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基于SSR的中国柑桔溃疡病菌遗传多样性研究

基于SSR的中国柑桔溃疡病菌遗传多样性研究

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作者：卢小林重庆大学

学位级别：硕士

柑桔溃疡病(Citrus Bacterial Canker Disease, CBCD)是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种引起的柑桔毁灭性病害，主要侵染芸香科柑桔属、枳属等植物。该病在全球许多柑桔种植国家都有分布。上世纪90年代以来，柑桔溃疡病菌的分类地位发... 详细信息

柑桔溃疡病(Citrus Bacterial Canker Disease, CBCD)是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种引起的柑桔毁灭性病害，主要侵染芸香科柑桔属、枳属等植物。该病在全球许多柑桔种植国家都有分布。上世纪90年代以来，柑桔溃疡病菌的分类地位发生了比较大的变化。近年来，依据16SrRNA基因和多基因分类新方法和培养特征等综合分类方法，原来分类系统中的A，B/C/D和E菌系，被划分为三个不同细菌种下的三个亚种：柑桔黄单胞柑桔亚种(Xanthomnas citri subsp.citri)、棕色黄单胞莱檬亚种(X. fuscans subsp.aurantifolii)和苜蓿黄单胞枳柚亚种(X.alfalfaesubsp. citrumelonis)。中国的研究人员对一些省市的柑桔溃疡病菌在生理生化和分子水平上进行了研究，发现中国柑桔溃疡病菌属于新分类系统中的柑桔黄单胞柑桔亚种(Xanthomnas citri subsp.citri)。我国幅员辽阔，柑桔种植面积大，各种植区地理环境差别大，种苗来源广，加之近年来柑桔产业发展迅速，种苗调运频繁，因此，柑桔溃疡病菌可能存在适应性、致病性、流行性上的差异。为此，本课题采集中国各柑桔主产区罹病柑桔叶片、枝条和果实等材料，结合组织分离、纯化、并经致病性与分子鉴定等获得和确认柑桔溃疡病菌菌株，利用柑桔溃疡病菌全基因组筛选的5对简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)分子标记，进行PCR扩增、测序比对，分析来自于不同地区、不同环境条件柑桔溃疡病菌的群体结构和遗传多样性。为在分子水平上，研究来自中国不同地理来源的柑桔溃疡病菌的分化、变异，明确中国柑桔溃疡病菌的遗传多样性和群体结构以及我国柑桔溃疡病菌的遗传变异的现状和成因，为探讨我国溃疡病菌的起源与传播途径提供一定的理论依据。研究获得的主要结果如下： ①从10个省(市/自治区)，不同地理分布、不同柑桔品种采集柑桔样品上百份，经分离纯化，获得51个不同分离菌株，并经病菌形态、分子鉴定并离体接种柑桔叶片，确定所分离纯化到的病菌为柑桔溃疡病菌。 ②采用串联重复序列软件，在柑桔溃疡病菌306标准菌株基因组序列中寻找合适的串联重复序列，最后选用了5个多态性高的串联重复序列(SSR)作为分子标记用于中国柑桔溃疡病菌的遗传多样性分析。 ③根据选定的5对特异性引物，分别以所获得的51株柑桔溃疡病菌株及Xcc306标准菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，共计扩增出44条等位基因条带，每个位点的等位基因数为5-12条，平均每个位点8.8条;5个位点的Nei’s基因多样性指数分别为0.83、0.64、0.86、0.86、0.54，平均为0.75。 ④52株柑桔溃疡病菌中，02位点基因型为(AACAGCC)和05位点基因型为(TGGGGAT)的菌株所占比率最高。这两种基因型出现在同一菌株中的比率为30.8%，高于其他的基因型，所以这两种基因型在菌株中占绝对优势。 ⑤聚类分析发现52个菌株可划分为6个主要的类群。这些类群与样品的地理来源有很高的相关性，而与柑桔品种关系不大。江西、福建、浙江的菌株亲缘关系比较近，这三个地区与其他省市菌株的亲缘关系较远。结论：本研究中选择的SSR分子标记均能很好的用于研究我国柑桔溃疡病菌的群体结构和遗传变异。中国柑桔溃疡病菌在分子水平上具有丰富的遗传多样性。02位点基因型为(AACAGCC)和05位点基因型为(TGGGGAT)的菌系为优势菌系。病菌的群体结构与地理来源有很大的相关性，采集自同一地理区域的菌株多聚为一类，亲缘关系较近;不同的基因型与柑桔品种间没有明显的相关性。

关键词：柑桔黄单孢菌简单重复序列（SSR）遗传多样性

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