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融合柚苷酶体系的构建及性能研究

融合柚苷酶体系的构建及性能研究

作者：罗臣暮集美大学

学位级别：硕士

柚苷酶是一种具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶活性的多亚基糖苷水解酶,被广泛应用于食品和制药行业,其中,利用柚苷酶水解柚皮苷合成更具生物利用度和药用价值的柚皮素引起了研究者的兴趣。在柚苷酶水解柚皮苷过程中,柚皮苷首先通... 详细信息

柚苷酶是一种具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶活性的多亚基糖苷水解酶,被广泛应用于食品和制药行业,其中,利用柚苷酶水解柚皮苷合成更具生物利用度和药用价值的柚皮素引起了研究者的兴趣。在柚苷酶水解柚皮苷过程中,柚皮苷首先通过α-L-鼠李糖苷酶被水解为普鲁宁和鼠李糖,普鲁宁再通过β-D-葡萄糖苷酶被水解为柚皮素和葡萄糖。然而,由于天然来源柚苷酶活性不协调、稳定性不足和无法重复利用等缺陷致使柚皮苷的水解为柚皮素的过程受到阻碍。受到构建多功能融合酶能够提高酶催化效率和稳定性的启发,人工融合柚苷酶体系可能是一种弥补天然柚苷酶缺陷,提高柚皮素合成效率的理想途径。因此,本论文利用融合酶技术构建性能优良的融合柚苷酶体系,并将其应用于柚皮苷的高效水解。主要从以下三个方面进行研究:首先,选择来源于Spirochaeta thermophila的α-L-鼠李糖苷酶（St Rha）和来源于Pyrococcus furiosus的β-D-葡萄糖苷酶（Pf BGL）,分别通过直接融合、柔性连接肽（GGGGS）和刚性连接肽（EAAAK）介导融合的方式,构建融合柚苷酶DL-NGase、FL-NGase和RL-NGase。经酶学性质分析,融合柚苷酶中的St Rha和Pf BGL最适p H改变,且经过融合后的St Rha在酸性条件下的稳定性和Pf BGL在碱性条件下的稳定性均得到了提升;融合柚苷酶体系的温度稳定范围在35-65℃之间,DL-NGase在55℃和65℃下的残余酶活力分别保持在75%和50%以上。与天然来源柚苷酶相比,融合柚苷酶体系具有更为优良的热稳定性。动力学参数结果显示,融合柚苷酶中St Rha的K值在1.07-1.67 m M之间,k值在5.13-6.40 s之间,融合柚苷酶中Pf BGL的K值在0.64-0.70 m M之间,k值在12-14 s之间。其次,对融合柚苷酶体系的催化性能进行研究,并将其全细胞催化剂应用于柚皮素的催化制备。经催化性能分析,与混合游离酶体系相比,DL-NGase、FL-NGase和RL-NGase对柚皮苷的催化效率分别提高了49.8%、32.3%和35.9%;底物通道评估结果显示融合柚苷酶的普鲁宁累积浓度显著低于混合游离酶体系,这表明融合柚苷酶通过桥接双酶形成底物通道效应,使普鲁宁的传质效率提高。此外,将具有最佳催化性能的DL-NGase全细胞催化剂应用于柚皮素的催化制备,结果显示在p H 9.0、70℃、50 mg/m L全细胞条件下,融合柚苷酶全细胞催化剂可以将8 mg/m L柚皮苷在4 h内被完全转化为柚皮素,30 mg/m L柚皮苷经催化水解2 h后,柚皮素产量为6.4 mg/m L;将反应体系进一步扩大到100 m L,融合柚苷酶全细胞在6 h内催化30 mg/m L柚皮苷,其转化率可达到95.7%,柚皮素的产量为13.5mg/m L,柚皮素的时空产量为2.25 mg/m L/h,这是目前报道的柚皮素的最高产量。最后,利用金属配位作用与酶的多聚作用驱动融合柚苷酶DL-NGase形成聚集体。经微观结构表征,Mn-DL-NGase聚集体呈现出无序的颗粒状结构,且随着组装时间的增加,聚集体粒径增大;对融合柚苷酶聚集体组装条件进行优化,当Mn浓度为5 m M、组装时间为10 min时,融合柚苷酶聚集体酶活力提高了7.8%;经酶学性质表征,组装前后的最适p H均为7.0,最适温度分别为70℃、75℃;融合柚苷酶聚集体的p H、温度稳定性均有一定程度的提升,在70℃下半衰期提高了30 min,热变性温度提高了5℃。将融合柚苷酶聚集体应用于水解催化柚皮苷,反应前30 min,聚集体的柚皮素产量是游离融合酶的3.3倍。在反应180 min后,融合柚苷酶聚集体对柚皮苷的水解效率为96.4%,产量达1.14mg/m L。因此,融合柚苷酶聚集体的形成具有良好的热稳定性和较好的操作稳定性,能够为柚皮素的高效合成提供有效可行的生产方案。

