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柯萨奇病毒b3 VP1蛋白、rAd/VP1和pcDNA3/VP1的免疫效果比较

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中华微生物学和免疫学杂志 2011年第1期31卷 25-29页

作者：蓝佳明高志云李嘉金玉怀温婵李伟闫立景刘贵霞谢立新王永祥河北医科大学病原生物学教研室石家庄050017 河北省儿童医院感染控制处河北大学附属医院检验科江南大学校医院

目的观察柯萨奇病毒b3（Coxsackievirus b3,CVb3）衣壳蛋白VP1、表达VP1蛋白的重组腺病毒rAd/VP1和重组质粒pcDNA3/VP1的免疫效果.方法用原核细胞表达VP1蛋白并纯化、扩增重组腺病毒rAd/VP1,扩增并提取真核表达质粒pcDNA3/***/c小鼠... 详细信息

目的观察柯萨奇病毒b3（Coxsackievirus b3,CVb3）衣壳蛋白VP1、表达VP1蛋白的重组腺病毒rAd/VP1和重组质粒pcDNA3/VP1的免疫效果.方法用原核细胞表达VP1蛋白并纯化、扩增重组腺病毒rAd/VP1,扩增并提取真核表达质粒pcDNA3/***/c小鼠随机分为4组,每组18只,分别在股四头肌注射VP1蛋白、rAd/VP1、pcDNA3/VP1和***1蛋白组和pcDNA3/VP1组免疫3次,间隔3周;rAd/VP1组免疫2次,间隔2周.VP1蛋白、pcDNA3/VP1和rAd/VP1每次每只注射剂量分别为50μg、100μg和1.2×107PFU.用ELISA法和微量中和试验法检测各次免疫后血清CVb3特异性IgG抗体和中和抗体滴度;末次免疫后3周,CCK-8法检测脾脏淋巴细胞的CTL杀伤活性;用致死量CVb3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察动物的存活情况.结果 VP1蛋白组血清特异性IgG抗体和中和抗体滴度明显高于其他实验组（P＜0.05）,而脾脏淋巴细胞CTL杀伤活性低于rAd/VP1组（P＜0.05）;致死量病毒攻击后,VP1蛋白组血中病毒滴度低于pcDNA3/VP1和rAd/VP1组（P＜0.05）,生存率明显高于这两组（P＜0.05）.结论 VP1蛋白疫苗能诱导较高水平的体液免疫应答,对动物有明显的免疫保护作用,免疫效果优于质粒pcDNA3/VP1和重组腺病毒rAd/VP1.

关键词：柯萨奇病毒b3 腺病毒载体疫苗蛋白疫苗 DNA疫苗免疫应答

柯萨奇病毒b3的VP1 DNA疫苗与蛋白或重组腺病毒疫苗不同组合免疫方式的免疫效果观察

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中国人兽共患病学报 2012年第1期28卷 41-45,50页

作者：蓝佳明高志云金玉怀李剑刘贵霞羡鲜张永红王永祥河北医科大学病原生物教研室石家庄050017

目的观察柯萨奇病毒b3(Coxsackievirus b3,CVb3)衣壳蛋白VP1DNA疫苗初免后VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强的prime-boost策略的免疫效果。方法用CVb3VP1的真核表达质粒pcDNA3/VP1初次免疫小鼠后,分别用VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强免... 详细信息

目的观察柯萨奇病毒b3(Coxsackievirus b3,CVb3)衣壳蛋白VP1DNA疫苗初免后VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强的prime-boost策略的免疫效果。方法用CVb3VP1的真核表达质粒pcDNA3/VP1初次免疫小鼠后,分别用VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强免疫2次。检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体、中和抗体滴度以及脾脏细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocytes,CTLs)杀伤活性;致死量CVb3攻击后,检测小鼠血中病毒滴度并观察动物的存活情况。结果 pcDNA3/VP1+VP1蛋白组小鼠血清IgG抗体、中和抗体滴度以及动物生存率明显高于pcDNA3/VP1+rAd/VP1组和pcDNA3/VP1质粒组(P病毒rAd/VP1加强的prime-boost策略有较好的免疫效果,两者比较pcDNA3/VP1+VP1蛋白prime-boost免疫策略的效果更为明显。

