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枸橼c-05抗柑橘溃疡病相关PRR基因LYK5的初步鉴定

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分子植物育种 2020年第9期18卷 2814-2826页

作者：郝晨星符红艳严佳文戴素明吴启马先锋李大志龙桂友邓子牛湖南农业大学园艺学院国家柑橘改良中心长沙分中心长沙410128

为筛选出抗溃疡病病菌相关PRR(Pattern Recognition Receptors)基因,本研究以接种了溃疡病菌Xcc的抗病种质枸橼c-05(JY c-05)和感病种质冰糖橙(BTc)、酸橙(Sc)及早蜜椪柑(ZM)为研究对象,利用荧光定量PcR分析PRR基因的表达,结果显示PRR... 详细信息

为筛选出抗溃疡病病菌相关PRR(Pattern Recognition Receptors)基因,本研究以接种了溃疡病菌Xcc的抗病种质枸橼c-05(JY c-05)和感病种质冰糖橙(BTc)、酸橙(Sc)及早蜜椪柑(ZM)为研究对象,利用荧光定量PcR分析PRR基因的表达,结果显示PRR基因中的LYK5(LYSIN MOTIF-cONTAINING REcEPTOR-LIKE KINASE5)基因在枸橼c-05中表达上调而在其它感病种质中表达下调,表明LYK5基因可能与枸橼c-05抗溃疡病相关;对枸橼c-05和感病种质LYK5核酸序列及氨基酸序列进行差异分析,发现枸橼c-05 LYK5基因与冰糖橙、来檬(LM)有差异,但是与大香橼(DXY)和爪哇柠檬(ZWNM)LYK5基因相似度为100%,说明基因结构差异不是枸橼c-05的LYK5基因参与抗溃疡病的原因;进一步对其蛋白关键结构域进行比较分析,显示LYK5蛋白质信号肽第16位氨基酸、LysM基序区域(第203号氨基酸,第209号氨基酸)和蛋白激酶结构域(第394位,第449位,第468位,第492位,第647位氨基酸)存在差异;同时,对其三级结构进行比对发现枸橼c-05 LYK5蛋白结构与感病种质冰糖橙、来檬、爪哇柠檬和大香橼并无差异,进一步表明LYK5基因参与枸橼c-05抗溃疡病的过程不是由其蛋白结构差异所致。分析枸橼c-05和其他柑橘种质的LYK5启动子,大多数元件的差异不能区分抗病和感病柑橘种质,只有枸橼c-05缺失激活分生组织特异性调控元件,其他柑橘种质均有该元件,这是不是LYK5在接种Xcc的不同柑橘中表达差异的原因还有待进一步探究。

关键词：柑橘溃疡病枸橼c-05 模式识别受体 LYK5

冰糖橙与枸橼c-05对溃疡病菌生长特性的影响

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中国农业科学 2015年第7期48卷 1383-1391页

作者：葛红娟龙桂友戴素明李大志李娜邓子牛湖南农业大学园艺园林学院/国家柑橘改良中心长沙分中心/湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室

【目的】采用新的接种方式,比较冰糖橙与枸橼c-05叶片对溃疡病菌生长特性的的影响,探讨冰糖橙与枸橼c-05对溃疡病菌敏感度的差异性。【方法】将完全展开、颜色淡绿的冰糖橙与枸橼c-05叶片进行75%酒精和1%Na cl O消毒并切割后,分别与溃... 详细信息

