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柯萨奇病毒a组16型VP1蛋白原核表达、纯化及鉴定

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柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白原核表达、纯化及鉴定

作者：米海河南工业大学

学位级别：硕士

柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)可引起呼吸道感染、HFMD、发热性皮疹、疱疹性咽峡炎、及心肌炎、急性弛缓性麻痹和脑炎等疾病，柯萨奇A组16型VP1蛋白（CVA16VP1）是肠道病毒的主要的主要治病病原体。其VP1基因区编码的蛋白大多数都是CV... 详细信息

柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)可引起呼吸道感染、HFMD、发热性皮疹、疱疹性咽峡炎、及心肌炎、急性弛缓性麻痹和脑炎等疾病，柯萨奇A组16型VP1蛋白（CVA16VP1）是肠道病毒的主要的主要治病病原体。其VP1基因区编码的蛋白大多数都是CVA16病毒的抗原决定簇并决定病毒的抗原性。现阶段对于CVA16的研究还很薄弱，因此，本研究旨在通过基因原核表达与蛋白纯化获得VP1蛋白，并初步建立CVA16-IgM的酶联免疫捕获法，作为试剂制备和疫苗的评价方法。本实验在安排和设计阶段做了很多工作：首先，根据实验室保存的含CVA16VP1、VP2和VP3全长序列克隆菌的测序报告，采用primer5.0软件设计VP1编码区上下游引物，从CVA16培养物当中扩增VP1蛋白基因序列，构建重组表达质粒pET-41a(+)/VP1;其次，进行菌落PCR来确定阳性克隆菌落，并双酶切初步鉴定为阳性的重组质粒pET-41a(+)/VP1转化大肠杆菌BL21-Gold (DE3) pLysS，测序验证正确后诱导表达，产物经SDS-PAGE分析蛋白表达情况，若结果与预期一致则进行诱导条件优化及表达产物纯化，并进行Western Blot鉴定免疫反应性;最后，通过辣根过氧化物酶标记纯化后的重组蛋白VP1，以棋盘滴定法初步确定包被浓度和酶结合物使用浓度，初步建立ELISA捕获检测方法。在经过了上述一系列是的实验后，我们获取了一定的成果：首先，成功扩增CVA16VP1蛋白基因片段，构建了重组质粒pET-41a(+)/VP1;其次，构建了可高效表达CVA16VP1蛋白的原核表达菌株，并确定了最佳诱导表达条件;SDS-PAGE表明重组蛋白与预期一致且呈包涵体表达;经亲和层析和离子交换层析法纯化，获取了纯化后蛋白的浓度，通过Adobe photoshop cs6分析得出重组蛋白的纯度;经Western Blot检测证实重组蛋白VP1能与相应抗体发生反应，具有良好的抗原性;最后，确定抗μ抗体最佳包被浓度和酶标抗原的最佳稀释倍数，初步建立了CVA-IgM的ELISA捕获检测方法。该方法特异性、灵敏度较好，有望用于柯萨奇病毒感染的早期诊断。

关键词：柯萨奇病毒a组 16型 VP1蛋白原核表达 ELISA捕获法

2002年上海儿童手足口病病例中肠道病毒71型和柯萨奇病毒a组16型的调查

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中华儿科杂志 2005年第9期43卷 648-652页

作者：杨智宏朱启镕李秀珠王晓红王建设胡家瑜唐伟崔爱利复旦大学附属儿科医院传染科 200032 上海市疾病预防控制中心免疫预防科中国疾病预防控制中心病毒预防控制所

目的对上海地区2002年4—6月儿童手足口病流行期间的手足口病患儿进行病原学调查。方法采集手足口病患儿的疱疹液、粪便、咽拭子进行病毒分离;分别用肠道病毒组合血清、肠道病毒71型(EV71)单价血清和柯萨奇病毒a组16型(CA16)单价血清对... 详细信息

目的对上海地区2002年4—6月儿童手足口病流行期间的手足口病患儿进行病原学调查。方法采集手足口病患儿的疱疹液、粪便、咽拭子进行病毒分离;分别用肠道病毒组合血清、肠道病毒71型(EV71)单价血清和柯萨奇病毒a组16型(CA16)单价血清对分离到的病毒进行中和试验定型;对不能定型的病毒株再分别用EV71和CA16的VP1基因的特异性引物进行RT-PCR鉴定。结果从72例患儿共采集102份标本,由其中67例患儿的91份标本分离到病毒;所有分离到的病毒株均不能用血清学方法进行定型;进一步经RT-PCR检测,58例为CA16,9例为EV71,二者之比为6.4∶1;其中2例的EV71病毒株经中国疾病预防控制中心进行序列分析,认为属新的C4基因亚型;在EV71阳性病例中1例并发脑炎,出现抽搐、休克、昏迷、呼吸衰竭。结论从该组手足口病患儿检测到的主要病原是CA16和EV71;在上海地区首次报道与EV71感染相关的手足口病合并重症脑炎病例。

