检索结果-南通市图书馆

作者：董芳滢江南大学

学位级别：硕士

通过实验室定向进化,将野生型酶改造为具有更高耐热性能的工业催化剂,已经成为蛋白质工程的一个重要目标。目前,基于已有的序列与结构认知,已成功使用多种计算设计策略设计热稳定性酶变体。然而,酶结构的显著灵活性以及酶催化的高度复... 详细信息

通过实验室定向进化,将野生型酶改造为具有更高耐热性能的工业催化剂,已经成为蛋白质工程的一个重要目标。目前,基于已有的序列与结构认知,已成功使用多种计算设计策略设计热稳定性酶变体。然而,酶结构的显著灵活性以及酶催化的高度复杂性使得酶在热稳定性改造过程中通常以酶活性的损失为代价,大大降低了酶工业改造与应用的有效性。因此,在获得稳定性提高的同时,保持突变体酶的功能活性不受损失,是热稳定性改造过程中的重要任务。本论文选取枯草芽孢杆菌脂肪酶a(Bacillus subtilis Lipase A,BSLA)作为模型蛋白,借助计算设计改造热稳定性突变体;并引入构象动力学分析方法,探究热稳定性及酶活性与构象变化的关系;进一步结合动力学特征参数辅助突变体的优化筛选以及突变的有效组合设计,帮助实现酶在工业生产中的高效率与低成本应用。主要研究内容如下:(1)通过PROSS(Protein Repair One Stop Shop)蛋白质修复在线设计平台得到热稳定性提升的7个组合突变体,最优突变体D7的热熔融温度相对于野生型提高13.6℃,相对酶活性为野生型的106.4%。基于分子动力学模拟的局部作用力分析表明,相互作用的引入以及表面亲水性的改善是热稳定性提高的主要分子机制。与此同时,活性位点区域中催化三联体氢键网络的破坏与关键结合位点残基S77非活性构象的增加是导致相对酶活性下降的原因。(2)基于动态互相关性网络的最短相关性距离分析,探究了远端突变位点对酶活性位点的变构调控机制。将与活性区域残基具有更小最短相关性距离的残基进行筛除,优化后突变体RD3的热熔融温度相对酶活性提高至野生型的149.6%。(3)进一步针对PROSS策略获得的13个突变,选取其中4个性质较优的突变位点A15S、F17S、G155S、I157M进行全路径迭代组合突变,其中四点组合突变热熔融温度相对于野生型提高10.51℃,相对酶活性为118%。与相邻残基的上位性相互作用以及对表面疏水堆积的改善可能分别是组合突变体显示出负上位性效应和正上位性效应的原因。(4)基于(1)(2)(3)中的讨论,将定向进化中筛选的15个阳性单点作为突变文库,通过选取热稳定性贡献、结构信息以及构象动力学特征等七个维度的参数,使用K均值聚类分析,将数据点聚类为多个具有相似特征的数据点的簇。包含9个突变位点的C31突变体热熔融温度相对于野生型提高约23℃,该方法可以有效地用于突变的组合设计,提高改造效率。本研究通过将计算模拟与实验验证相结合,设计获得了热稳定性提升的BSLA突变体。同时,本研究通过构象动力学分析探究了对蛋白质稳定性及其酶活性与构象变化的关联性,并提供了对突变体设计进行优化的多种可行性方法。

关键词：枯草芽孢杆菌脂肪酶a 热稳定性蛋白质计算设计分子动力学模拟构象动力学

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基于多重计算设计策略提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的热稳定性

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生物工程学报 2020年第8期36卷 1556-1567页

作者：向玉张萌许菲江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

提高酶的热稳定性是生物催化领域的热点和难点,计算机辅助的理性设计相比于传统的定向进化更加高效,在酶工程领域中的应用越来越广泛和深入。文中以枯草芽孢杆菌脂肪酶a为模式蛋白,首先,利用Rosetta-VIP计算设计对酶的结构空腔进行分析... 详细信息

提高酶的热稳定性是生物催化领域的热点和难点,计算机辅助的理性设计相比于传统的定向进化更加高效,在酶工程领域中的应用越来越广泛和深入。文中以枯草芽孢杆菌脂肪酶a为模式蛋白,首先,利用Rosetta-VIP计算设计对酶的结构空腔进行分析,选择了16个有利于结构空腔填充(ΔΔE酶活性。有6个单点突变体(F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L)的热稳定性得到了提高,其中Tm值最大提高3.18℃。结果表明,单点突变体满足ΔΔE越低、蛋白溶剂可及表面积减少且符合序列保守性,则得到保留原有酶活力的正向突变的可能性越大。此外,将热稳定性提高的6个单点突变进行迭代组合突变,两点组合突变体的Tm最大提高4.04℃,三点组合突变体的Tm最大提高5.13℃,四点组合突变体的Tm提高了7.30℃,六点组合突变体的Tm提高了7.43℃。因此,基于酶的分子结构的空腔分析、溶剂可及表面积及氨基酸序列保守性计算的多重虚拟筛选方法,可有效提高酶的热稳定性。