【目的】采用新的接种方式,比较冰糖橙与枸橼c-05叶片对溃疡病菌生长特性的的影响,探讨冰糖橙与枸橼c-05对溃疡病菌敏感度的差异性。【方法】将完全展开、颜色淡绿的冰糖橙与枸橼c-05叶片进行75%酒精和1%Na cl O消毒并切割后,分别与溃疡病菌在离体条件下共培养,观察叶片在MT培养基(对照)、MT中间嵌入NYGA培养基(MA)中对溃疡病菌生长的影响;分别提取冰糖橙和枸橼c-05叶片的粗提液,并以25%、50%和75%的比例添加至MT培养基中,观察冰糖橙和枸橼c-05叶片提取液分别对溃疡病菌生长的影响;同时以不同比例的叶片粗提液添加至NYGB培养基中,观察冰糖橙与枸橼c-05叶片提取液分别对溃疡病菌胞外多糖含量的影响。【结果】Xac在培养冰糖橙叶片的MT培养基中生长迅速,接种1周后即出现Xac的增殖现象,菌斑直径均值比对照大0.5 mm;接种2周后菌斑直径均值为5.27 mm,几乎是对照的3倍;而2—3周为Xac的急速生长期,菌斑直径由5.27 mm快速增长至13.41 mm,是对照菌斑直径的5倍多;3周后菌斑生长缓慢趋于平稳;各个时间点的菌斑直径与对照相比均达到极显著差异水平。在培养冰糖橙叶片的MA培养基中,Xac生长1 d后菌斑直径均值为4.58 mm,小于对照的6.19 mm;接种3 d后Xac继续生长,菌斑直径几乎与对照组相同,差异不显著;但是在接种5 d后,菌斑直径快速增长至21.31 mm,大于对照组的16.33 mm,3个菌斑长势连在一起,两者差异达到极显著水平。冰糖橙的叶片提取液对溃疡病菌的生长及胞外多糖含量均有促进作用,随着其添加浓度的增加,促进效果越明显,与对照相比均可达到极显著水平。Xac在培养枸橼c-05叶片的MT培养基中生长较为缓慢,在接种1周后菌斑直径与对照相比差异不显著;2周后菌斑直径约为对照的一半;3周时,菌斑直径均值为2.06 mm,小于对照的2.62mm;2周和3周时的菌斑直径与对照相比均达到显著水平。在培养枸橼c-05叶片的MA培养基中,Xac生长较为缓慢,菌斑直径均小于对照组,在1、3和5 d时与对照相比均达到极显著水平。枸橼c-05的叶片提取液对溃疡病菌生长和胞外多糖含量的影响不大,与对照相比均差异不显著。【结论】冰糖橙叶片中存在可促进溃疡病菌的生长、增加胞外多糖含量的物质,这种物质可能突破了其自身免疫系统,导致其对Xac高度敏感而极易感病。枸橼c-05叶片与溃疡病菌共培养时,分泌抑制溃疡病菌生长的物质,使得枸橼c-05对Xac具有较低敏感度而表现抗性。

关键词：冰糖橙枸橼c-05 溃疡病菌叶片提取液胞外多糖

响应柑橘溃疡病菌侵染的枸橼c-05抗性基因PR4A的鉴定

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响应柑橘溃疡病菌侵染的枸橼C-05抗性基因PR4A的鉴定

作者：郝晨星湖南农业大学

学位级别：硕士

柑橘溃疡病是一种危害全球所有商业化柑橘品种的世界性检疫性病害,感染柑橘溃疡病后,将导致柑橘树叶片提前脱落,使柑橘减产,是对柑橘产业最具毁灭性危害的病害之一。目前还未发现完全治愈柑橘溃疡病的方法,生产上通常采用铜制剂抑制柑... 详细信息