关键词：手足口病肠道病毒属脑炎病毒性柯萨奇病毒a组肠道病毒71型 2002年上海地区阳性病例 16型

柯萨奇病毒a组天津分离株的分型鉴定及分子特征分析

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国际病毒学杂志 2016年第4期23卷 224-226,241页

作者：杨东靖李力吕莉琨李佳萌谭昭麟苏旭天津市疾病预防控制中心病原生物检测所天津300011

目的鉴定天津市手足口病病原体柯萨奇病毒a组2、4、5、6和10型,并分析其VP1区基因及分子流行病学特征.方法提取45株非EV71非CV-A16肠道病毒分离株核酸,利用RT-PCR法扩增其VP1基因并测序,然后根据VP1区基因核酸序列,进行肠道病毒型别... 详细信息

目的鉴定天津市手足口病病原体柯萨奇病毒a组2、4、5、6和10型,并分析其VP1区基因及分子流行病学特征.方法提取45株非EV71非CV-A16肠道病毒分离株核酸,利用RT-PCR法扩增其VP1基因并测序,然后根据VP1区基因核酸序列,进行肠道病毒型别鉴定和同源性分析,构建种系发生树.结果 45株非EV71非CV-A16肠道病毒天津分离株分别为6株柯萨奇病毒a组2型（Coxsackie virus A2,CV-A2）,14株CV-A4,3株CV-A5,8株CV-A6和14株CV-A10.柯萨奇病毒各型的株间核酸序列同源性均在80％以上,各型分离株与原型株的同源性均在71.2％～ 85.8％之间.天津各型分离株在种系发生树上均聚集于各自相对独立的分支,与国内流行株处在同一分支内,而与国外原型株处于不同的进化分支.结论柯萨奇病毒a组2、4、5、6和10型成为天津市手足口病的流行病原体,各型天津分离株株间核酸序列同源性较高,呈现一定的区域聚集性.

关键词：手足口病人肠道病毒柯萨奇病毒a组基因分型种系发生分析

GⅡB亚型柯萨奇病毒a组4型致疱疹性咽峡炎的临床表现及其序列分析

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中华传染病杂志 2018年第7期36卷 422-424页

作者：马红霞李懿卫海燕杜燕华李幸乐马宏黄学勇许汴利河南省疾病预防控制中心传染病所河南省传染病病原生物重点实验室郑州450016

人类肠道病毒（enteroviruses，EV）是小RNA病毒科的一个属，目前有100多种血清型。EV主要包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒（coxsackievirus，CV）、Echo病毒和新型EV，可导致手足口病（hand，foot，and mouth disease，HFMD）、无菌性... 详细信息

人类肠道病毒（enteroviruses，EV）是小RNA病毒科的一个属，目前有100多种血清型。EV主要包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒（coxsackievirus，CV）、Echo病毒和新型EV，可导致手足口病（hand，foot，and mouth disease，HFMD）、无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎、疱疹性咽峡炎等多种疾病。

关键词：柯萨奇病毒a组疱疹性咽峡炎序列分析临床表现脊髓灰质炎病毒 B亚型小RNA病毒科 4型

应用链霉亲和素-生物素偶联FITC法检测肠道病毒71型方法学实验探讨

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中华检验医学杂志 2010年第5期33卷 445-446页

作者：李立和王高生傅金瑞天津医科大学宝坻临床学院检验科 301800

手足口病是由多种肠道毒引起的传染病，多发生于婴幼儿。由于其主要临床表现是发热和手、足、口腔等部位出现疱疹，因此被称为手足口病。可引起手足口病的肠道病毒很多，有柯萨奇病毒a组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，肠道病毒71型... 详细信息

手足口病是由多种肠道毒引起的传染病，多发生于婴幼儿。由于其主要临床表现是发热和手、足、口腔等部位出现疱疹，因此被称为手足口病。可引起手足口病的肠道病毒很多，有柯萨奇病毒a组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，肠道病毒71型（EV71）等多达20多种。这些病毒尽管都可引起相同的疱疹症状，但其临床症状、并发症、