关键词：柯萨奇病毒b3 prime-boost DNA 蛋白重组腺病毒

柯萨奇病毒b3感染HeLa细胞后bax和bim的表达

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中国病理生理杂志 2014年第3期30卷 524-528页

作者：杨丽李欣田朗黄利华李卓颖杨作成中南大学湘雅三医院儿科湖南长沙410013

目的:观察HeLa细胞感染柯萨奇病毒b3(CVb3)后bax和bim mRNA和蛋白的表达。方法:将HeLa细胞分为未予以CVb3感染的对照组和予以CVb3感染的病毒组,取3 h、6 h、9 h、12 h和24 h的细胞,采用RT-PCR和Western blotting分别检测bax和bim mRNA... 详细信息

目的:观察HeLa细胞感染柯萨奇病毒b3(CVb3)后bax和bim mRNA和蛋白的表达。方法:将HeLa细胞分为未予以CVb3感染的对照组和予以CVb3感染的病毒组,取3 h、6 h、9 h、12 h和24 h的细胞,采用RT-PCR和Western blotting分别检测bax和bim mRNA和蛋白的表达。结果:bax和bim mRNA在对照组和病毒组HeLa细胞中均有表达,在病毒组和对照组中bax和bim mRNA的表达在各自组内均无显著差异(P>0.05),但在24 h bax和bim在病毒组mRNA的表达低于对照组(Pbax和bim蛋白表达在对照组中各时点均有表达,但无显著差异(P>0.05)。病毒组bax蛋白在24 h表达下降,差异有统计学意义(P病毒组表达明显低于对照组(Pbim蛋白的表达随感染时间延长而下降(P病毒组低于对照组(Pbax和bim在CVb3感染诱导的HeLa细胞凋亡早期发挥作用。

关键词： HeLa细胞柯萨奇病毒b3 细胞凋亡 bax蛋白 bim蛋白

柯萨奇病毒b3诱导的病毒性心肌炎C57bL/6J小鼠模型的建立

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郑州大学学报（医学版） 2016年第2期51卷 212-217页

作者：赵小建张洁钰杨帆王丽张真真唐琳赵洛沙郑州大学第一附属医院心内科郑州450052

目的：建立由柯萨奇病毒b3（CVb3）Nancy株诱导的病毒性心肌炎（VMC）C57bL/6J小鼠模型。方法：4周龄、6周龄C57bL/6J小鼠各50只,每个年龄组随机选取15只作为对照（腹腔注射PbS）,剩余35只腹腔接种含CVb3 Nancy株的病毒悬液（1×10^5PFU... 详细信息

目的：建立由柯萨奇病毒b3（CVb3）Nancy株诱导的病毒性心肌炎（VMC）C57bL/6J小鼠模型。方法：4周龄、6周龄C57bL/6J小鼠各50只,每个年龄组随机选取15只作为对照（腹腔注射PbS）,剩余35只腹腔接种含CVb3 Nancy株的病毒悬液（1×10^5PFU/只）,于感染后第14天取心脏,行HE染色和CD3、CD45免疫组化染色,进行病理学评价,检测血清白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平,并做心肌组织中病毒滴度检测,采用Western blot法检测磷酸化AKT、Ik bα、GSK3β的表达。结果：4周龄小鼠造模过程中有19只（54.3%）死亡;与对照小鼠比较,模型小鼠心肌呈现弥漫性炎性细胞浸润和片状心肌细胞变性坏死,CD3、CD45阳性细胞弥漫浸润于心肌间质,血清IL-1β、TNF-α水平明显升高（P〈0.05）,心肌组织中磷酸化AKT、Ik bα、GSK3β表达增高（P〈0.05）。6周龄小鼠造模过程中有3只（8.6%）死亡,模型小鼠心肌组织中炎症反应轻于4周龄模型小鼠（P〈0.05）。结论：成功建立了VMC的C57bL/6J小鼠模型,4周龄C57bL/6J小鼠更适用于模型的建立。