柑橘溃疡病是一种危害全球所有商业化柑橘品种的世界性检疫性病害,感染柑橘溃疡病后,将导致柑橘树叶片提前脱落,使柑橘减产,是对柑橘产业最具毁灭性危害的病害之一。目前还未发现完全治愈柑橘溃疡病的方法,生产上通常采用铜制剂抑制柑橘溃疡病菌生长来控制柑橘溃疡病的传播,因此,抗病育种成为辅助柑橘产业抵抗柑橘溃疡病的关键方法。经全球对近百种柑橘种质的筛选,发现了部分耐柑橘溃疡病的种质,但未能得到抗病的资源,本课题组经近十年筛选,获得了对柑橘溃疡病具有稳定抗性的柑橘种质——枸橼c-05,为将其应用到柑橘的抗病育种中,需先探明其对柑橘溃疡病的抗性机制。本研究以抗病种质枸橼c-05为试验材料,不同的感病种质作为对照,筛选与枸橼c-05抗柑橘溃疡病相关的PR4基因,并分析其在枸橼c-05抗病反应中对柑橘溃疡病菌的响应机制。主要研究结论如下:1.通过冰糖橙及枸橼c-05的转录组数据对比分析,发现PR1-1、PR2-1、PR2-3、PR3-1和PR8-2基因可能参与枸橼c-05对Xcc的抗病反应,而PR4-5在枸橼c-05受Xcc侵染后具有特异的上调表达,且在接种Xcc后6 d-12 d一直处于高表达状态,初步判断PR4A基因可能为参与枸橼c-05对柑橘溃疡病的抗病反应的重要基因。2.经在甜橙基因组检索,发现甜橙中存在位于第8号染色体的5个串联的PR4基因,且发现5个PR4蛋白中,PR4-3和PR4-4蛋白含有几丁质结合域,属于PR4蛋白家族中第一类PR4蛋白,而PR4-1、PR4-2和PR4A蛋白不含有几丁质结合域,属于PR4蛋白家族中第二类PR4蛋白;经本课题已完成的转录组测序结果分析,发现PR4A基因在抗病种质枸橼c-05中显著上调;对抗病种质枸橼c-05及感病种质冰糖橙、酸橙和‘早蜜’椪柑接种Xcc,并分析不同种质中各PR4基因对Xcc应答反应,结果表明,在接种Xcc后4 d,感病种质开始表现症状而抗病种质枸橼c-05无症状时,枸橼c-05中PR4A基因的表达量显著高于感病种质的表达量,证明PR4A基因参与枸橼c-05对Xcc的抗病反应。3.对抗病种质枸橼c-05及感病种质冰糖橙、柚、枳和克里曼丁红橘的PR4A核酸序列比对,发现各PR4A基因均含有1个内含子和2个外显子,不同PR4A基因间2个外显子大小相同;经对各PR4A蛋白的氨基酸序列比对,发现枸橼c-05 PR4A蛋白含有2处位于Barwin结构域的特异氨基酸位点(第95号氨基酸:枸橼c-05为T,感病种质为A;第97号氨基酸:枸橼c-05为E,感病种质为Q),与感病种质PR4A蛋白均不同,这两处特异氨基酸位点可能引起枸橼c-05 PR4A蛋白与感病种质PR4A蛋白功能的差异;对各PR4A蛋白进行二级结构及三级结构预测,发现枸橼c-05 PR4A蛋白并无特异的结构区域。4.构建冰糖橙PR4A基因的超表达载体35S::csPR4A::eYFP及枸橼c-05 PR4A基因的超表达载体35S::cmPR4A::eYFP,在感病种质冰糖橙中进行瞬时超表达,结果显示,csPR4A及cmPR4A瞬时超表达后在同一时间叶片中单位叶面积的Xcc含量显著低于空载体对照,cmPR4A基因瞬时超表达的叶片中单位叶面积Xcc含量显著低于csPR4A基因瞬时超表达的叶片中Xcc的含量,说明PR4A基因对Xcc的生长具有抑制作用,而由于对于PR4A基因表达量的验证中,发现cmPR4A基因瞬时超表达的叶片中PR4A基因表达量显著高于csPR4A基因瞬时超表达的叶片中PR4A基因表达量,因此并不能确认cm PR4A蛋白与csPR4A蛋白功能间是否具有差异,还有待进一步验证。

关键词：柑橘溃疡病枸橼c-05 植物病程相关蛋白 PR4A

柑橘HSP20家族基因鉴定及响应溃疡病菌侵染的表达分析

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柑橘HSP20家族基因鉴定及响应溃疡病菌侵染的表达分析

作者：张凯湖南农业大学

学位级别：硕士

高等植物拥有丰富的HSP20基因,其在植物遭遇生物或非生物胁迫时能发挥重要的抗性作用。柑橘溃疡病是严重危害柑橘产业的细菌性病害,其致病力在高温高湿的环境条件下显著增强。为探究HSP20基因在柑橘响应溃疡病菌（Xanthomonas citri ***... 详细信息