关键词：柚苷酶融合酶酶聚集体柚皮苷柚皮素

产柚苷酶菌株改良、性质及其在柑橘酒中的应用研究进展

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江苏农业学报 2023年第6期39卷 1427-1436页

作者：林静罗莲杨爽李萍张志清陈安均刘兴艳四川农业大学食品学院四川雅安611130

柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶组成的复合酶,不同来源的柚苷酶在酶学性质和结构特性上有一定的差异,目前柚苷酶的主要来源是真菌,真菌来源的柚苷酶最适温度为50~60℃,最适pH值范围为4.0~6.0,但柚苷酶的整体结构、两种单... 详细信息

柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶组成的复合酶,不同来源的柚苷酶在酶学性质和结构特性上有一定的差异,目前柚苷酶的主要来源是真菌,真菌来源的柚苷酶最适温度为50~60℃,最适pH值范围为4.0~6.0,但柚苷酶的整体结构、两种单组分酶的比例构成,至今尚无详尽的报道。柚苷酶作用于柑橘酒时,不仅能脱苦,还能提高柑橘酒的香气,其在提高柑橘酒的品质方面具有潜在的应用价值。本文对柚苷酶的酶学特性、结构特性、柑橘酒中的苦味物质及柚苷酶在柑橘酒中的应用等进行了综述,以期为柚苷酶的进一步研究和应用提供理论支持。

关键词：柚苷酶酶学性质柑橘酒柚皮苷脱苦增香

产柚苷酶菌株的筛选及其粗酶液对黄果柑酒脱苦效果研究

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产柚苷酶菌株的筛选及其粗酶液对黄果柑酒脱苦效果研究

作者：林静四川农业大学

学位级别：硕士

黄果柑是雅安特色水果,具有营养丰富、极丰产、极晚熟等特点。但目前黄果柑的消费以鲜食或简单加工为主,消费方式单一,为了合理、深入的利用黄果柑资源,提高黄果柑的加工率,将其加工成黄果柑酒是一条有效途径。黄果柑酒是以黄果柑为主... 详细信息

