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埃可病毒18型构象表位的生物信息学研究

宁波大学学报（理工版） 2023年第1期36卷 75-83页

作者：王惠贾永涛方雨露董长征宁波大学医学院浙江宁波315211 浙江省病理生理学技术研究重点实验室浙江宁波315211

埃可病毒18型(Echovirus 18,E18)可引起手足口病、病毒性脑膜炎和急性胃肠炎等疾病,近20年来开始在全球流行.本文首先使用前期研发的人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法,对肠道病毒B种的E18构象表位进行系统性预测,发现其表位分布... 详细信息

埃可病毒18型(Echovirus 18,E18)可引起手足口病、病毒性脑膜炎和急性胃肠炎等疾病,近20年来开始在全球流行.本文首先使用前期研发的人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法,对肠道病毒B种的E18构象表位进行系统性预测,发现其表位分布模式呈三簇分布,其中VP1 BC环和C-端、VP2 EF环是E18表位的主要构成区域;其次基于E18的VP1和基因组序列的分子进化分析发现,进化分支的形成伴随表位处氨基酸突变,而VP1 C-端和VP2 EF环是突变热点区域;最后通过足迹图发现,大多数E18衣壳表面的分支突变都位于表位上或附近,受体结合位置处的突变罕见,提示表位处的突变产生了新的进化分支,但分支突变尽量避开受体结合位置,以免影响病毒与宿主细胞的结合能力.E18构象表位的生物信息学研究,为进一步通过实验鉴定表位、病毒的监测和预警以及抗病毒药物和疫苗的研发提供了重要支持.

关键词：埃可病毒18型肠道病毒构象表位抗原表位分子进化分析生物信息学

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柯萨奇病毒A组6型构象表位的生物信息学预测

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病毒学报 2020年第6期36卷 1075-1084页

作者：王丽萍戎浩方雨露陈琴董长征宁波大学医学院预防医学系宁波315211 浙江省病理生理学技术研究重点实验室宁波315211 中国科学院大学宁波华美医院(宁波市第二医院) 宁波315010

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)近年成为手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)最重要的病原体之一。本实验室在之前的研究中发展了人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法,并成功应用于柯萨奇病毒A组10型(Coxsackie... 详细信息

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)近年成为手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)最重要的病原体之一。本实验室在之前的研究中发展了人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法,并成功应用于柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)构象表位的预测,发现CV-A10的构象表位在病毒衣壳表面呈现site 1、site 2和site 3三簇分布。本研究中,应用相同算法对CV-A6的构象表位进行系统性预测,并将CV-A6和CV-A10这两种手足口病的病原体的构象表位进行对比。结果显示:CV-A6(A颗粒)和CV-A10(A颗粒)的构象表位具有高度一致的site 1、site 2和site 3三簇分布模式,而且这种分布一致性超过了CV-A10两种颗粒状态(A颗粒和成熟颗粒)的一致性,说明衣壳结构和颗粒状态对于构象表位非常重要。虽然CV-A6(A颗粒)和CV-A10(A颗粒)具有高度一致的构象表位分布模式,但在共享的58个氨基酸残基位点中,仅有21个(36.2%)残基保守,而且绝大多数构象表位都有3个以上残基差异,提示构象表位残基上的差异造成了CV-A6和CV-A10的血清型差异。CV-A6构象表位的预测结果,为其构象表位的实验鉴定、分子流行病学研究和疫苗研发提供了重要支持。

关键词：柯萨奇病毒A组6型(CV-A6) 柯萨奇病毒A组10型(CV-A10) 构象表位抗原表位生物信息学预测手足口病(HFMD)

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柯萨奇病毒A组10型构象表位的生物信息学预测

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病毒学报 2019年第5期35卷 762-769页

作者：戎浩王丽萍高柳莺董长征宁波大学医学院预防医学系宁波315211 浙江省病理生理学技术研究重点实验室宁波315211

近年来,柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)逐渐成为手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)最重要的病原体之一。相比肠道病毒A组71型(Enterovirus 71,EV-A71),CV-A10尚未有上市的疫苗,其构象表位也缺乏系统性研究。本研究利用实验室发展的人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法,对CV-A10的构象表位进行系统性预测。结果显示:45个氨基酸残基聚集成三簇构象表位:site 1、site 2和site 3。site 1位于病毒衣壳表面峡谷的北侧,site 2和site 3位于峡谷南侧,三者呈现"品"字形分布。site 2和site 3与已报道的两个表位2G8和VP2-P28高度重叠,说明预测结果具有较高准确性。鼻病毒B种14型(Rhinovirus B14,RV-B14)、脊髓灰质炎病毒1型(Poliovirus type 1,PV1)和CV-A10同属于人肠道病毒。已有研究表明,RVB14和PV1的抗原表位也呈三簇分布,且每一簇都与CV-A10的预测结果高度重叠。这既说明了预测结果的准确性,同时也提示三簇构象表位的分布模式可能是人肠道病毒构象表位的基本分布规律。CV-A10构象表位的预测结果,为构象表位的实验鉴定、病毒的分子流行病学研究和疫苗研发提供了重要支持。

