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枯草杆菌蛋白酶对大豆胰蛋白酶抑制剂的水解钝化研究

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食品与发酵工业 2007年第2期33卷 42-45页

作者：万娟陈中杨晓泉周伟伟华南理工大学轻工与食品工程学院

研究了枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)对大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)酶解活性的影响。实验在50℃,pH7.5条件下反应1h,并以BAPNA为底物,采用改进的方法测定枯草杆菌蛋白酶对大豆胰蛋白酶抑制剂的水解钝化程度,用SDS-PAGE方法和分子排阻色谱法... 详细信息

研究了枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)对大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)酶解活性的影响。实验在50℃,pH7.5条件下反应1h,并以BAPNA为底物,采用改进的方法测定枯草杆菌蛋白酶对大豆胰蛋白酶抑制剂的水解钝化程度,用SDS-PAGE方法和分子排阻色谱法研究其蛋白酶钝化敏感性。结果证明,枯草杆菌蛋白酶可以水解大部分的抑制剂,并通过SDS-PAGE进一步证实了比色法得出的结论。而由分子排阻色谱图可以分析得出抑制剂经枯草杆菌蛋白酶酶解后,活性降低。分析认为,可能是由于抑制剂中二硫键被打断使得其结构发生改变,同时生成大量复杂的小分子多肽物质。因此,可以推断大豆胰蛋白酶抑制剂的稳定性与二硫键的存在有关。

关键词：大豆胰蛋白酶抑制剂枯草杆菌蛋白酶水解钝化

枯草杆菌蛋白酶与3,4-二羟基-2-蒽醌磺酸钠的作用机理

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应用化学 2004年第5期21卷 459-463页

作者：王兴明丁立生西南科技大学化学与生物工程系绵阳621002 中国科学院成都生物研究所

用UV光谱法研究了枯草杆菌蛋白酶 (BSP)在pH =4 2 0的酸性溶液中与 3,4 二羟基 2 蒽醌磺酸钠(ARS)的相互作用。测得生成的缔合物的最大吸收峰为 5 15nm ,与试剂相比红移 95nm。应用平衡透析法、摩尔比法和双波长法进行测定 ,结果表... 详细信息

用UV光谱法研究了枯草杆菌蛋白酶 (BSP)在pH =4 2 0的酸性溶液中与 3,4 二羟基 2 蒽醌磺酸钠(ARS)的相互作用。测得生成的缔合物的最大吸收峰为 5 15nm ,与试剂相比红移 95nm。应用平衡透析法、摩尔比法和双波长法进行测定 ,结果表明 ,表观摩尔吸光系数εB1=5 89× 10 3 L/ (mol·cm) ,εB2 =4 6 8×10 3 L/ (mol·cm) ,结合数n1=13和n2 =4 5 ,积累平衡常数 β1=5 2 7× 10 4L/mol和 β2 =3 5 4× 10 5L/mol。第 1类结合数完全符合BSP空间构象中活性中心的作用原子数。研究发现 ,该反应基本符合Scatchard模型 ,BSP与ARS之间的作用以电荷力为主、疏水力为辅。

关键词：枯草杆菌蛋白酶二羟基蒽醌磺酸钠积累平衡常数

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枯草杆菌蛋白酶的基因工程改性

微生物学通报 2000年第3期27卷 218-220页

作者：王凡强马美荣王正祥诸葛健无锡轻工大学生物工程学院! 无锡　214036

枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)是一种工业上应用很广的酶,在洗涤剂、制革、丝绸等多种行业上有着广泛的用途.特别是用于生产加酶洗涤剂,帮助去除血渍、奶渍、汗渍及可可等各种蛋白污垢.1960年,丹麦人首先利用地衣芽孢杆菌生产了被称为Subt... 详细信息

枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)是一种工业上应用很广的酶,在洗涤剂、制革、丝绸等多种行业上有着广泛的用途.特别是用于生产加酶洗涤剂,帮助去除血渍、奶渍、汗渍及可可等各种蛋白污垢.1960年,丹麦人首先利用地衣芽孢杆菌生产了被称为Subtilisin Carlsberg的碱性蛋白酶,随后该酶被用于生产加酶洗涤剂,目前有资料称国外市场上90%是加酶洗涤剂.国内1990年枯草杆菌蛋白酶产量约为1.3万吨,加酶洗衣粉占洗涤剂总量约10%.枯草杆菌蛋白酶的生产菌和研究对象主要是地衣芽孢杆菌,解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌及南极嗜冷芽孢杆菌等[1].枯草杆菌蛋白酶的分子量较小,功能研究得较清楚,产生菌的基因也被克隆,并且有合适的载体系统,这些决定了它是蛋白质工程的理想的研究对象.迄今为止,已经对其进行了400多种不同的定位诱变,对其功能进行改造,使它在洗涤剂中有更好的表现.本文介绍了利用定位诱变技术,从基因水平上改造枯草杆菌蛋白酶的一些成功的结果.

关键词：枯草杆菌蛋白酶蛋白质工程定位诱变

枯草杆菌蛋白酶改善大豆分离蛋白功能特性的研究

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食品工业科技 2003年第8期24卷 27-29页

作者：张洪黄建韶王云陈善云常德师范学院生物系常德415003

利用枯草杆菌蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶法改性,改性后的大豆分离蛋白的功能特性得到很大的提高。改性大豆分离蛋白的性质与改性程度(水解度DH)有关,随着水解度的增加,蛋白质的溶解性能提高,粘度下降,体外可消化性指数随水解度的增加... 详细信息

利用枯草杆菌蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶法改性,改性后的大豆分离蛋白的功能特性得到很大的提高。改性大豆分离蛋白的性质与改性程度(水解度DH)有关,随着水解度的增加,蛋白质的溶解性能提高,粘度下降,体外可消化性指数随水解度的增加而提高。

关键词：枯草杆菌蛋白酶大豆分离蛋白酶法改性功能特性

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枯草杆菌蛋白酶突变体的纯化和晶体生长

生物化学杂志 1996年第5期12卷 608-612页

作者：林峥朱榴琴马建华毕汝昌中国科学院生物物理研究所

应用基因工程手段，获得了枯草杆菌蛋白酶Ｅ的双突变体基因（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ），此基因在枯草芽孢杆菌中表达得到了既抗氧又耐高温的碱性蛋白酶，含Ｍ２２２，Ｎ１１８Ｓ碱性蛋白酶基因的枯草杆菌发酵液经过硫酸铵分级沉淀和Ｄ... 详细信息

应用基因工程手段，获得了枯草杆菌蛋白酶Ｅ的双突变体基因（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ），此基因在枯草芽孢杆菌中表达得到了既抗氧又耐高温的碱性蛋白酶，含Ｍ２２２，Ｎ１１８Ｓ碱性蛋白酶基因的枯草杆菌发酵液经过硫酸铵分级沉淀和ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５阴离子交换层析柱，再在ＦＰＬＣ层析系统上用Ｈｉｌｏａｄ２６／１０ＳＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ阳离子交换柱分离得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳纯的蛋白酶样品。突变体酶的等电点为ｐＨ８．９，分子量为２７４００，用四肽底物测得的动力学参数也有较大的变化。对该突变体酶进行了晶体生长研究，获得了较大的单晶体。

关键词：枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶突变体晶体

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枯草杆菌蛋白酶嗜热性改造效果评判方法研究

枯草杆菌蛋白酶嗜热性改造效果评判方法研究

作者：夏翾北京工业大学

学位级别：硕士

对蛋白酶进行热稳定性改造是近年来的研究热点，具有十分重要的理论意义和实际价值。一方面，蛋白酶热稳定性改造工作可以帮助人们更加深入地探讨蛋白质的热稳定性机理，对于蛋白质的结构、功能等方面会有更系统、全面的认识;另一方面... 详细信息