高等植物拥有丰富的HSP20基因,其在植物遭遇生物或非生物胁迫时能发挥重要的抗性作用。柑橘溃疡病是严重危害柑橘产业的细菌性病害,其致病力在高温高湿的环境条件下显著增强。为探究HSP20基因在柑橘响应溃疡病菌（Xanthomonas citri ***,Xcc）侵染过程中发挥的作用,本研究首先鉴定了csHSP20家族基因,初步系统分析了csHSP20基因特征。其次,比较分析了抗柑橘溃疡病种质枸橼c-05和感柑橘溃疡病种质冰糖橙受Xcc侵染诱导表达的转录组中csHSP20家族基因的表达,并对枸橼c-05和冰糖橙进行了不同胁迫处理后的q RT-PcR验证和分析。最后,克隆了枸橼c-05和冰糖橙中受Xcc侵染高表达的HSP20候选基因,并构建35S::HSP20:e YFP超表达载体,分别在冰糖橙叶片和拟南芥中进行了初步功能验证与分析。本研究有助于分析csHSP20基因之间的差异,也为后期对该家族基因功能的研究分析提供了数据信息。同时,为分析和丰富枸橼c-05种质抗柑橘溃疡病菌作用机理的研究提供了数据支持和理论参考。取得的主要成果如下:（1）csHSP20家族的42个基因主要分为11个亚族,分布在9条染色体上,编码135～373个氨基酸,蛋白分子量15.17～41.71 k Da,等电点4.53～10.07,92.9%的基因没有或只有一个内含子,各亚族基因间有高度相似的结构和保守基序,每个基因的启动子具有至少一种与植物激素或应激相关的应答元件。（2）csHSP20家族中的HSP17.9、HSP23.3、HSP18.5和HSP18.0受Xcc侵染和热胁迫后均被诱导上调表达,但在枸橼c-05中受Xcc诱导上调表达水平与冰糖橙差异明显,且HSP23.3基因的上调表达水平极显著,该结果与枸橼c-05和冰糖橙受Xcc侵染的转录组结果一致,且在不同枸橼种质中编码的氨基酸非常保守。（3）克隆了csHSP17.9（474 bp）、csHSP23.3（609 bp）、csHSP18.5（489 bp）和csHSP18.0（474 bp）的冰糖橙基因,以及cm HSP23.3（612 bp）、cm HSP17.9（2 559bp）和cm HSP18.5（489 bp）的枸橼c-05基因。在冰糖橙叶片瞬时超表达受Xcc侵染高表达的HSP20候选基因后,Xcc定量分析结果显示枸橼c-05中HSP20候选基因均能抑制Xcc的繁殖速度,且HSP23.3基因的抑制效果更明显。同时,含有枸橼c-05的HSP23.3基因过表达载体T代拟南芥转基因株系接种***3 000结果显示其感病症状较轻,且细菌生长较慢。因此,枸橼c-05的HSP23.3基因能增强植物对细菌性病原菌的抗性或耐受性。

关键词：柑橘枸橼c-05 HSP20 溃疡病表达分析功能验证

甜橙响应柑橘溃疡病菌调控的糖转运基因筛选与鉴定

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甜橙响应柑橘溃疡病菌调控的糖转运基因筛选与鉴定

作者：麻明英湖南农业大学

学位级别：硕士

柑橘溃疡病是严重危害柑橘产业发展的重要细菌病害之一,可侵染几乎所有柑橘栽培品种,目前尚无根治方法。柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp citri,Xcc)通过气孔或伤口等侵入寄主后,在植物细胞间隙(质外体)定殖,从寄主细胞中获取营... 详细信息