关键词：柯萨奇病毒b3 病毒性心肌炎 C57bL/6J小鼠动物模型

柯萨奇病毒b3感染大鼠心室肌钙通道基因表达及其功能变化

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中华医院感染学杂志 2021年第2期31卷 161-165页

作者：郭丽敏张东华史宁王芳赵微河北医科大学第四医院心内科河北石家庄050011

目的探讨柯萨奇病毒b3(Coxsackievirub3,CVb3)感染大鼠心室肌钙通道的基因表达特点及其功能改变。方法取1~3日龄新生SD大鼠15只行心室肌细胞原代培养,将培养48 h且已形成规律搏动的心室肌细胞随机分为病毒感染组(CVb3株感染培养,n=8)与... 详细信息

目的探讨柯萨奇病毒b3(Coxsackievirub3,CVb3)感染大鼠心室肌钙通道的基因表达特点及其功能改变。方法取1~3日龄新生SD大鼠15只行心室肌细胞原代培养,将培养48 h且已形成规律搏动的心室肌细胞随机分为病毒感染组(CVb3株感染培养,n=8)与正常对照组(n=7),比较两组大鼠的细胞形态、结构变化特点等;采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组大鼠L型钙通道亚单位mRNA的表达;应用全细胞膜片钳技术对CVb3感染前后心室肌细胞L型钙电流(ICa-L)变化进行测定,记录细胞膜电容(Cm)、电流密度、电压依赖性激活与失活等动力学参数。结果正常心室肌细胞主要表现为三角形、梭形、多边形等形态,搏动规律有力,搏动细胞百分比>95%;接种CVb3培养3 d后细胞搏动开始减慢且呈不规律搏动,细胞变圆、扁梭,折光性增强,最终停止搏动、脱落、死亡;CVb3感染3 d后,溶酶体增多,线粒体空泡变形,细胞核肿胀,核膜破裂。病毒感染组心室肌细胞L型钙通道α1和β亚单位mRNA表达水平分别为(4.02±0.07)、(2.08±0.06)均高于正常对照组(P病毒感染组ICa-L密度为(-8.65±0.99),较正常对照组明显增加(Pb3感染培养对大鼠心室肌细胞Cm、电压依赖性激活与失活特性无显著影响。病毒接种后第4天,病毒感染组CVb3特异蛋白基因片段RNA均为阳性,正常对照组CVb3特异蛋白基因片段RNA均为阴性,差异有统计学意义(P病毒感染组病毒接种1~4 d CK-Mb浓度均高于正常对照组(Pb3感染大鼠心室肌细胞L型钙通道α1和β亚单位mRNA表达上调,ICa-L密度增大,可能是CVb3感染对心室肌细胞产生损伤作用的病理机制。

关键词：柯萨奇病毒b3 大鼠心室肌细胞 L型钙通道基因表达细胞功能

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柯萨奇病毒b3的多克隆抗体制备

哈尔滨医科大学学报 2011年第5期45卷 397-400页

作者：代海丽栾颖高铁磊朱琳靳占峰哈尔滨医科大学病理教研室和法医教研室哈尔滨医科大学附属第二医院心内科黑龙江哈尔滨150081

目的制备柯萨奇病毒b3(coxsackievirus b3,CVb3)的多克隆抗体。方法针对CVb3基因的VP1区设计特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因并将其克隆到pGEX-6p-1中,经IPTG诱导表达后,以GST-VP1融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。采用E... 详细信息

目的制备柯萨奇病毒b3(coxsackievirus b3,CVb3)的多克隆抗体。方法针对CVb3基因的VP1区设计特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因并将其克隆到pGEX-6p-1中,经IPTG诱导表达后,以GST-VP1融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。采用ELISA、Western blot以及间接免疫荧光检测多克隆抗体的效价和特异性。结果 ELISA检测血清的效价不低于1∶64 000,Western blot和间接免疫荧光显示该抗体具有良好的特异性。结论成功制备了效价较高的CVb3多克隆抗体,可应用于CVb3蛋白的检测。

关键词：柯萨奇病毒b3 多克隆抗体原核表达融合蛋白

柯萨奇病毒b3的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国卫生检验杂志 2012年第1期22卷 8-10页

