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柯萨奇病毒B组1型感染动物模型研究进展

医学研究杂志 2024年第5期53卷 158-161,73页

作者：李咏洁和占龙中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118

柯萨奇病毒B组1型(coxsakievirus b1,CVb1)能引起人类心肌炎、无菌性脑膜炎、新生儿全身感染等多种疾病,幼儿感染后病情较重甚至引发死亡,而目前尚无针对该病毒的疫苗及特效治疗药物。因此,建立并开展相关动物模型研究对CVb1感染后的机... 详细信息

柯萨奇病毒B组1型(coxsakievirus b1,CVb1)能引起人类心肌炎、无菌性脑膜炎、新生儿全身感染等多种疾病,幼儿感染后病情较重甚至引发死亡,而目前尚无针对该病毒的疫苗及特效治疗药物。因此,建立并开展相关动物模型研究对CVb1感染后的机体免疫反应、病毒毒力机制、药物疫苗研发等问题的解决具有重要意义,同时也能为临床治疗提供部分依据。本文通过对CVb1病毒感染构建的不同动物模型进行总结,以期望为建立合适的动物模型以及开展相关研究提供参考。

关键词：柯萨奇病毒B组1型动物模型疫苗及药物评价

柯萨奇病毒B组1型新型中和试验方法的建立及初步应用

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柯萨奇病毒B组1型新型中和试验方法的建立及初步应用

作者：尹志超厦门大学

学位级别：硕士

我国自2008年在安徽省阜阳市暴发大规模手足口病（HFMD）疫情以来,截止2018年底,累计报告病例数超过2000万例,其中死亡病例数约3600例,发病数和死亡病例数均居我国丙类传染病第一位,严重危害公共健康。导致HFMD的人肠道病毒有20多种,除... 详细信息

我国自2008年在安徽省阜阳市暴发大规模手足口病（HFMD）疫情以来,截止2018年底,累计报告病例数超过2000万例,其中死亡病例数约3600例,发病数和死亡病例数均居我国丙类传染病第一位,严重危害公共健康。导致HFMD的人肠道病毒有20多种,除了主要病原体肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CVA16）外,柯萨奇病毒B组1型（CVb1）也是引起HFMD的重要病原体。研究显示,CVb1感染还可导致无菌性脑膜炎、心肌炎、脑膜脑炎等以及与I型糖尿病有关。目前尚无针对CVb1的预防或治疗方法,亟需开展相关防治方法的基础与应用研究。为了进一步建立和完善相关研究技术和方法,本研究基于酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT）建立了快速高效的CVb1新型中和抗体检测方法（Nt-ELISPOT）,为CVb1疫苗和药物研发及血清流行病学研究提供技术支持。本研究以自福建泉州地区分离的CVb1临床分离毒株XM0108株为对象开展相关研究,核酸序列进化分析显示该毒株与我国已报告的CVb1流行毒株高度相近,属于主要流行株。本研究首先对CVb1病毒进行培养与病毒颗粒纯化条件的摸索,建立了较为稳定高效的病毒培养与制备方法,初步建立了病毒原液的浓缩和纯化方法,进一步应用蔗糖密度离心方法获得了具有较高纯度的CVb1病毒颗粒。获得对CVb1病毒具有特异和较好反应性的单克隆抗体是建立基于ELISPOT技术的新型免疫检测方法的重要基础。本研究将经灭活处理后的病毒颗粒以腹腔注射的方式免疫小鼠,利用间接ELISA方法筛选获得了6株抗CVb1的单克隆抗体。通过分析相关单抗对CVb1病毒的结合活性与反应特异性本研究选取具有较好反应性能的2E6单抗作为Nt-ELISPOT检测方法的检测抗体。进一步通过系统摸索Nt-ELISPOT检测方法中酶标检测单抗稀释比例、病毒感染剂量与培养时间,本研究基于ELISPOT技术建立了具有快速和高通量特点的CVb1中和试验方法。与传统的基于细胞病变效应（CPE）的中和试验方法（Nt-CPE）,该方法可显著缩短检测时间（从5-7天缩短至1天）,并且两种方法的检测结果具有良好的一致性。本研究进一步应用建立的Nt-ELISPOT方法开展了CVb1中和性单克隆抗体的筛选,获得了6株CVb1中和性单克隆抗体。其中5株单克隆抗体亚型为IgG2a,一株为IgG1亚型。中和能力分析显示,其中8A10具有相对更优的中和活性。本研究进一步应用乳鼠感染模型初步评价了8A10与CVb1免疫抗血清的体内抗病毒感染效果。结果显示,8A10与CVb1免疫抗血清通过被动免疫方式可有效保护小鼠免于CVb1的致死性攻击。同时,本研究应用建立新型中和试验方法对厦门地区515份健康人群血清样本进行CVb1中和抗体水平检测。结果显示,上述血清样本的CVb1中和抗体阳性率为27%,其中20-39岁年龄组的血清中和抗体阳性率最高,这提示厦门地区存在CVb1的既往流行感染。综上所述,本研究建立了一种新型的CVb1中和抗体检测方法,可以快速、高效和高通量地应用于CVb1中和抗体的筛选评价以及相关血清流行病学调查,可为CVb1的防治方法研究提供重要支持。