柑橘溃疡病是严重危害柑橘产业发展的重要细菌病害之一,可侵染几乎所有柑橘栽培品种,目前尚无根治方法。柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp citri,Xcc)通过气孔或伤口等侵入寄主后,在植物细胞间隙(质外体)定殖,从寄主细胞中获取营养用于生长繁殖。其中来源于植物寄主光合作用的糖类物质是Xcc繁殖的主要能量来源,但糖类物质在植物细胞内合成,位于细胞间隙的Xcc需要调控寄主糖转运蛋白将胞内的糖类物质转运到胞外,从而加以利用。糖转运蛋白对于病原菌在寄主内生长繁殖至关重要,不同病原菌调控寄主的糖转运蛋白种类和途径均有差异,有关Xcc调控感病种质糖转运蛋白的研究较少,调控途径尚不明确,因此弄清Xcc入侵过程中调控糖转运蛋白途径对溃疡病抗病育种至关重要,筛选并获得沉默植物体内的关键糖转运蛋白的转基因可能是未来可持续发展的育种方向。本研究拟以感病种质冰糖橙为材料及抗病种质枸橼c-05为对照,基于转录组水平筛选受Xcc诱导显著高表达的糖转运蛋白,利用qRT-PcR验证和糖转运候选基因超表达的抗感性分析,主要研究结果如下:(1)根据糖转运蛋白的保守结构域筛选鉴定出119甜橙糖转运蛋白,其中SWEETs家族20个、7个SUTs家族、42个MSTs家族及50个MFSs家族其它糖转运基因;进一步利用前期完成的在冰糖橙和枸橼c-05接种Xcc不同时间点的转录组测序分析甜橙119个糖转运基因表达变化,结果显示,SWEET2a、SUT2、cs3g06440、STP6和SWEET17d在冰糖橙中受Xcc诱导特异上调表达;cs9g10540和SWEET12b在枸橼c-05中受Xcc诱导特异上调表达。(2)进一步利用实时荧光定量PcR(qRT-PcR)验证7个糖转运候选基因在冰糖橙和枸橼c-05叶片中受Xcc诱导的表达特征。结果显示STP6在冰糖橙和枸橼c-05中均显著上调表达;SWEET2a及SUT2在冰糖橙中显著上调表达,而在枸橼c-05中表达无显著变化,且SWEET2a和SUT2在冰糖橙叶片接种Xcc后第4天表达量达到最高峰,此时冰糖橙叶片上接种Xcc区域开始出现水渍状病斑,结果表明SWEET1a和SUT2的表达与柑橘溃疡病症状的形成密切相关。(3)分析不同柑橘种质SWEET2a、STP6及SUT2同源基因编码的氨基酸序列和启动子顺式作用元件,发现3个糖转运基因在不同柑橘种质中编码的氨基酸序列和启动子顺式作用元件存在较大差异。经氨基酸序列比对发现,冰糖橙、枸橼c-05、柚、长果香橼、普通枸橼和金柑的SWEET2a、STP6及SUT2分别存在13、19和8处突变位点。其中冰糖橙SWEET2a有2处特异位点(M190V、V211L)、SUT2有1处特异位点(L211Y)、STP6有2处特异位点(V500A、R515S)。启动子顺式作用元件的预测结果显示,冰糖橙SWEET2a含有特异的顺式作用元件TcA-element、Tc-rich repeats和ABRE,枸橼c-05SWEET2a存在特异顺式作用元件O2-site、GcN4-motif、TGAcG-motif和TATc-box;冰糖橙SUT2含有特异顺式作用元件motifⅠ,枸橼c-05 SUT2无特异顺式作用元件;冰糖橙STP6含有特异顺式作用元件LTR,枸橼c-05 STP6存在特异顺式作用元件O2-site和TcA-element。以上3个糖转运基因在感病种质冰糖橙中的这些氨基酸差异位点及启动子顺式作用元件可能是Xcc特异调控这些糖转运蛋白的原因。(4)烟草叶片瞬时表达结果显示,csSUT2、csSWEET2a和csSTP6主要定位在质膜上;冰糖橙和枸橼c-05叶片上瞬时超表达验证结果显示,4 dpi时csSUT2、csSTP6和csSWEET2a超表达叶片区域的Xcc含量均显著高于p1300空载体对照P0,且15 dpi叶片症状比对照P0更明显,说明csSUT2、csSWEET2a和csSTP6均能促进Xcc在柑橘叶片中定殖;将csSUT2和csSWEET2a超表达载体转入拟南芥中,获得超表达转基因T1代株系,并在野生型拟南芥(WT)和超表达株系(OE)上接种***3000,结果显示,超表达csSUT2和csSWEET2a在3 dpi时,叶片中***3000含量均显著高于WT,且症状比对照WT明显,表明csSUT2和csSWEET2a为受细菌调控的主要糖转运基因。

关键词：柑橘溃疡病菌糖转运蛋白冰糖橙枸橼c-05 SWEET2a SUT2 STP6

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枸橼再生及遗传转化体系的构建

枸橼再生及遗传转化体系的构建

作者：吴金蔚湖南农业大学

学位级别：硕士

柑橘为多年生木本植物,常通过转基因技术验证柑橘基因功能和加速育种进程,但目前柑橘在组织培养遗传转化方面存在操作要求高、操作繁琐、周期长、转化效率低和成年态转化困难等问题。课题组前期研究发现柑橘原始种质枸橼c-05不仅具有独... 详细信息