关键词：热稳定性枯草芽孢杆菌脂肪酶a 蛋白质计算设计

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计算设计提高枯草芽孢杆菌脂肪酶a的热稳定性

计算设计提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性

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作者：向玉江南大学

学位级别：硕士

酶在生物催化和合成生物学中占有十分重要的地位,但是天然酶分子结构大多不稳定,难以满足工业应用过程中对耐高温的要求,因此针对酶的热稳定性改造一直是酶工程领域的长期目标。传统的定向进化虽然可以针对工业应用的特定要求对酶进行筛... 详细信息

酶在生物催化和合成生物学中占有十分重要的地位,但是天然酶分子结构大多不稳定,难以满足工业应用过程中对耐高温的要求,因此针对酶的热稳定性改造一直是酶工程领域的长期目标。传统的定向进化虽然可以针对工业应用的特定要求对酶进行筛选,但它通常需要经过多轮的突变和筛选,且对筛选手段的高通量要求很高,耗时耗力。而理性设计具有更强的目的性、更加高效、快捷,基于酶的结构,利用计算机辅助的理性设计在酶工程领域中的应用越来越广泛和深入。枯草芽孢杆菌脂肪酶a(Bacillus subtilis lipase A,BSLA)结构简单、分子量小,在生产生物柴油和洗涤剂方面具有很大的应用潜力,往往被用作蛋白计算设计的模式蛋白。本课题基于酶的空腔分析、蛋白溶剂可及表面积和同源序列分析的多重计算设计策略提高了BSLA的热稳定性;初步探究了非天然共价键的计算设计方法及表达,为非天然氨基酸的相关研究奠定了基础。论文主要研究结果如下:(1)利用Rosetta-VIP对BSLA的结构空腔进行分析,选择了16个有利于结构空腔填充(ΔΔE酶活性。有6个单点突变体(F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L)的热稳定性得到了提高,其中T值最大提高3.18°C。结果表明,多重计算设计策略具有以下筛选原则:单点突变体满足ΔΔE越低、蛋白溶剂可及表面积减少、且符合序列保守性,得到保留原有酶活力的正向突变的可能性越大。(2)将热稳定性提高的6个单点突变进行迭代组合突变,两点组合突变体的T最大提高4.04°C,三点组合突变体的T最大提高5.13°C,四点组合突变体的T提高了7.30°C,六点组合突变体的T提高了7.43°C。(3)利用绿色荧光蛋白为模式蛋白,成功构建了双质粒非天然氨基酸表达体系。再以BSLA为模式蛋白,通过Rosetta计算设计获得了11个含非天然共价键的BSLA突变体,经过能量值评估、近攻击构象分析获得了三个设计合理的突变体:Z6C173、Z157C14和Z31C174,并初步对其表达条件进行了优化。

关键词：枯草芽孢杆菌脂肪酶a 热稳定性计算设计多重计算设计策略非天然共价键

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基于脯氨酸理论提高枯草芽孢杆菌脂肪酶a的热稳定性

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化学与生物工程 2014年第11期31卷 25-30页

作者：李晓彤江凌胡燚朱丽英徐娴南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京210009 南京工业大学食品与轻工学院江苏南京210009 南京工业大学理学院江苏南京210009

以枯草芽孢杆菌脂肪酶a(LipA)为研究对象,根据从RCSB数据库中获取的晶体结构,采用分子动力学模拟和分子生物学实验相结合的方法进行脂肪酶热稳定性位点突变的理性设计。首先,利用分子动力学模拟获得晶体结构中柔性较高的Loop区域;进而,... 详细信息

以枯草芽孢杆菌脂肪酶a(LipA)为研究对象,根据从RCSB数据库中获取的晶体结构,采用分子动力学模拟和分子生物学实验相结合的方法进行脂肪酶热稳定性位点突变的理性设计。首先,利用分子动力学模拟获得晶体结构中柔性较高的Loop区域;进而,结合"脯氨酸理论",将位于该区域附近的Gly残基突变为Pro,分析引入Pro突变对LipA热稳定性的影响,筛选得到Gly52和Gly158两个突变位点;最后,通过定点突变操作对突变株LipAG52P和LipAG158P进行热稳定性实验验证。结果显示,突变株LipAG52P、LipAG158P的比活力分别是野生型LipA的5.6倍和2.7倍,Tm值分别提高了15℃和7℃,催化效率分别提高了85%和22%。

关键词：枯草芽孢杆菌脂肪酶a 分子动力学模拟脯氨酸理论定点突变热稳定性

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