作者：代海丽高铁磊朱琳曹威栾颖靳占峰哈尔滨医科大学病理学教研室和法医教研室哈尔滨150081 哈尔滨医科大学附属第二医院心内科哈尔滨150081

目的:建立一种检测柯萨奇病毒b3(Coxsackievirus b3)的实时荧光定量RT-PCR方法,为临床CVb3的快速、准确检测提供一种新的方法。方法:针对CVb3基因的VP4区和管家基因β-actin的核苷酸序列分别设计了特异性的引物和TaqMan荧光探针,以重组... 详细信息

目的:建立一种检测柯萨奇病毒b3(Coxsackievirus b3)的实时荧光定量RT-PCR方法,为临床CVb3的快速、准确检测提供一种新的方法。方法:针对CVb3基因的VP4区和管家基因β-actin的核苷酸序列分别设计了特异性的引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-CVb3为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建CVb3的荧光定量RT-PCR标准曲线。结果:建立的方法在1.0×101～1.0×108copies/μl模板范围内具有良好的线性关系(r2>0.999),扩增效率高于98.0%,至少可检测10 copies/μl的阳性标准品。用CVb3感染HeLa细胞来模拟实际样品,灵敏度可达到1.0×101copies。结论:建立的荧光定量RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为CVb3的快速诊断方法,为CVb3感染的临床治疗提供快速可靠的诊断依据。

关键词：柯萨奇病毒b3 荧光定量RT—PCR TaqMan荧光探针快速检测

柯萨奇病毒b3对Hela细胞mTOR/p70S6K表达的调控作用

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柯萨奇病毒B3对Hela细胞mTOR/p70S6K表达的调控作用

作者：成亮中南大学

学位级别：硕士

目的：通过检测柯萨奇病毒b3 (Coxsackie virus b3, CVb3)感染“非饥饿法”与“饥饿法”人宫颈癌细胞株(Henrietta Lacks strain of cancer cells, Hela)后不同时间点的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)及细胞内CVb3外壳蛋白、哺... 详细信息

目的：通过检测柯萨奇病毒b3 (Coxsackie virus b3, CVb3)感染“非饥饿法”与“饥饿法”人宫颈癌细胞株(Henrietta Lacks strain of cancer cells, Hela)后不同时间点的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)及细胞内CVb3外壳蛋白、哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,p70S6K) mRNA水平,探讨细胞周期的不同时相对mTOR信号通路的影响及CVb3对Hela细胞mTOR/p70S6K mRNA表达的调控作用。方法：实验分病毒组和对照组。病毒组以CVb3分别感染“非饥饿法”与“饥饿法”'Hela细胞3h、6h、9h、12h、24 h;对照组以病毒维持液培养。通过相差显微镜观察细胞形态学变化,用RT-PCR、Real-Time PCR检测Hela细胞内不同时间点的CVb3外壳蛋白、mTOR、p70S6K mRNA表达,应用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学分析,P3感染不同方法培养的HeLa细胞的细胞形态改变：“非饥饿法”和“饥饿法”病毒组感染6h时,即可见细胞病变;随着感染时间的延长,病变效应越明显。2. RT-PCR检测Hela细胞CVb3外壳蛋白mRNA表达：“非饥饿法”与“饥饿法”的病毒组均随感染时间的延长,CVb3外壳蛋白mRNA表达逐渐增加(P0.05)。3. RT-PCR和Real-Time PCR检测mTOR、P70S6K mRNA表达：RT-PCR和Real-Time PCR结果均显示,“非饥饿法"mTOR、P70S6K mRNA表达在病毒组感染12 h时明显下调,与对照组比较,差异有统计学意义(P3h、6h、9h时间点与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);而“饥饿法”病毒组：mTOR、P70S6K mRNA表达均低于对照组各对应时间点,差异有统计学意义(all P病毒组和对照组Hela细胞在各时间点mTOR mRNA表达“饥饿法”均高于“非饥饿法”,差异有统计学意义(all P0.05)。结论：1.“非饥饿法”和“饥饿法”病毒组mTOR.p70S6K mRNA表达均低于对照组,提示CVb3可诱导Hela细胞mTOR.p70S6K mRNA表达下调。***3感染12h、24h时,CVb3外壳蛋白mRNA的表达明显增加,而mTOR、P70S6K mRNA表达明显下调,且CVb3感染24 h时,CVb3外壳蛋白mRNA高表达,但无mTOR.p70S6K mRNA表达或表达极低,提示mTOR信号通路可能参与了CVb3诱导的Hela细胞凋亡。***3感染“非饥饿法"Hela细胞,病毒组仅在12 h.24 h mTOR.p70S6K mRNA表达与对照组比较差异有统计学意义;而“饥饿法”病毒组各时间点与对照组比较均有统计学意义;“饥饿法”病毒组和对照组Hela细胞mTOR.p70S6K mRNA表达均高于“非饥饿法”,提示细胞周期的不同时相对mTOR信号通路有影响,“饥饿法”可减少因细胞周期时相对实验的干扰,优于“非饥饿法”。