柑橘为多年生木本植物,常通过转基因技术验证柑橘基因功能和加速育种进程,但目前柑橘在组织培养遗传转化方面存在操作要求高、操作繁琐、周期长、转化效率低和成年态转化困难等问题。课题组前期研究发现柑橘原始种质枸橼c-05不仅具有独特的抗柑橘溃疡病特性,而且具有优异的再生能力,是开展柑橘遗传转化的理想材料。因此,本研究分别从枸橼c-05茎段扦插、茎段组织培养再生、叶片扦插、农杆菌介导的枸橼c-05茎段扦插遗传转化和农杆菌介导的枸橼c-05茎段组织培养遗传转化5个方面开展了系统研究,取得了以下结果:1.建立了枸橼c-05茎段扦插萌发不定芽的再生体系。根据枝条半木质化和木质化程度的差异,分别取直径3.5 mm以下、3.5～4.5 mm及4.5 mm以上的枝条,将枝条剪为7 cm左右的茎段,在不同温度(22℃、25℃、28℃、32℃、36℃)条件下培养,统计不定芽萌发数,结果显示,选用直径3.5～4.5 mm的枸橼c-05茎段扦插,不定芽萌发比例最高,可达46.2%,平均每根茎段萌发的不定芽数不足1个,且扦插茎段在28℃环境下培养生长最佳。将扦插茎段顶端置于MT(1/4)+6-BA(3 mg/L)溶液浸湿的脱脂棉上保湿,在温度为28℃,光照强度为9000 lux的室内补光人工气候室培养,平均每根茎段顶端萌发的不定芽数量可达2个。2.构建并优化了枸橼c-05成年态茎段的再生体系。通过对枸橼c-05成年态茎段体外消毒方法和再生培养体系进行研究,发现在洁净的植物培养室中生长的枸橼c-05的新梢枝条,经75%酒精消毒30 s,1%次氯酸钠溶液浸泡15 min,消毒效果最佳,愈伤诱导率可达85.2%。而在田间或大棚中培养茎段材料消毒困难。在不添加外源激素的情况下,茎段在MT基础培养基上也能形成不定芽,不定芽萌芽率为33.52%,且不定芽直接扦插在MT培养基上即可快速生根,无需微芽嫁接或使用生根培养基,缩短了获得再生苗的时间。3.确定了枸橼c-05叶片扦插的再生体系。对枸橼c-05不同叶龄和类型(带/不带芽)的叶片在灭菌蛭石上扦插培养,发现均可生根,其中成熟叶扦插的根系发育最佳。带芽的叶片在蛭石中扦插可发育成完整植株;而不带芽叶片尚不能萌发不定芽,有关萌发不定芽的条件正在进一步探索中。初步探索了枸橼c-05成年态茎段组织培养的遗传转化体系和高效的枸橼c-05茎段扦插遗传转化体系。以冰糖橙成年态茎段为对照,通过已确定的枸橼c-05成年态茎段消毒方法,利用农杆菌介导遗传转化,结果显示:在共培养阶段,枸橼c-05茎段培养基中农杆菌增殖速度显著高于冰糖橙,600 mg/L浓度的头孢霉素都难以抑制枸橼c-05转化过程中农杆菌的生长,有关条件有待进一步优化。以本研究确定的萌发不定芽数量最多的枸橼c-05茎段(直径3.5～4.5 mm)为材料,扦插培养,确定了可保持茎段顶端不易干枯死亡的方法:农杆菌重悬液用10%甘油代替蔗糖,将茎段顶端浸泡在重悬液中15 min,再用MT(1/4)+6-BA(3 mg/L)+Hyg(25 mg/L)溶液在茎段顶端保湿,使顶端生成较好的愈伤组织,目前正在对转基因植株进行筛选和鉴定。此方法无需特定的组织培养条件,简单易操作,可开发为高效的柑橘成年态遗传转化途径。

关键词：枸橼c-05 不定芽再生成年态遗传转化