对蛋白酶进行热稳定性改造是近年来的研究热点，具有十分重要的理论意义和实际价值。一方面，蛋白酶热稳定性改造工作可以帮助人们更加深入地探讨蛋白质的热稳定性机理，对于蛋白质的结构、功能等方面会有更系统、全面的认识;另一方面，由于天然蛋白酶对温度的耐受性低，严重制约了其在工业生产中的应用，使其催化效率高、对底物的立体选择性等优点不能很好地得到发挥，因此迫切需要好的嗜热性改造方法来指导蛋白酶热稳定性的改造，促进和发展蛋白酶在实际生活中的应用。目前对于嗜热改造效果的判定，主要是利用实验加温测定的方法，该方法能够很好地判断蛋白酶的热稳定性是否得到提高，但该方法耗时耗力，因此需要找到更简便、更快捷的方法去判定蛋白嗜热性改造的效果，这对蛋白热稳定性改造工作具有十分重要的促进作用。本文以枯草杆菌蛋白酶（subtilisin BPN'）为研究对象，以探索评判蛋白酶嗜热突变效果的方法为研究目的，选取了有可靠实验资料的6个突变点，运用分子动力学模拟方法，在四种不同模拟条件下，对这6个突变体与1个野生型蛋白进行了多种参量的对比分析，提取5个有效参数（ΔBOND、ΔELECT、ΔANGLE、ΔVDW、ΔDIHED），进一步确定了前4个参数为特征有效参数，建立了枯草杆菌蛋白酶嗜热性改造效果的评判方法;利用该方法对枯草杆菌蛋白酶的其他6个突变体以及色氨酸合成酶α亚基（Tryptophan synthase alpha-subunit）的嗜热突变体效果进行评判，评判结果与实验资料完全吻合，证明该方法可用于蛋白酶嗜热性改造突变效果的评判;最后将该方法运用到枯草杆菌蛋白酶的嗜热性改造实际工作中，对5个随机突变体进行嗜热改造效果的判定，判定结果证明这5个突变体为有效突变。利用分子动力学模拟对嗜热改造效果进行评判的方法，可以较好地判别出嗜热改造效果的好坏，并且操作简便、易于实现，对今后指导蛋白酶进行有效突变、热稳定性改造有重要意义。

关键词：枯草杆菌蛋白酶热稳定性改造残基突变分子动力学模拟评判方法

枯草杆菌蛋白酶的分离纯化、酶学性质及体外溶栓性质

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枯草杆菌蛋白酶的分离纯化、酶学性质及体外溶栓性质

作者：牛树壹中国海洋大学

学位级别：硕士

随着我国人口老龄化现象的日益严重，老年常发疾病血栓栓塞性疾病的发生也极为普遍，这种疾病也是当前致死率很高的病因之一，治疗这类疾病的主要手段则是溶栓疗法，而纤溶酶主要是催化血栓中的主要成分纤维蛋白水解，从而达到溶解血栓... 详细信息