关键词：柯萨奇病毒b3 Hela细胞细胞病变效应 mTOR/p70S6K

柯萨奇病毒b3感染Hela细胞后bax、bim、Caspase-3及Caspase-9 mRNA及蛋白的表达

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柯萨奇病毒B3感染Hela细胞后Bax、Bim、Caspase-3及Caspase-9 mRN...

作者：杨丽中南大学

学位级别：硕士

目的观察CVb3感染Hela细胞后促凋亡基因bax、bim Caspase-3及caspase-9mRNA和蛋白表达的变化。方法将Hela细胞分为未予CVb3感染的对照组和CVb3感染的病毒组,取3h、6h、9h、12h、24h共5个时间点,采用RT-PCR、 Western blot分别检测bax、... 详细信息

目的观察CVb3感染Hela细胞后促凋亡基因bax、bim Caspase-3及caspase-9mRNA和蛋白表达的变化。方法将Hela细胞分为未予CVb3感染的对照组和CVb3感染的病毒组,取3h、6h、9h、12h、24h共5个时间点,采用RT-PCR、 Western blot分别检测bax、bim、Caspase-3及caspase-9mRNA和蛋白的表达。结果***、bim、Caspase-3及Caspase-9mRNA在对照组和病毒组Hela细胞中均有表达,且在各自组内差异均无显著性(P>0.05);病毒组bax、bim mRNA表达在24h时间点均低于对照组(P病毒组中Caspase-3、Caspase-9mRNA在组内各时间点间的表达差异均无显著性(P>0.05);病毒组Caspase-9mRNA表达较在24h时间点较对照组降低(P3mRNA表达组间各时间点比较差异无显著性(P>0.05)。2. bax、bim、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达在对照组中各时间点均有表达,但差异均无显著性(P>0.05)。在病毒组中,bax蛋白在24h时间点表达下降,与组内各时间点比较差异均有显著性(P病毒组表达明显低于对照组(Pbim蛋白表达随感染时间延长而下降(P病毒组低于对照组(P病毒组Caspase-3及Caspase-9蛋白表达均在24h点明显降低(P病毒组Cleaved Caspase-9蛋白表达在3h及6h点与9h、12h、24h时间点间比较差异有显著性(P病毒组中Cleaved Caspase-9/Caspase-9表达在3h、6h、9h各时间点比较,差异无显著性(P>0.05),但是随感染时间的延长表达增强,至12h时间点出现增高,24h时间点明显增强。结论***3感染Hela细胞后bax、bim mRNA在24h时间点表达降低;bax蛋白表达在病毒感染后24h时间点明显降低,而bim蛋白表达随感染时间延长而下降,至24h时间点明显下降。***3感染Hela细胞后Caspase-3mRNA表达无明显变化,而Caspase9mRNA在24h时间点表达降低;Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均在病毒感染后24h时间点降低,而Cleaved Caspase-9蛋白表达在病毒感染后12h时间点最强。3. bax、bim、Caspase-3、Caspase-9均在CVb3诱导的Hela细胞凋亡中发挥作用。

关键词： Hela细胞柯萨奇病毒b3 bax bim Caspase-3 Caspase-9