关键词：柯萨奇病毒A组10型(CV-A10) 构象表位生物信息学预测手足口病(HFMD)

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柯萨奇病毒A组6型构象表位的生物信息学研究

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柯萨奇病毒A组6型构象表位的生物信息学研究

作者：王丽萍宁波大学

学位级别：硕士

目的:1.手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是由多种人肠道病毒引起的儿童常见传染病。柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是引起手足口病的重要病原体之一。利用本实验室发展的人肠道病毒构象表位预测算法,对CV-A6的... 详细信息

目的:1.手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是由多种人肠道病毒引起的儿童常见传染病。柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是引起手足口病的重要病原体之一。利用本实验室发展的人肠道病毒构象表位预测算法,对CV-A6的构象表位进行系统性地预测,并与柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)的构象表位进行对比,探索肠道病毒构象表位的分布规律。2.利用本地Nextstrain平台重构CV-A6进化树,探索构象表位在病毒分支进化过程中的作用,分析CV-A6的进化关系及其在中国的分布和时空传播规律。方法:1.从PDB和NCBI数据库中分别下载CV-A6(A颗粒)和CV-A10(A颗粒和成熟颗粒)结构蛋白的三维结构文件和氨基酸序列。利用MEGA X软件的MUSCLE工具和ESPript 3.0在线工具进行二级结构注释。利用Py Mo L软件绘制病毒衣壳表面结构图。利用实验室发展的人肠道病毒构象表位预测算法进行构象表位预测。通过查阅文献获得实验鉴定的构象表位,利用RIVEM绘制衣壳足迹图来评估预测准确性,同时分析抗体与构象表位之间的相互作用关系。2.从VIPR病毒数据库和NCBI Nucleotide数据库中检索并下载CV-A6的全基因组序列和结构蛋白VP1序列(915nt),并导入本地化部署的Nextstrain平台,搭建CVA6本地基因组和VP1数据库,利用Nextstrain平台的augur生物信息工具包分别构建CV-A6全基因组和VP1基于时间尺度的系统发育树。分析构象表位在CV-A6分支进化过程中的作用;分析CV-A6在中国的进化关系和时空传播规律。结果:***-A6的构象表位在病毒衣壳表面呈现site 1、site 2和site 3三簇分布。Site 1位于峡谷北侧(north rim),包括VP1的BC环、EF环和HI环。Site 2位于puff区,主要包括VP2的EF环、VP1的GH环和C-端的部分残基。Site 3由两部分组成,一部分位于knob区,包括VP3的N-端上游和VP1的C-端部分残基组成,另一部分靠近三倍轴,由VP2和VP3的HI环构成。中和抗体1D5结合的构象表位以及线性表位P42、P59与site 1、site 2和site 3高度重叠,说明预测算法具有较高的准确性。***-A6(A颗粒)和CV-A10(A颗粒)的构象表位分布高度一致,这种一致性超过了CV-A10两种颗粒状态(A颗粒和成熟颗粒)的一致性。但是,二者共享的构象表位中,保守的残基较少,提示构象表位残基的差异可能造成了CV-A6和CV-A10之间的血清型差异。***-A6的系统发育树显示,除了原株Gdula,自1992年至2019年,全球CV-A6可划分为B1、B2、C1、C2、D1、D2和D3(包括D3a和D3b)七个分支。其中,D3分支为CV-A6流行的优势分支。VP1的S194T(GH环)和F261L(C-端)是D分支形成的关键氨基酸突变;VP2的V179I(EF环)是D2分支形成的关键氨基酸突变;VP2的I132V(EF环)和VP3的V49I(N-端)是D3分支形成的关键氨基酸突变。4.2013年前,中国主要流行CV-A6的D2分支和D3b分支;2013年之后,D3a分支成为中国流行的绝对优势分支。CV-A6在中国七大地理区域的传播路线图显示,CVA6总体上是从中国的华南、华东地区逐渐向华中、西南和华北等地区传播,然后在各地区间交叉传播,引发多地区的疫情。结论:***-A6的构象表位与CV-A10一样,在衣壳表面呈site 1、site 2和site 3三簇分布。构象表位上的残基突变在病毒分支进化过程中具有重要作用。***-A6的优势流行分支主要为D3,2013年之后中国主要流行分支为D3a。CVA6在中国的传播路线总体上是由南向北传播。

