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柯萨奇病毒a2型的鉴定与手足口病乳鼠模型的构建

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柯萨奇病毒A2型的鉴定与手足口病乳鼠模型的构建

作者：秦露伟新乡医学院

学位级别：硕士

背景手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）是由肠道病毒感染引起的常见小儿传染病。由于目前尚无有效的治疗方法,该病每年的发病率仍居我国丙类传染病之首,已成为严重影响婴幼儿健康的重要公共卫生问题。近年来,随着HFMD病原谱的演... 详细信息

背景手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）是由肠道病毒感染引起的常见小儿传染病。由于目前尚无有效的治疗方法,该病每年的发病率仍居我国丙类传染病之首,已成为严重影响婴幼儿健康的重要公共卫生问题。近年来,随着HFMD病原谱的演变,除常见的肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）和柯萨奇病毒A 16型（Coxsackievirus A 16,CVA16）外,柯萨奇病毒A 2型（Coxsackievirus A 2,CVa2）、柯萨奇病毒A 10型（Coxsackievirus A 10,CVA10）及柯萨奇病毒A 6型（Coxsackievirus A 6,CVA6）等新型肠道病毒感染病例逐渐增多。目前关于HFMD的研究多集中在EV71和CVA16,而CVa2方面的研究甚少报道。目的1.研究新乡医学院第一附属医院感染科HFMD的病原谱特征。2.鉴定临床来源的CVa2病毒株,并研究其体外毒力和对天然免疫信号的影响。3.构建CVa2感染乳鼠模型。方法1.采集2017年5月月在新乡医学院第一附属医院住院治疗的HFMD患儿粪便标本19例,用横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）分离病毒并扩增,提取病毒RNA,逆转录后,使用肠道病毒VP1通用引物、EV71病毒和CVA16病毒VP1保守序列引物对cDNA进行扩增,产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序,并对测序结果进行比对。设计CVa2 VP1全长引物,对测序结果为CVa2的病毒cDNA（样品11-1）进行PCR扩增,同样克隆后测序,对获得的CVa2 VP1全长序列进行系统进化树分析。2.将样品11-1分离得到的CVa2病毒以MOI=0.1接种RD细胞,分别在感染后0、4、8、16、24、48 h检测CVa2 mRNA的表达量。将该CVa2病毒以MOI=0、0.1、0.25、0.5、1和2感染RD细胞,24 h后提取总RNA和蛋白,用荧光定量PCR方法检测细胞因子IFN-β1、IL-1β、IL-6以及凋亡相关基因Caspase-8、Caspase-9和Cyto C mRNA的表达水平,采用Western blot检测天然免疫信号相关蛋白RIG-I、MAVS、IRAK1、TRAF6、pTBK1和TBK1以及凋亡相关蛋白Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达水平。3.将CVa2以颅内注射的方式（1×10～6 pfu/小鼠）感染10只5日龄BALB/c乳鼠,记录乳鼠生存情况。对照组（Mock）组5日龄BALB/c乳鼠乳鼠颅内注射等体积RD细胞培养上清液。感染后第7天,分别取小鼠脑、肺、心脏、脾、骨骼肌、小肠、脾、肝和肾组织,4%多聚甲醛固定48小时后,采用苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin,H&E）染色观察病理学改变。结果1.19例HFMD病例的病原体测序结果显示,其他肠道病毒、EV71、CVA16和CVa2的百分比分别为36.84%、10.53%、36.84%和15.79%。将19例样品的RT-PCR与测序结果比较显示7、11和12号样品PCR电泳结果与测序结果不一致,经进一步测序比对后发现,7、11和12号样品为CVa2型。***细胞中CVa2 mRNA水平在CVa2感染后24 h和48 h均显著升高（Pa2感染后表达水平均显著升高（P病毒基因IFN-β1 mRNA的表达水平显著降低（Pa2感染后,RD细胞中Caspase-8、Caspase-9的表达水平显著升高（Pa2感染后,RD细胞中RIG-I、MAVS和pTBK1表达量升高,而IRAK1和TRAF6表达量降低。3.乳鼠感染CVa2后出现明显的中枢神经系统症状。HE染色显示脑组织出现神经元退行性改变和炎症细胞浸润,肺组织出现充血、肿胀,表现为肺泡腔增大,肺间质增厚,并伴有大量红细胞和炎症细胞浸润。心肌组织表现心肌炎改变,表现为右心房扩张,房室壁增厚以及炎性细胞浸润。骨骼肌出现明显溶解和坏死,并伴炎症细胞浸润。小肠绒毛断裂,呈现不规则排列。肾脏和肝脏出现炎症细胞浸润。结论1.本论文研究所检测的19例HFMD患者的病原谱中,鉴定出了CVa2。2.本研究分离的CVa2毒株在体外可诱导细胞凋亡,并能够影响天然免疫信号转导。***2可通过颅内注射成功感染5日龄BALB/c乳鼠,引起乳鼠神经系统、肺部、骨骼肌和心肌病变。