随着我国人口老龄化现象的日益严重，老年常发疾病血栓栓塞性疾病的发生也极为普遍，这种疾病也是当前致死率很高的病因之一，治疗这类疾病的主要手段则是溶栓疗法，而纤溶酶主要是催化血栓中的主要成分纤维蛋白水解，从而达到溶解血栓的目的，纤溶酶可来源于动物、植物、微生物，而微生物则是纤溶酶的主要来源，枯草芽孢杆菌是人类最早发现的细菌，由于它的生长环境多样，自身没有致病性，对高温、高热、电磁辐射、紫外线等具有很强抗逆性，它可利用的营养物质多种多样，且能直接将许多蛋白质分泌到培养基中，产生各种各样的酶，一直是生物界研究热点。本文采用单因素实验对实验室保存菌种枯草杆菌的发酵培养基组分及发酵条件进行优化，对发酵液产生的枯草杆菌蛋白酶进行分离纯化，测定了枯草杆菌蛋白酶中具有纤溶活性蛋白酶的部分酶学性质，并研究其体外溶栓特点，为后续工作的展开奠定了基础。1、为提高枯草杆菌蛋白酶的产量，采用单因素实验设计，通过摇瓶培养对枯草杆菌的发酵培养基及发酵条件进行优化，结果表明，优化后培养基（w/v）为：麦芽糖1%、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O0.05%、CaCl20.02%、KH2PO40.4%;最适发酵条件为：初始pH7、温度37℃、接种量为1%，最佳培养时间为48h。2、将枯草杆菌按最优发酵培养基进行发酵培养48h后，将发酵液进行4℃、4000rpm离心20min，然后将发酵上清液加入60%饱和度的硫酸铵进行盐析、透析后冷冻干燥得到粗酶粉，然后利用CM-sepharose Fast Flow对枯草杆菌蛋白酶进行分离纯化，纯化后得到纯酶进行SDS-PAGE验证，最后得到的酶分子量显示低于14.3KDa，且具有纤溶酶活性，前人文献中未见报道，是一种新的溶栓酶。3、为明确枯草杆菌蛋白酶的酶学性质，研究了温度、pH、金属离子对其稳定性的影响。结果表明，枯草杆菌蛋白酶的最适反应温度为60-70℃、温度稳定性范围为40℃以下、最适反应pH为7，pH稳定性范围为6-8，未发现能增强该酶活性的金属离子。4、研究了枯草杆菌蛋白酶体外溶栓的特点，结果表明，枯草芽孢杆菌蛋白酶在体外具有良好的溶栓能力，且溶栓过程红细胞形态完整，对红细胞无损害，对酶浓度具有梯度依赖性，其分解纤维蛋白能力强，具有直接分解纤维蛋白的能力。本文分离纯化的枯草杆菌蛋白酶具有纤溶和体外溶栓能力，具有重要意义，其具体性质及体内溶栓的能力及特点将是下一步实验须进行的内容，为临床溶栓医药的研究奠定基础。

关键词：枯草杆菌蛋白酶分离纯化酶学性质体外溶栓

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枯草杆菌蛋白酶基因工程的研究进展

生物工程进展 2000年第2期20卷 41-44页

作者：王凡强马美荣王正祥诸葛健无锡轻工大学生物工程学院无锡 214036

本文介绍了枯草杆菌蛋白酶 (Subtilisin)的研究现状 ,即利用定位诱变和体外重组等技术改变酶的性质 ,包括催化活性、底物特异性、稳定性、低温适应性以及酶在有机相中的性能等。对枯草杆菌蛋白酶的成功改造不仅有可观的商业价值。

关键词：枯草杆菌蛋白酶定位诱变体外重组蛋白质工程

非水相体系中枯草杆菌蛋白酶-表面活性剂离子对的形成条件

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化工进展 2009年第10期28卷 1798-1802,1807页

作者：王树根谷家栋张颖范雪荣江南大学生态纺织教育部重点实验室江苏无锡214122

枯草杆菌蛋白酶在水相pH值小于其等电点条件下带正电,能与异辛烷中带负电的阴离子表面活性剂二辛基丁二酸磺酸钠(AOT)通过静电引力结合形成离子对进入有机相。详细研究了两相接触方式、水相初始pH值、水相离子强度等因素对酶转移率的影... 详细信息

枯草杆菌蛋白酶在水相pH值小于其等电点条件下带正电,能与异辛烷中带负电的阴离子表面活性剂二辛基丁二酸磺酸钠(AOT)通过静电引力结合形成离子对进入有机相。详细研究了两相接触方式、水相初始pH值、水相离子强度等因素对酶转移率的影响。采用120r/min磁力搅拌使两相混合能得到较好的酶转移率,作用时间为6h。水相初始pH值5.0有利于离子对的形成及酶蛋白的转移。水相中CaCl2的加入有利于消除两相混合过程中的乳化;但是过高的CaCl2浓度会减弱酶分子与AOT间的静电引力,不利于酶分子与AOT的结合。水相中酶浓度不变,随着有机相中AOT初始浓度的增加,酶的转移率呈现增长趋势。固定异辛烷中AOT浓度,随着水相中初始酶浓度的增加,转移至有机相中酶量先增加后减少。进入异辛烷的酶分子仍旧保持活性,能催化转酯化反应的进行,但随着反应时间的延长,酶的催化效率出现下降。

关键词：疏水性离子对枯草杆菌蛋白酶非水相表面活性剂