黄果柑是雅安特色水果,具有营养丰富、极丰产、极晚熟等特点。但目前黄果柑的消费以鲜食或简单加工为主,消费方式单一,为了合理、深入的利用黄果柑资源,提高黄果柑的加工率,将其加工成黄果柑酒是一条有效途径。黄果柑酒是以黄果柑为主要原料,经酒精发酵、脱苦、陈酿、澄清等工艺制成的低度果酒。在实验室前期的研究中发现黄果柑酒具有强烈的苦味,严重影响了黄果柑酒的口感,为解决这一问题,本研究先确定了黄果柑果实和黄果柑酒中的主要苦味物质,并从腐烂的黄果柑和堆积过腐烂黄果柑的土壤中筛选出一株能产柚苷酶的菌株,对其产酶特性和产酶条件进行了研究,然后将优化后的发酵粗酶液应用于黄果柑酒的脱苦。主要研究结果如下:(1)主要苦味物质的确定。采用高效液相色谱法测定黄果柑果实和黄果柑酒中的苦味物质,结果显示六种苦味物质在果实中主要集中在果皮和囊衣中,且果皮和囊衣中的苦味物质含量均远高于果汁。对黄果柑汁和黄果柑酒中各苦味物质含量分析发现芸香柚皮苷含量远高于其它五种苦味物质,其在汁和酒中的含量分别为539.62、745.99 mg/L,结合各苦味物质含量及阈值分析可发现芸香柚皮苷是黄果柑果汁和黄果柑酒中最主要的苦味物质。(2)产柚苷酶菌株的筛选鉴定及产酶特性初步研究。采用透明圈筛选法从腐烂的黄果柑表皮和堆积过腐烂黄果柑的土壤中共筛选得到86株菌株,其中能产柚苷酶的菌株有21株,通过测定HC值、摇瓶复筛,选择菌株A-5作为下一步试验的出发菌株,经测定菌株A-5产柚苷酶的酶活为218.52 U/m L;对菌株A-5连续培养5代,发现其酶活维持在211.68±12.32 U/m L,具有较好的稳定性;通过显微镜形态、菌落形态观察及真菌ITS测序,确定菌株A-5为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。对菌株A-5的产酶特性进行初步研究,结果表明菌株A-5产生的柚苷酶属于胞外酶、诱导酶;且菌株A-5是好氧型微生物,其产酶过程需要氧气的参与。(3)菌株A-5的发酵条件优化研究。在单因素试验基础上,进行了正交优化,得到其最佳发酵条件为:培养时间4 d,接种量10%,培养基初始p H为5.0,培养温度为30℃。在此条件下菌株A-5发酵液中柚苷酶的酶活为313.51 U/m L,比优化前提高了43.47%。(4)菌株A-5发酵粗酶液对黄果柑酒的脱苦效果及品质影响研究。以不添加粗酶液为对照,对比了发酵前添加粗酶液、发酵后添加粗酶液对黄果柑酒脱苦效果及品质的影响。研究结果发现对照组中芸香柚皮苷含量为588.83 mg/L,发酵后添加粗酶液的酒样中芸香柚皮苷含量为58.79 mg/L,发酵前添加粗酶液的酒样中的芸香柚皮苷已不能检出,说明菌株A-5发酵粗酶液能够有效去除黄果柑酒中的苦味物质芸香柚皮苷,且发酵前添加粗酶液更有利于苦味物质含量降低;差异对照感官结果显示脱苦后的酒样与对照酒样在苦味强度方面具有极显著的差异;对黄果柑酒理化指标分析发现,发酵前脱苦和发酵后脱苦对黄果柑酒基础指标和高级醇含量无显著性影响;脱苦后的酒样比对照酒样有更好的抗氧化活性;在感官特性上,发酵前脱苦酒样与对照酒样品质更为接近。结合基础理化指标、抗氧化指标、高级醇及感官评价,发现发酵前添加粗酶液更有利于保持黄果柑酒的品质。

关键词：黄果柑酒柚苷酶菌株筛选条件优化酶法脱苦

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柚苷酶固体酶制剂制备及贮藏稳定性的研究

中国食品学报 2013年第8期13卷 68-74页

作者：杜希萍倪辉黄高凌杨远帆蔡慧农肖安风集美大学生物工程学院福建厦门361021 福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心福建厦门361021 厦门市食品生物工程技术研究中心福建厦门361021

以黑曲霉DB056发酵液为原料,研究柚苷酶固体酶制剂的制备工艺及其贮藏稳定性。结果表明:柚苷酶发酵液经预处理、浓缩、喷雾干燥后制成柚苷酶固体酶制剂。硫酸铵沉淀和乙醇沉淀对柚苷酶活力影响较大,α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的回收... 详细信息