关键词：柯萨奇病毒a2 手足口病乳鼠模型天然免疫

珠海市2013年手足口病患儿柯萨奇病毒a2型分离株基因特征分析

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中国病毒病杂志 2015年第2期5卷 109-113页

作者：周兰兰魏泉德张丽荣林毅雄李红霞郑予柯沈韧珠海市疾病预防控制中心广东珠海519000

目的分析2013年珠海市手足口病患儿柯萨奇病毒a2（CV-a2）5′UTR-VP4-VP2区基因特征,探讨其与国内外其他地区CV-a2分离株的关系。方法采集2013年珠海市手足口病患儿粪便标本,提取病毒RNA,用半巢式RT-PCR方法扩增5′UTR-VP4-VP2区,通过... 详细信息

目的分析2013年珠海市手足口病患儿柯萨奇病毒a2（CV-a2）5′UTR-VP4-VP2区基因特征,探讨其与国内外其他地区CV-a2分离株的关系。方法采集2013年珠海市手足口病患儿粪便标本,提取病毒RNA,用半巢式RT-PCR方法扩增5′UTR-VP4-VP2区,通过测序和Blast比对确定病毒型别,并利用DNAStar软件和MEGA4.1软件分别对珠海市CV-a2分离株进行核苷酸序列分析和遗传进化树分析。结果共鉴定出4株CV-a2,核苷酸序列分析表明CV-a2珠海株与2012年中国香港株在5′UTR-VP4-VP2区有最高的同源性,达97.4%~98.2%;进化树分析显示4株CV-a2珠海株与2012年中国香港株共同构成A进化树分支,Bootstrap值为99%。结论珠海市4株CV-a2与2012年中国香港株在5′UTR-VP4-VP2区具有较高的同源性,且进化关系密切。

关键词：手足口病柯萨奇病毒a2 进化分析

2014-2016年柳州市重症手足口病柯萨奇病毒a2型病毒株基因特征分析

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中国病毒病杂志 2017年第2期7卷 120-123页

作者：黄萍陈柳军余钧池柳州市疾病预防控制中心微生物检验科广西柳州545007

目的了解2014-2016年柳州地区重症手足口病肠道病毒a2型病原基因的特征。方法收集2014年1月至2016年12月手足口病重症儿童样本176份,提取病毒核酸,采用实时荧光逆转录-聚合酶链反应筛选,获得阳性病毒株。采用RT-PCR法扩增病毒5′UTR-VP4... 详细信息

目的了解2014-2016年柳州地区重症手足口病肠道病毒a2型病原基因的特征。方法收集2014年1月至2016年12月手足口病重症儿童样本176份,提取病毒核酸,采用实时荧光逆转录-聚合酶链反应筛选,获得阳性病毒株。采用RT-PCR法扩增病毒5′UTR-VP4-VP2区序列,PCR阳性扩增产物进行测序,经Blast比对确定病毒基因型,并与国内外代表株进行核苷酸同源性比较,构建系统进化树。结果本研究共检出41株非CV-A16、非EV-A71毒株,其中25株病毒株为CV-a2型(25/41,61.0%)。同源性比对及系统进化分析显示,25株CV-a2型病毒株之间核苷酸同源性为76.8%~99.9%,与原始株CVa2Fleetwood同源性为64.6%~80.5%。结论 2014-2016年柳州市儿童重症手足口病CV-a2病毒成为非CV-A16、非EV-A71型别的重要病原,CV-a2型与原始株遗传距离较远,CV-a2型之间同源性较高且分布集中,构成一个独立的进化分支。需加强对CV-a2型肠道病毒株的持续监测和分子特征分析。

