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虎杖查耳酮合酶基因RNAi载体的构建及其遗传转化

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中草药 2015年第3期46卷 412-417页

作者：柳忠玉赵树进长江大学生命科学学院湖北荆州434025 广州军区广州总医院广东广州510010

目的构建虎杖查耳酮合酶(Pc CHS1)基因的RNA干涉(RNAi)表达载体,获得Pc CHS1表达下调的转基因虎杖植株。方法根据Gen Bank中已知的Pc CHS1基因序列(EF090604),设计相应引物,克隆Pc CHS1基因核心保守序列。以Pc CHS1基因为靶基因,将长度5... 详细信息

目的构建虎杖查耳酮合酶(Pc CHS1)基因的RNA干涉(RNAi)表达载体,获得Pc CHS1表达下调的转基因虎杖植株。方法根据Gen Bank中已知的Pc CHS1基因序列(EF090604),设计相应引物,克隆Pc CHS1基因核心保守序列。以Pc CHS1基因为靶基因,将长度574 bp保守序列片段通过正、反2个方向插入表达载体p YLRNAi中,构建RNAi表达载体p YLRNAi-Pc CHS1。通过根癌农杆菌介导法将其导入虎杖茎尖组织。对获得的转基因植株,利用Northern blotting检测Pc CHS1基因表达水平,并应用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇苷的量。结果成功构建Pc CHS1基因RNA干涉表达载体,获得了5株转Pc CHS1基因干涉载体的阳性植株。转基因虎杖Pc CHS1基因表达水平显著下调,并且转基因植株中白藜芦醇苷量均得到显著提高,其中最高量是对照植株的3.8倍(P<0.05)。结论成功获得了干涉Pc CHS1基因表达下调的转化植株,抑制Pc CHS1基因的表达显著增加了转基因虎杖中白藜芦醇苷的量,为有效利用该基因提高虎杖白藜芦醇苷量奠定基础。

关键词：虎杖查耳酮合酶白藜芦醇苷 RNA干扰转基因

布渣叶查耳酮合酶基因全长cDNA克隆及其表达模式分析

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中草药 2018年第17期49卷 4118-4124页

作者：岳春华张初梅林爽黄奕辉李坤平广东药科大学药学院广东广州510006

目的克隆布渣叶查耳酮合酶基因(Mp CHS)全长c DNA,并对其在不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式进行分析。方法以布渣叶叶片总RNA逆转录合成c DNA为模板,根据其转录组数据设计特异引物序列,PCR扩增Mp CHS基因全长c DNA,经质粒连接... 详细信息

目的克隆布渣叶查耳酮合酶基因(Mp CHS)全长c DNA,并对其在不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式进行分析。方法以布渣叶叶片总RNA逆转录合成c DNA为模板,根据其转录组数据设计特异引物序列,PCR扩增Mp CHS基因全长c DNA,经质粒连接、转化、扩培,挑选阳性克隆测序、分析并构建原核表达载体。同时,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对Mp CHS基因的表达模式进行分析。结果成功克隆得到Mp CHS基因全长c DNA(Gen Bank:KY472608)。生物信息学分析表明其开放阅读框为1 176 bp,编码含391个氨基酸的蛋白,其相对分子质量为42 700,理论等电点6.11,具有CHS家族蛋白3个保守的功能活性位点(165 C、304 H和337 N)和特征多肽标签序列RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。系统进化树分析发现Mp CHS与可可、陆地棉等木本植物的亲缘关系比较近。RT-q PCR结果表明,Mp CHS基因在不同部位均有表达,在叶片中的表达量随着生长过程逐步降低。结论首次克隆得到Mp CHS基因,并分析了Mp CHS基因在布渣叶不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式,为Mp CHS基因的原核表达和功能验证奠定了基础,也为进一步解析布渣叶黄酮类生物合成途径提供了参考。