以黑曲霉DB056发酵液为原料,研究柚苷酶固体酶制剂的制备工艺及其贮藏稳定性。结果表明:柚苷酶发酵液经预处理、浓缩、喷雾干燥后制成柚苷酶固体酶制剂。硫酸铵沉淀和乙醇沉淀对柚苷酶活力影响较大,α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的回收率较低;超滤浓缩法对柚苷酶活力影响较小,不同浓缩倍数的粗酶液α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的回收率均很高,大于97%。温度、空气和湿度对柚苷酶固体酶制剂稳定性影响较大,光照和紫外线对其稳定性影响较小。实际应用中,柚苷酶固体酶制剂应尽可能低温真空保存。

关键词：柚苷酶固体酶制剂贮藏稳定性高效液相色谱法

产柚苷酶菌株筛选及发酵与酶解工艺和脱苦应用

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产柚苷酶菌株筛选及发酵与酶解工艺和脱苦应用

作者：陈琳华南理工大学

学位级别：硕士

黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的次级代谢产物,具有抗氧化、抗病毒、抗癌、降血脂等药理活性,但黄酮类化合物的溶解性差,导致其生物利用度低。深共晶溶剂是一种具有良好溶解性的绿色试剂,已有研究利用深共晶溶剂溶解芦丁和橙皮苷... 详细信息

黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的次级代谢产物,具有抗氧化、抗病毒、抗癌、降血脂等药理活性,但黄酮类化合物的溶解性差,导致其生物利用度低。深共晶溶剂是一种具有良好溶解性的绿色试剂,已有研究利用深共晶溶剂溶解芦丁和橙皮苷,尚未发现有研究将深共晶溶剂用于增加柚皮苷的溶解性。柚皮苷是一种二氢黄酮类化合物,是柑橘类果汁中的主要苦味物质,影响果汁的口感和商业价值。柚苷酶可以高效地作用于柚皮苷末端的鼠李糖基和葡萄糖基,生成无苦味的柚皮素。目前市场上的柚苷酶酶活较低,来源有限。本工作旨在从玳玳花土壤中筛出产柚苷酶的菌株;通过对发酵条件进行优化提高柚苷酶酶活;利用深共晶溶剂溶解柚皮苷,探究深共晶溶剂对柚苷酶酶解柚皮苷的影响;最后将柚苷酶用于葡萄柚汁脱苦。主要研究结果及结论摘要如下:一、本研究以玳玳花土壤为菌种来源,通过稀释涂布培养和划线分离培养筛选出4株单菌株,对酶活进行测定,只有2株产柚苷酶,分别为菌株C10和菌株C13。其中菌株C13产的α-L-鼠李糖苷酶酶活过低,故选择菌株C10进行后续研究。通过形态特征观察、分子生物学鉴定、生理生化试验等,确定菌株C10为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),命名为Serratia marcescens C10。二、研究柚皮苷浓度、碳源、接种量、初始p H、装液量、发酵温度和发酵时间对菌株C10发酵产柚苷酶酶活的影响,根据单因素实验结果设计响应面优化实验预测菌株C10的最佳发酵条件:柚皮苷浓度0.09 mg/m L、接种量5.5%、初始p H 6.0、装液量50m L、发酵时间60 h和发酵温度30℃。在最佳条件下进行验证试验,柚苷酶的酶活为30.81 U/m L。三、本实验通过加热法制备了5种不同的深共晶溶剂,通过FT-IR验证深共晶溶剂是通过氢键缔合形成。探究深共晶溶剂种类、p H、温度、柚皮苷浓度、糖类、反应时间对柚苷酶酶解柚皮苷效率的影响。结果表明:5种深共晶溶剂中柚苷酶在氯化胆碱-丙二醇中酶解柚皮苷的能力最强。在p H 6.0、反应温度40℃、柚皮苷浓度2 mg/m L和反应时间160 min的条件下,柚皮苷的转化率为99%。此外柚苷酶还可以酶解新橙皮苷、芦丁和柚皮苷二氢查尔酮,其中新橙皮苷和柚皮苷二氢查尔酮的转化率分别为94.77%和99.46%,芦丁的转化率仅为23.24%。四、以柚苷酶酶解新鲜葡萄柚汁,研究反应温度、反应时间、加酶量和果汁p H对柚苷酶酶解葡萄柚汁脱苦效果的影响,并进行正交实验设计优化酶解条件:反应温度55℃、反应时间90 min、柚苷酶酶量1.25 m L和果汁p H 5.0。在最佳酶解条件下,柚皮苷脱除率为88.85%±0.75%,感官评分为80.5分,酶解前的葡萄柚汁感官评分为58.9分,葡萄柚汁苦味明显下降。