关键词：重症手足口病柯萨奇病毒a2 进化关系基因型

北京市朝阳区2012-2015年柯萨奇a2型肠道病毒的基因特征分析

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中国病毒病杂志 2019年第4期9卷 268-273页

作者：祖伟王海滨刘倩雷娜仲一赵剑虹孙灵利北京市朝阳区疾病预防控制中心北京100021 中华预防医学会北京100021

目的了解北京市朝阳区手足口病相关柯萨奇a2型肠道病毒(coxsackievirus a2,CV-a2)的基因特征。方法采用5′端非编码区(5′UTR)和VP2基因测序的方法鉴定CV-a2病毒;对所有CV-a2病毒进行VP1全序列测序,对部分毒株进行编码蛋白全序列测序,... 详细信息

目的了解北京市朝阳区手足口病相关柯萨奇a2型肠道病毒(coxsackievirus a2,CV-a2)的基因特征。方法采用5′端非编码区(5′UTR)和VP2基因测序的方法鉴定CV-a2病毒;对所有CV-a2病毒进行VP1全序列测序,对部分毒株进行编码蛋白全序列测序,并将测得的序列与NCBI数据库中国内外的序列进行比对,构建系统进化树,进行基因特征及分子流行病学分析。结果 2012-2015年本地区共计检出6株CV-a2病毒。基于VP1分型,6条本研究的序列分别为D1亚型(5条)和D2亚型(1条)。6条VP1序列的核苷酸一致性为93.4%~98.5%,与原型株Fleetwood (基因库编号:AY421760)的核苷酸一致性为80.5%~81.6%。与国外VP1氨基酸序列比对显示有6个主要变异位点。在编码蛋白序列的P2和P3区发现与CV-A16、CV-A4和CV-A14型肠道病毒有基因重组。结论 2012-2015年北京市朝阳区CV-a2病毒有2种基因亚型,以D1亚型为主。本地区的CV-a2病毒发生了亚型转换和基因重组,应加强CV-a2病毒的持续监测和基因特征分析。

关键词：手足口病柯萨奇病毒a2 基因特征

长沙地区1株重组柯萨奇病毒A4基因型的全基因组序列分析

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中国病毒病杂志 2021年第4期11卷 290-294页

作者：欧新华黄政姚栋肖姗李灵之叶文湖南省长沙市疾病预防控制中心微生物检验科湖南长沙410004

目的对湖南省长沙市手足口病患儿咽拭子中分离的1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株进行全基因组序列及分子进化特征分析。为手足口病的疫情防控提供理论数据支持。方法利用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)... 详细信息

目的对湖南省长沙市手足口病患儿咽拭子中分离的1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株进行全基因组序列及分子进化特征分析。为手足口病的疫情防控提供理论数据支持。方法利用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞对2019年6月长沙市常规监测的手足口病病例咽拭子标本进行病毒分离,提取病毒RNA序列进行逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),并利用Illumina二代测序技术对其进行全基因组序列测定,利用MEGA 6.0构建系统进化树,用BioEdit和Simplot软件进行重组和进化分析。结果手足口病患儿的咽拭子中分离的CV-A4毒株为1株重组毒株,毒株命名为S270/Changsha/CHN/2019(简称S270),序列全长为7454 bp。基于核苷酸序列的进化树结果表明,S270毒株的结构蛋白区域(P1)属于CV-A4分支,非结构蛋白区域(P2和P3)属于CV-a2分支。S270毒株与AY421762株(简称CV-A4代表株)对比,核苷酸序列P1区的同源性为85.05%;非结构蛋白P2和P3区的同源性为83.90%。全基因组氨基酸序列与CV-A4代表株的同源性为84.7%。VP1区氨基酸序列与CV-A4代表株的同源性为83.8%,氨基酸位点出现A55T和M229T两个突变。重组位点分析发现S270毒株全基因组重组位点发生在2B非结构蛋白区域,位于基因组序列位点约3849 bp位置。结论S270分离株属于CV-A4重组毒株,基因重组位点位于2B区内,属于GI基因群的GIB亚型。