关键词：布渣叶查耳酮合酶基因克隆基因表达模式原核表达载体

小桐子低温诱导查耳酮合酶基因的克隆及其表达分析

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热带亚热带植物学报 2015年第4期23卷 370-378页

作者：王海波邹竹荣龚明云南师范大学生命科学学院生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室昆明650500 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院云南曲靖655011

为了解查耳酮合酶在小桐子(Jatropha curcas)抗冷性形成中的作用,基于小桐子低温锻炼转录组和数字基因表达谱数据,克隆了低温新诱导表达的小桐子查耳酮合酶基因(Jc CHS),并分析了该基因的表达特性和功能。结果表明,Jc CHS基因的c DNA全... 详细信息

为了解查耳酮合酶在小桐子(Jatropha curcas)抗冷性形成中的作用,基于小桐子低温锻炼转录组和数字基因表达谱数据,克隆了低温新诱导表达的小桐子查耳酮合酶基因(Jc CHS),并分析了该基因的表达特性和功能。结果表明,Jc CHS基因的c DNA全长为1386 bp,包含完整开放阅读框(ORF)1170 bp,编码389个氨基酸,Jc CHS的理论分子量为42.2 k Da、等电点为6.53,与蓖麻CHS蛋白序列的相似性高达93.6%,具有III型聚酮合酶家族保守的查耳酮合酶/对苯乙烯合酶结构域。半定量RTPCR分析表明,Jc CHS在小桐子各组织中都有表达,其中根的表达量较高。Jc CHS基因的表达能在一定程度上提高重组酵母菌的低温抵抗能力,这说明Jc CHS基因可能参与了小桐子的抗低温响应。

关键词：小桐子查耳酮合酶低温诱导表达基因克隆酵母

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越橘查耳酮合酶基因的克隆及表达分析

越橘查耳酮合酶基因的克隆及表达分析

作者：裴嘉博吉林农业大学

学位级别：硕士

花色素苷(anthocyanin)是越橘果实中最主要的生理活性物质之一,具有极强的抗氧化能力,有益于人体健康。而越橘果实成熟过程中花色素苷合成途径中的关键酶及其相关基因的分离和鉴定已经成为了解和调控其生物合成的重要方法。迄今为止,关... 详细信息

花色素苷(anthocyanin)是越橘果实中最主要的生理活性物质之一,具有极强的抗氧化能力,有益于人体健康。而越橘果实成熟过程中花色素苷合成途径中的关键酶及其相关基因的分离和鉴定已经成为了解和调控其生物合成的重要方法。迄今为止,关于越橘花色素苷生物合成途径中查耳酮合酶(chalcone synthase, CHS, EC2.***.1.74)基因cDNA全长的克隆及表达分析的研究尚未见到相关报道。本研究利用Illumina/Solexa测序技术对越橘果肉和果皮两份材料进行转录组测序分析,并以文库中高表达的Unigene23486(440bp)片段为基础,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)(?)cDNA末端快速扩增(RACE)技术从越橘品种‘北陆’(Vaccinium corymbosum L.)的果皮中克隆得到CHS基因的全长cDNA序列,并运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)技术对该基因在越橘果实发育过程中的基因表达情况进行了分析。为进一步研究越橘花色素苷形成的分子机制和培育越橘新品种奠定分子生物学基础。主要研究结果如下： 1采用改良的CTAB法,首次从越橘果实中成功地提取了高质量的总RNA,果肉和果皮中RNA浓度分别为80.0-130.0ng/μL和235.0-420.0ng/μL,产率分别为8.0-13.0μg/g和23.5-42.0μg/g,A260/A280分别为1.9-2.1和2.0-2.2,经琼脂糖凝胶电泳与核酸蛋白测定仪验证表明,该方法提取的越橘总RNA能满足RT-PCR和RACE等分子生物学实验要求。 2采用RT-PCR和RACE技术,首次从越橘果皮中成功地克隆了CHS基因的cDNA全长序列,命名为VcCHS, Genbank登陆号：JN654702。 3对VcCHS基因全长序列进行分析表明,VcCHS全长1438bp,包含107bp的5’非编码区(5’UTR)、71bp的3’非编码区(3’UTR)和一个长度为1260bp编码419个氨基酸的开放阅读框(ORF);进行氨基酸序列比对结果表明,VcCHS编码区保守性很强,越橘VcCHS基因与其它物种的CHS基因编码的氨基酸序列的同源性可高达86.76%;VcCHS编码的蛋白具有的两个保守域cd00831、PLN03173和一个特征多肽序列：RLMMYQQGCFAGGTVLR,并含有多个查耳酮合酶起功能作用所必需的活性位点Cys(C)164、His(H)303和Asn(N)336;通过系统进化分析发现越橘VcCHS与杜鹃花目植物亲缘关系最近。 4采用Real-time PCR技术,首次对越橘VcCHS基因的在越橘果实发育过程中不同时期(从花期到果实成熟期)和不同组织中(果肉和果皮)的表达量进行了检测。结果表明,在越橘整个果实发育过程中都能检测到VcCHS基因的表达,果实成熟期表达量高,花期和粉果期较低,绿果期最低;果皮组织中VcCHS基因表达量明显高于果肉组织。 5对越橘花色素苷含量进行测定,结果表明,在整个果实发育过程中都能检测到花色素苷,果实成熟时花色素苷的含量高,花期和绿果期最低;果皮组织中花色素苷的含量最高,且明显高于果肉组织。同时,发现从绿果期到果实成熟期,越橘花色素苷的蓄积量与VcCHS基因的表达量呈现一致性,二者都是在果皮组织中的含量达到最高。