关键词：柚苷酶粘质沙雷氏菌发酵优化深共晶溶剂柚汁脱苦

解淀粉芽孢杆菌11568产柚苷酶发酵条件的优化

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中国食品学报 2016年第7期16卷 80-89页

作者：郦金龙朱运平滕超李秀婷北京食品营养与人类健康高精尖创新中心北京工商大学北京100048 北京市食品添加剂工程技术研究中心北京100048 北京市食品风味化学重点实验室北京100048

利用前期筛选获得的一株解淀粉芽孢杆菌11568进行液体发酵产柚苷酶,考察不同碳源、氮源、p H值、培养温度、摇瓶转速、金属离子种类与浓度等对该菌株产柚苷酶能力的影响。通过单因素考察、响应面分析可知,解淀粉芽孢杆菌11568液体发酵... 详细信息

利用前期筛选获得的一株解淀粉芽孢杆菌11568进行液体发酵产柚苷酶,考察不同碳源、氮源、p H值、培养温度、摇瓶转速、金属离子种类与浓度等对该菌株产柚苷酶能力的影响。通过单因素考察、响应面分析可知,解淀粉芽孢杆菌11568液体发酵产柚苷酶的最优培养基成分(g/L)为:麦芽糖15.1,胰蛋白胨10,(NH4)2HPO420,Na Cl 10,酵母提取物5;最优发酵条件为:培养温度40.9℃,摇床转速180 r/min,p H 7.5,发酵时间48 h。在最优条件下,柚苷酶活力达到201.12 U/m L,是优化前的2.4倍。

关键词：解淀粉芽孢杆菌柚苷酶液体发酵发酵条件优化

高产柚苷酶菌株米曲霉的诱变育种及发酵条件优化

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中国食品学报 2018年第8期18卷 115-124页

作者：朱运平郗梦露李秀婷张文琪王西汐食品营养与人类健康北京高精尖创新中心(北京工商大学) 北京100048 食品添加剂与配料北京高校工程研究中心(北京工商大学) 北京100048 食品质量与安全北京实验室(北京工商大学) 北京100048

以土样中筛选的1株产胞外柚苷酶菌株米曲霉11250为出发菌株,采用紫外诱变、亚硝酸钠化学诱变及紫外-亚硝酸钠复合诱变3种方法进行诱变育种,通过透明圈初筛以及液体摇瓶发酵复筛,最终选育出1株胞外柚苷酶产酶活力较高的突变菌株UN2,该菌... 详细信息

以土样中筛选的1株产胞外柚苷酶菌株米曲霉11250为出发菌株,采用紫外诱变、亚硝酸钠化学诱变及紫外-亚硝酸钠复合诱变3种方法进行诱变育种,通过透明圈初筛以及液体摇瓶发酵复筛,最终选育出1株胞外柚苷酶产酶活力较高的突变菌株UN2,该菌株产胞外柚苷酶活力达147U/mL,为原始菌株的2.3倍,经5代传代,其产酶能力稳定在(147±0.8)U/mL。采用单因素试验和响应面设计Box-Behnken design试验相结合的方法进行产柚苷酶的摇瓶发酵培养基配方优化,对影响菌株UN2发酵产酶的碳源、氮源、培养基初始pH、温度等条件做单因素试验和响应面法试验。结果表明:该菌株的最佳产酶条件:麦芽糖2.0 g/100 mL,牛肉蛋白胨3.0g/100 mL,初始pH 5.7,培养温度30℃。在此条件下,柚苷酶活力达到251 U/mL,是未优化前的1.7倍。结论 :通过培养基优化,大幅度提高了米曲霉11250液体发酵产柚苷酶的酶活力。

