和T细胞免疫,但与VP1蛋白疫苗比较,除了分泌IFN-γ的T细胞外差异无统计学意义。VSV-VP1免疫组(一次免疫)的保护效果略好于VP1蛋白免疫组(三次免疫),提示VSV-VP1疫苗保护效果增加的可能原因是VSV-VP1皮下免疫诱导的特异性分泌IFN-γ的T细胞的比例增加,以上实验结果为水疱性口炎病毒作为疫苗载体应用提供了理论基础。

关键词：水疱性口炎病毒柯萨奇病毒b3型 T细胞免疫应答