关键词：越橘花色素苷查耳酮合酶

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黄芩查耳酮合酶基因的克隆及表达

黄芩查耳酮合酶基因的克隆及表达

作者：张成锁大连工业大学

学位级别：硕士

黄芩是一种具有杀菌消毒泻火等药效的常见中药。黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物,是对心血管疾病具有显著疗效的药用活性物质,黄芩中的特殊黄酮类化合物黄芩苷和黄芩素具有巨大... 详细信息

黄芩是一种具有杀菌消毒泻火等药效的常见中药。黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物,是对心血管疾病具有显著疗效的药用活性物质,黄芩中的特殊黄酮类化合物黄芩苷和黄芩素具有巨大的药用开发潜力。查耳酮合酶(chalcone synthase,CHS)是黄酮类物质的合成途径中的关键酶,它催化3分子的丙二酰辅酶A(malonyl Co A)与1分子的香豆酰Co A(coumaryl Co A)生成4,5,7-三羟基黄烷酮(narigenin chalcone)。因此,研究查耳酮合酶基因的克隆和外源表达既奠定了黄酮类物质合成的调控基础,也对查耳酮合酶功能研究与开发具有重要意义。本文从黄芩中克隆出了查耳酮合酶的c DNA,与p MDl8-T载体连接构建克隆载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白斑筛选出阳性单克隆菌落,经特异引物PCR、双酶切等对质粒鉴定后进行测序。重组质粒经测序表明目的基因片段全长1266 bp,正向插入p MDl8-T载体。生物信息学分析显示,目的基因序列具有一个完整的开放阅读框,编码421个氨基酸。CHS基因拟表达蛋白分子式为CHNOS,是一个相对分子质量为46060.02 Da的亲水性蛋白,其结构中含17个磷酸化位点,不包含跨膜结构,二级结构和三级结构中主要由α螺旋、无规则卷曲为主,属于稳定性的亲水性蛋白质。序列BLAST比对及系统进化树结果表明,目的基因序列与Chalcone synthase from Scutellaria baicalensis(AB008748.1)的查耳酮合酶序列相似度为100%,表明两者属于同一分支,亲缘关系相近,由此推断扩增的目的DNA片段是查耳酮合酶全基因序列。该质粒被命名为p MD18T-chs。构建了chs的表达载体p ET32(+)-chs,并导入BL21感受态细胞,在1mmol/L IPTG诱导下进行了蛋白表达,经SDS-PAGE分析,其相对分子质量约为46 KDa,与预期的大小基本一致。CHS基因的外源成功表达为黄酮类化合物代谢通路提供了新的研究思路,对其基因水平的研究,为黄芩类药用活性物质的微生物生产进一步研发奠定了基础。