关键词：柚苷酶米曲霉诱变响应面优化

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真菌共培养强化柚苷酶生产的工艺优化

高校化学工程学报 2017年第2期31卷 394-400页

作者：廉萌李佥田晶费旭徐龙权李坤峰朱振大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034 大连工业大学分析中心辽宁大连116034

共培养技术作为一种新型发酵策略,能够有效提高目标产物产量,在生化、制药和食品工业具有很好的应用前景。研究采用平板透明圈法对产酶菌种进行筛选,进一步考察各发酵参数对真菌共培养液态发酵产柚苷酶过程的影响。结果表明,黑曲霉FFCC ... 详细信息

共培养技术作为一种新型发酵策略,能够有效提高目标产物产量,在生化、制药和食品工业具有很好的应用前景。研究采用平板透明圈法对产酶菌种进行筛选,进一步考察各发酵参数对真菌共培养液态发酵产柚苷酶过程的影响。结果表明,黑曲霉FFCC uv-11与根霉FFCC 3201为较适宜的菌种组合,当接种时间间隔为36 h,接种量为10%,接种比例为2:1,发酵初始pH为5.5,共培养发酵时间为72 h时,柚苷酶活力最大可达733.19 U·m L^(-1),是未优化条件下柚苷酶酶活的2.22倍。研究为进一步探索柚苷酶共培养发酵过程、提高柚苷酶酶活提供了基础数据,同时对推动柚苷酶工业化进程具有重要意义。

关键词：共培养柚苷酶酶活测定发酵过程

一株产柚苷酶的罗伦隐球酵母的鉴定及柚苷酶表达

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微生物学报 2010年第9期50卷 1202-1207页

作者：李利君倪辉肖安风蔡慧农集美大学生物工程学院厦门361021 厦门市食品生物工程技术研究中心厦门361021

【目的】对一株新分离的、产生柚苷酶的疑似酵母菌株Jmudeb008进行鉴定,确定其分类的种属关系,阐明葡萄糖对该菌株表达柚苷酶的影响。【方法】利用形态观察、核酸分析及生理生化实验对Jmudeb008进行种属鉴定;用含有0.5g/L柚皮苷及不同... 详细信息

【目的】对一株新分离的、产生柚苷酶的疑似酵母菌株Jmudeb008进行鉴定,确定其分类的种属关系,阐明葡萄糖对该菌株表达柚苷酶的影响。【方法】利用形态观察、核酸分析及生理生化实验对Jmudeb008进行种属鉴定;用含有0.5g/L柚皮苷及不同浓度葡萄糖的培养基培养Jmudeb008,通过检测培养过程柚皮苷、柚皮素及葡萄糖浓度的变化研究葡萄糖对Jmudeb008表达柚苷酶的影响。【结果】Jmudeb008的菌落形态及个体形态都与典型的酵母相似,其26SrDNAD1/D2区域和5.8SrDNA-ITS区域的序列与罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）的同源性为99%,葡萄糖发酵试验阴性,尿酶试验阳性,重氮基蓝B试验阳性、硝酸盐还原试验阴性符合该菌种特性,因此鉴定为罗伦隐球酵母。Jmudeb008在以柚皮苷为唯一碳源的培养基中或当培养基中葡萄糖消耗完以后会分泌柚苷酶,而有葡萄糖存在时不分泌柚苷酶。【结论】分离得到了能产柚苷酶的罗伦隐球酵母,该酵母产柚苷酶受葡萄糖分解代谢调节。

关键词：柚苷酶罗伦隐球酵母鉴定葡萄糖