关键词：柯萨奇病毒B组1型中和试验方法酶联免疫斑点检测技术

柯萨奇病毒B组1型TaqMan一步法荧光定量 RT-PCR检测方法的建立

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中国病毒病杂志 2022年第1期12卷 26-30页

作者：许丹菡张名冯昌增郭伟何秀莲张光贤禇嘉祐杨昭庆马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的建立柯萨奇病毒B组1型(coxsackievirus b1,CV-b1)特异的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法。方法根据CV-b1的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD19;载体,在DH5α感受态细胞中扩增,体外转录后获得RNA标准品... 详细信息

目的建立柯萨奇病毒B组1型(coxsackievirus b1,CV-b1)特异的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法。方法根据CV-b1的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD19;载体,在DH5α感受态细胞中扩增,体外转录后获得RNA标准品,建立标准曲线。并对检测方法的灵敏度、特异性、重复性进行评价。结果该方法在10^(2)-10^(11)拷贝/μl的模板范围内具有良好的线性关系(R^(2)=1.000),扩增效率E=107.5%。灵敏度达1×10^(2)拷贝/μl,只对CV-b1有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性,可作为CV-b1的快速检测和绝对定量分析。

关键词：柯萨奇病毒B组1型 TaqMan 实时荧光定量PCR 分子诊断

柯萨奇b组1型云南分离株MSH／KM9／2009全基因组序列分析

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病毒学报 2013年第3期29卷 293-298页

作者：刘建生邵聪文潘玥朱艳菊邓新强廖宏玮刘雅灵马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

对2009年分离自云南省昆明市脑膜脑炎儿童的1株柯萨奇b组1型病毒MSH-KM9-09,进行了全基因组的序列测定,并对其分子变异和进化特点进行了分析。采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR),分段扩... 详细信息

对2009年分离自云南省昆明市脑膜脑炎儿童的1株柯萨奇b组1型病毒MSH-KM9-09,进行了全基因组的序列测定,并对其分子变异和进化特点进行了分析。采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR),分段扩增覆盖病毒全长序列的8个重叠片段(未包括多聚腺苷酸尾),并进行序列测定和分析。CVb1MSH-KM9-09病毒株基因组全长7 384个核苷酸(nt),5'端和为3'端分别为741nt和94nt的非编码区,5'和3'非编码区间为一个6 549nt长的开放阅读框,编码一个含2 183个氨基酸的多聚蛋白,编码区内未见核苷酸的插入或缺失。与Genbank库中现有CVb1全基因组序列M16560、pmMC、Tucson b1和CVb1/Nm相比对,整个基因组的核苷酸同源性分别为80.9%、81.6%、80.5%和80%,氨基酸同源性分别为95.6%、95.8%、96.2%和95.6%。首次完成中国CVb1病毒全基因组核苷酸序列的测定,经核苷酸序列同源性比对和进化树分析,证实MSH/KM9/2009株属于CVb1基因型。

关键词：柯萨奇病毒B组1型全基因组同源性序列分析