关键词：柯萨奇病毒A4 柯萨奇病毒a2 基因重组全基因组序列

CXCL10-CXCR3轴在CVa2感染致病中的作用及机制

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CXCL10-CXCR3轴在CVA2感染致病中的作用及机制

作者：梁若楠郑州大学

学位级别：硕士

柯萨奇病毒a2(Coxsackievirus,CVa2)是引起手足口病(Hand-foot-andmouth disease,HFMD)的重要病原体之一,属于A类肠道病毒(Enterovirus,EV)。CVa2感染可导致脑炎、上呼吸道感染和心肌炎等严重并发症,但其致病机制尚不清楚。在本研究中,C... 详细信息

柯萨奇病毒a2(Coxsackievirus,CVa2)是引起手足口病(Hand-foot-andmouth disease,HFMD)的重要病原体之一,属于A类肠道病毒(Enterovirus,EV)。CVa2感染可导致脑炎、上呼吸道感染和心肌炎等严重并发症,但其致病机制尚不清楚。在本研究中,CVa2在多种器官和组织中显著诱导趋化因子配体10(CXC chemokine ligand-10,CXCL10)表达,CXCL10通过其同源受体CXC型趋化因子受体3(C-X-C motif chemokine receptor 3,CXCR3)调控免疫应答。CXCL10-CXCR3的激活与很多炎症性疾病的发生有关。目的1.探讨CVa2感染过程中的免疫和炎症反应的参与。2.明确CXCL10-CXCR3轴在CVa2感染致病中的作用及机制。方法1.采用肌肉注射途径构建CVa2感染小鼠模型。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)检测在感染后第3天(days post infection,dpi)和5 dpi小鼠脑、肺、心、骨骼肌中81种炎症因子相关基因的转录水平。这些基因主要参与组织损伤、炎症、免疫应答。2.免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测感染和未感染小鼠脑、肺、心和骨骼肌中CXCL10和CXCR3的表达。分别采用CXCR3体内中和抗体(αCXCR3)(100μg/只)和Ig G同型对照抗体(100μg/只)治疗CVa2感染小鼠,记录其体重变化,临床评分以及生存情况。采用苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin,H&E)观察αCXCR3治疗组和Ig G治疗组小鼠在5dpi各组织的病理变化,分别采用IHC和q RT-PCR检测小鼠各组织CVa2抗原VP1的转录和表达水平;采用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)或Western Blot检测各组织凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3(Cl-Caspase-3)和Cleaved-PARP1(Cl-PARP1)的表达。3.采用IHC观察炎症细胞浸润情况(CD11b标记单核白细胞、F4/80标记巨噬细胞、Ly6G标记中性粒细胞);q RT-PCR检测各组织炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ转录水平;使用酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)检测血清炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ水平。结果1.与3dpi相比,小鼠在5dpi出现更明显的精神萎靡、四肢麻痹、濒死状态,脑、肺、心、骨骼肌等组织中37种免疫相关基因转录水平随着感染时间的延长而急剧升高,包括病原体识别、抗原呈递、干扰素信号通路、活性氧、炎症小体以及炎症细胞招募相关基因,其中CXCL10升高最为明显,在5dpi的上述组织中较对照组升高了20-300倍(pa2感染小鼠经αCXCR3治疗后,其临床评分、体重变化、生存率改善明显,各组织的病理损伤明显减轻,病毒复制降低,小鼠各组织中凋亡相关蛋白Cl-Caspase-3和Cl-PARP1的表达降低。3.与Ig G治疗小鼠相比,αCXCR3治疗可降低CVa2感染小鼠各组织以及血清的促炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表达,并减少CD11b+单核白细胞、F4/80+巨噬细胞、Ly6G+中性粒细胞等炎症细胞的浸润。结论CVa2诱导了小鼠脑、肺、心和骨骼肌的机体免疫应答和炎症反应,在感染后期可能出现了炎症反应的放大。CXCL10-CXCR3轴的激活可能促进炎症因子的产生和炎症细胞的浸润,进而放大局部炎症反应,并通过激活Caspase-3介导的凋亡促进CVa2感染导致的组织损伤。

关键词：柯萨奇病毒a2 手足口病 CXC趋化因子配体10 CXC亚族趋化因子受体3