关键词：肠道病毒71型亲和素-生物素 FITC 方法学柯萨奇病毒a组实验检测偶联

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病毒唑与潘生丁治疗疱疹性咽炎疗效观察

现代医药卫生 1996年第4期12卷 54-55页

作者：董慧芬湖南省岳阳鹰山石化厂职工医院 414003

近年来我们应用病毒唑肌注和口服潘生丁治疗疱疹性咽炎取得较好疗效。现就1994年6月～1995年6月资料完整的43例报告如下: 1 临床资料 1.1 一般资料:43例均为门诊和观察室留察病人,

关键词：疱疹性咽炎潘生丁病毒唑疗效观察咽峡观察室察病柯萨奇病毒a组资料完整硬腊

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肠道病毒

国际内科双语杂志（中英文） 2006年第1期6卷 15-17,47-48页

作者： Peter Muir 汤蕊（译）盛瑞媛（校）英国布里斯托尔健康保护机构西南地区实验室的临床科学家不详

肠道病毒是小RNA病毒科中的一个K属，也包括鼻病毒和甲型肝炎病毒。肠道病毒通过粪口途径传播，并首先累及胃肠道，但它并非胃肠炎的主要原因。肠道病毒有64种血清型可感染人，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒a组（CVA）和B组（CVB）以... 详细信息

肠道病毒是小RNA病毒科中的一个K属，也包括鼻病毒和甲型肝炎病毒。肠道病毒通过粪口途径传播，并首先累及胃肠道，但它并非胃肠炎的主要原因。肠道病毒有64种血清型可感染人，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒a组（CVA）和B组（CVB）以及埃可（ECHO）病毒等。

关键词：肠道病毒小RNA病毒科脊髓灰质炎病毒柯萨奇病毒a组甲型肝炎病毒途径传播鼻病毒胃肠道胃肠炎血清型

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人类肠道病毒71型研究进展

公共卫生与预防医学 2012年第1期23卷 59-62页

作者：李静戴莹雷亚克霍细香湖北省疾病预防控制中心武汉430079

手足口病（Hand-Foot-Mouth disease,HFMD）是由肠道病毒引起的一种常见疾病,严重危害儿童健康。2008年5月被列入《中华人民共和国传染病防治法》法定丙类传染病。其病原体复杂,引发手足口病的肠道病毒有20多种（型）,包括柯萨奇病毒a组... 详细信息

手足口病（Hand-Foot-Mouth disease,HFMD）是由肠道病毒引起的一种常见疾病,严重危害儿童健康。2008年5月被列入《中华人民共和国传染病防治法》法定丙类传染病。其病原体复杂,引发手足口病的肠道病毒有20多种（型）,包括柯萨奇病毒a组的16、4、5、9、10型等,B组的2、

关键词：肠道病毒71型《中华人民共和国传染病防治法》柯萨奇病毒a组人类手足口病丙类传染病常见疾病儿童健康

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手足口病病原及流行病学研究进展

中华医学杂志 2009年第24期89卷 1724-1725页

作者：王燕上海交通大学附属儿童医院呼吸科 200040

手足口病（HFMD）是夏秋季婴幼儿和儿童的主要急性传染病之一，该病以口腔黏膜疹、皮肤溃疡和手、足部的疱疹为主要特征，具有播散快、流行性强的特点，并可在短时间内造成规模流行。自1958年，Robinson报道首例手足口病例以来，柯萨奇... 详细信息

手足口病（HFMD）是夏秋季婴幼儿和儿童的主要急性传染病之一，该病以口腔黏膜疹、皮肤溃疡和手、足部的疱疹为主要特征，具有播散快、流行性强的特点，并可在短时间内造成规模流行。自1958年，Robinson报道首例手足口病例以来，柯萨奇病毒a组16型（CoxA16）和肠道病毒71型（EV71）先后成为手足口病流行的主要病原。手足口病病情的轻重程度相差很大，EV71引发的重型手足口病具有中枢神经系统疾病的症状（脑炎、脑膜脑炎、脊髓灰质炎样肌麻痹），相对于CoxA16引发的病情更严重。

关键词：手足口病流行病学病原中枢神经系统疾病肠道病毒71型柯萨奇病毒a组脊髓灰质炎样脑膜脑炎