关键词：黄芩查耳酮合酶基因克隆表达

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葡萄查耳酮合酶基因克隆及表达分析

葡萄查耳酮合酶基因克隆及表达分析

作者：蔡建平辽宁师范大学

学位级别：硕士

类黄酮物质的合成途径中的关键酶为查耳酮合酶(chalcone synthase,CHS),它催化3分子的丙二酰辅酶A(malonyl Co A)与1分子的香豆酰Co A(coumaryl Co A)生成4,5,7-三羟基黄烷酮(narigenin chalcone)。葡萄果实中含有极其丰富的营养物质,... 详细信息

类黄酮物质的合成途径中的关键酶为查耳酮合酶(chalcone synthase,CHS),它催化3分子的丙二酰辅酶A(malonyl Co A)与1分子的香豆酰Co A(coumaryl Co A)生成4,5,7-三羟基黄烷酮(narigenin chalcone)。葡萄果实中含有极其丰富的营养物质,其中包括多酚类物质,是一种大众性水果,常用于鲜食、制成果汁、葡萄干和葡萄酒等。但葡萄的抗逆性较差,易受环境影响,导致其产量和质量下降。为探讨CHS基因在葡萄植株防御体系中的作用,以及在次生代谢物合成中的作用,本实验进行如下研究:1.实验中,以NCBI和TIGR数据库为基础,采用RT-PCR技术,从葡萄中成功克隆得到两个查耳酮合酶(CHS)的c DNA开放阅读框(ORF)序列Vv CHS1和Vv CHS3。其中,Vv CHS1序列长1182bp,编码393个氨基酸;Vv CHS3序列长1170bp,编码389个氨基酸。2.在TIGR基因索引数据库中,以Grape和chalcone synthase为关键词进行搜索,查询出具有同源性的Vv CHS基因的所有EST序列。利用NCBI的ORF Finder程序,对得到的序列进行ORF预测,结果显示具有完整ORF的序列共5个,并利用软件对其进行生物信息学分析。分析内容包括:各种氨基酸的组成(种类及数量),以及蛋白的一级结构和理化性质(信号肽和跨膜结构域等)、疏水性、二级结构、三级结构,启动子中含有的顺式作用元件和进化分析等。3.葡萄叶片经过紫外线(UV)辐射和水杨酸(SA)喷洒处理后,采用实时荧光定量PCR技术,对Vv CHS1和Vv CHS3的表达量的变化情况进行分析。通过实验和数据分析处理,得出结论:在不同的处理条件下,二者的相对表达量均出现了具有一定的规律性的变化,结果显示为先上升后缓慢下降趋势,且都在12h处表达量达到最高值。这表明Vv CHS1和Vv CHS3基因通过调节表达量参与植物抗逆过程。本文对葡萄查耳酮合酶Vv CHS1和Vv CHS3基因克隆,以及对其所编码蛋白的理化性质和进化关系分析,为进一步研究该基因的功能及其在葡萄适应性机制中的调节作用以及代谢转换奠定了基础。

关键词：葡萄遗传查耳酮合酶基因克隆生物信息学分析实时荧光定量PCR

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葡萄查耳酮合酶基因克隆及其进化分析

天津农业科学 2015年第1期21卷 6-8页

作者：蔡建平侯和胜辽宁省植物生物工程重点实验室辽宁大连116029 辽宁师范大学生命科学学院辽宁大连116029

利用RT-PCR技术从葡萄中克隆到两个查耳酮合酶(CHS)的c DNA开放阅读框(ORF)序列,分别命名为Vv CHS1和Vv CHS3。其中,Vv CHS1序列长1 182 bp,编码393个氨基酸;Vv CHS3序列长1 170 bp,编码389个氨基酸。对两个CHS基因编码的氨基酸序列的... 详细信息