关键词：柯萨奇病毒A组6型手足口病构象表位生物信息学分子进化

柯萨奇病毒A组10型和人副肠孤病毒构象表位的生物信息学预测

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柯萨奇病毒A组10型和人副肠孤病毒构象表位的生物信息学预测

作者：戎浩宁波大学

学位级别：硕士

目的:利用实验室发展的人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法,对柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CVA10)的构象表位进行系统性地预测,并将算法推广到小RNA病毒,对人副肠孤病毒1型(Human parechovirus 1,HPe V1)和3型(Human par... 详细信息

目的:利用实验室发展的人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法,对柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CVA10)的构象表位进行系统性地预测,并将算法推广到小RNA病毒,对人副肠孤病毒1型(Human parechovirus 1,HPe V1)和3型(Human parechovirus 3,HPe V3)的构象表位进行系统性地预测,探讨这三种血清型小RNA病毒构象表位的分布模式。方法:1.选取三株CVA10(FY01/AH/CHN/2013、CVA10-FJ-01和A10/S0148b),从RCSB PDB数据库中下载它们的三维结构文件,从NCBI的Nucleotide数据库下载结构蛋白的氨基酸序列。利用MEGA软件和ESPript工具比较CVA10结构蛋白的氨基酸序列和二级结构,利用Py MOL软件绘制CVA10结构蛋白的三维结构和衣壳表面结构。利用实验室发展的人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法,对CVA10进行构象表位预测。通过文献检索获取已报道的实验表位,利用RIVEM绘制CVA10足迹图,评估算法的预测准确性,同时分析抗体与构象表位的相互作用关系。2.选取HPe V1代表株(Harris)和HPe V3代表株(A308/99),从RCSB PDB数据库中下载三维结构文件,从NCBI的Nucleotide数据库下载结构蛋白的氨基酸序列。从Nucleotide数据库下载所有具有完整结构蛋白序列的HPe V病毒株的氨基酸序列,从中随机选择16株HPe V(HPe V1:4株;HPe V2:2株;HPe V3:4株;HPe V4:2株;HPe V5:2株;HPe V6:2株),用作序列保守性分析。利用MEGA、ESPript、Py MOL和UCSF Chimera软件比较HPe V1、HPe V3和CVA10结构蛋白的氨基酸序列、二级结构、三维结构和衣壳表面结构。将实验室发展的人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法扩展到小RNA病毒,对HPe V1和HPe V3进行构象表位预测。通过文献检索获取已报道的实验表位,利用RIVEM绘制HPe V1和HPe V3足迹图,评估算法的预测准确性,同时分析抗体与构象表位的相互作用关系。结果:***10的45个氨基酸残基聚集成三簇构象表位:site 1、site 2和site 3。site 1位于五倍轴附近的north rim区域,由VP1的BC环和HI环构成。site 2位于峡谷南侧的puff区域,主要由VP1的GH环和C-端以及VP2的EF环构成。site 3可以分为两部分,一部分位于峡谷南侧的knob区域,由VP1 C-端和VP3 N-端构成,与site 1和site 2更接近,构成“品”字形分布;另一部分位于三倍轴,由VP2 HI环和VP3 HI环构成。site 2和site 3与已报道的两个表位2G8和VP2-P28高度重叠。*** V1和HPe V3的构象表位的分布模式高度一致,构象表位都呈现三簇分布,分别为site 1、site 2和site 3。site 1位于五倍轴附近的north rim区域,由VP1的BC环和HI环构成。site 2位于峡谷南侧的puff区域,主要由VP1的C-端构成。site3分为两部分,一部分位于knob区域,主要由VP3的N-端构成,另一部分靠近三倍轴,主要由VP0(VP2)的HI环和VP3的HI环构成。与CVA10相比,由于HPe V1和HPe V3的VP0(VP2)EF环和VP1 GH环上的残基较少,导致puff区域变得平坦,整体上难以形成构象表位,因此HPe V1、HPe V3与CVA10的site2构象表位存在明显差异。同时由于CVA10的VP1 C-端较长,导致构成site 3的knob区域的构象表位也存在明显差异。构象表位site 1上的VP1-85N-87D这两个氨基酸残基可能是单抗AT12-015结合HPe V3的关键残基。VP3-91N/94S-92H/95S和VP0-257S/A这三个关键残基的变异影响了单抗AM28的结合能力点,说明表位上的残基突变产生了不同的HPe V血清型。结论:***10、HPe V1和HPe V3都具有相似的构象表位分布模式,构象表位都聚集成三簇,分别为site 1、site 2和site 3。*** V1和HPe V3的site 2和site 3构象表位与CVA10存在明显差异。site 3上的三个关键氨基酸残基可能决定了HPe V1和HPe V3的血清学差异。