利用RT-PCR技术从葡萄中克隆到两个查耳酮合酶(CHS)的c DNA开放阅读框(ORF)序列,分别命名为Vv CHS1和Vv CHS3。其中,Vv CHS1序列长1 182 bp,编码393个氨基酸;Vv CHS3序列长1 170 bp,编码389个氨基酸。对两个CHS基因编码的氨基酸序列的分析表明,二者均具有CHS基因家族的保守结构域。多序列比对和系统发生分析结果表明,两个CHS基因与其他高等植物CHS基因具有较高的相似性,然而Vv CHS1和Vv CHS3在结构和功能上出现歧化。

关键词：葡萄遗传查耳酮合酶基因克隆进化分析

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转查耳酮合酶基因矮牵牛共抑制的研究

中国科学：C辑 2001年第5期31卷 401-407,T001,T002页

作者：李艳惠有为张仲凯黄兴奇李毅北京大学北大-耶鲁植物分子遗传学和农业生物技术联合研究中心蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室北京100871 西北大学化工系西安710069 云南省农业科学院生物技术研究所昆明650223

查耳酮合酶是花色素合成途径的一个关键酶. 将查耳酮合酶基因(chalcone synthase A, chsA)导入矮牵牛(Petunia hybrida)后, 转基因植株的外源与内源chsA基因一起发生共抑制, 导致花色改变. 将b-葡糖苷酸酶基因(uidA)连在chsA基因下游形... 详细信息

查耳酮合酶是花色素合成途径的一个关键酶. 将查耳酮合酶基因(chalcone synthase A, chsA)导入矮牵牛(Petunia hybrida)后, 转基因植株的外源与内源chsA基因一起发生共抑制, 导致花色改变. 将b-葡糖苷酸酶基因(uidA)连在chsA基因下游形成融合基因, 通过土壤农杆菌介导的途径转化矮牵牛. 利用GUS组织染色检测到共抑制的发生具有发育特异性, 在花组织发育时期开始发生, 发生的起始需要内源基因与外源基因的相互作用. RNA原位杂交实验表明, 共抑制的发生没有组织特异性, 且初步表明共抑制发生后, RNA可能是在细胞质中发生降解的.

关键词：查耳酮合酶共抑制矮牵牛原位杂交花色素转基因植株发育特异性

黄芩查尔酮合酶基因内含子在转基因烟草中对GUS活性调控的初步研究

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中国中药杂志 2011年第3期36卷 361-365页

作者：伍翀黄璐琦袁媛张楠林淑芳武汉工业学院湖北武汉430023 中国中医科学院中药研究所北京100700

目的:通过对黄芩查耳酮合酶基因内含子区域分析,初步分析其功能。方法:设计特异引物克隆黄芩查耳酮合酶内含子,并通过生物信息学方法预测其顺式作用元件组成;将内含子插入植物表达载体pCAMBIA1301中,转化烟草后观察GUS在各种非生物胁迫... 详细信息

目的:通过对黄芩查耳酮合酶基因内含子区域分析,初步分析其功能。方法:设计特异引物克隆黄芩查耳酮合酶内含子,并通过生物信息学方法预测其顺式作用元件组成;将内含子插入植物表达载体pCAMBIA1301中,转化烟草后观察GUS在各种非生物胁迫下的活性。结果:在查耳酮合酶内含子中预测了7种顺式元件;黑暗及高温条件下,GUS活性先上升(3h),后降低(9 h);10%PEG处理条件下,GUS活性上升;ABA及MeJA对GUS的表达的调节作用不明显。结论:黄芩查尔酮合酶基因内含子可能参与了外界环境对黄芩有效成分的调控。

关键词：黄芩查耳酮合酶内含子非生物胁迫