关键词：柯萨奇病毒A组10型人副肠孤病毒构象表位抗原表位生物信息学预测

基于构象表位印迹策略的肿瘤靶向纳米载体研究

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基于构象表位印迹策略的肿瘤靶向纳米载体研究

作者：张焱西南大学

学位级别：硕士

分子印迹技术是指在印迹材料的合成中构建与模板分子在大小、形状和结构上都互补的特异性结合位点的技术。现分子印迹技术在小分子印迹技术方面已成熟并实现商品化,但在蛋白质分了印迹技术方面却存在诸多挑战。这是因为传统的蛋白质分... 详细信息

分子印迹技术是指在印迹材料的合成中构建与模板分子在大小、形状和结构上都互补的特异性结合位点的技术。现分子印迹技术在小分子印迹技术方面已成熟并实现商品化,但在蛋白质分了印迹技术方面却存在诸多挑战。这是因为传统的蛋白质分子印迹过程中具有蛋白质其理化性质及构效关系等因素、生产成本高等缺点,限制了其应用。现行的靶向给药系统的研究模式是通过膜蛋白的天然配体(如多肽、核酸适配体等)作为导向分子,并将其偶联于载体表面以发挥导向功能,但天然配体存在体内外稳定性差、免疫原性等问题,限制了靶向效率。基于此,本课题将蛋白质分子印迹技术和靶向给药系统相结合,提出一种构象表位印迹策略,设计与膜蛋白胞外区构象表位具有相似结构、核心序列一致的多肽,以该多肽为模板开展分子印迹,印迹形成的“空穴”对模板具有特异性结合,所制备的印迹聚合物纳米粒能特异性靶向识别肿瘤表面特定的膜蛋白,且在生理条件下比较稳定。本课题第部分探索构象表位印迹策略的可行性。采用反相微乳液聚合法,以丙烯酰胺为功能单体、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、蜂毒明肽(α螺旋结构,apamin)与其线性衍生物(其中四个半胱氨酸均被丙氨酸取代,linear apamin)为模板分子开展分子印迹,分别得到蜂毒明肽印迹聚合物纳米粒(A-MIPNPs)与线性蜂毒明肽印迹聚合物纳米粒(L-MIPNPs),采用粒度仪测定其粒径大小适宜,分散均匀;透射电镜观察显示该纳米粒的外观形态圆整,与粒度仪测定结果一致。上述两种表征结果均提示印迹聚合物纳米粒成功构建。印迹聚合物纳米粒对模板分子的结合能力实验显示与L-MIPNPs、非印迹聚合物纳米粒(NIPNPs)相比,A-MIPNPs对模板apamin具有更好的选择识别能力。纳米粒中和蜂毒明肽及其胶束实验显示A-MIPNPs能将大部分蜂毒明肽及其胶束结合进入肝脏部位,而使蜂毒明肽及其胶束在脊髓部位的蓄积量减少;L-MIPNPs与NIPNPs则没有与大部分蜂毒明肽及其胶束结合,蜂毒明肽及其胶束仍富集于脊髓部位。结果表明A-MIPNPs能中和小分子蜂毒明肽甚至其大分子胶束。上述研究显示与线性蜂毒明肽印迹聚合物相比,蜂毒明肽印迹聚合物纳米粒对模板apamin具有更强的结合能力,即以具有高级结构的多肽为模板的印迹聚合物比以具有线性结构的多肽为模板的印迹聚合物对模板分子的亲和力更高,表明在一级序列相同时,印迹模板多肽的高级结构对印迹效果起关键作用。此外,我们初步掌握了构建印迹聚合物纳米粒的方法及选择了适宜的测定印迹纳米粒与模板分子的相互作用的方法。在本课题第一部分基础上,第二部分主要探索构建一种具有肿瘤靶向性的印迹聚合物纳米载体。首先,采用蛋白“嫁接”策略,以p32序列为模拟对象,以蜂毒明肽为模板,将p32上N端的关键氨基酸“嫁接”到蜂毒明肽上,经圆二色谱表征,设计合成的多肽HAPPE具有典型的α螺旋结构。再以该多肽HAPPE为印迹模板分子,丙烯酰胺类为单体,采用反相微乳液聚合法开展分子印迹。印迹形成的纳米粒的平均粒径为40nm左右,大小适宜,分布均匀。体外结合实验显示印迹聚合物纳米粒与p32结合平衡常数Kd为11.9-40.1nM。选取N端具有α螺旋结构的磷脂酶A2、分子量与p32相近的小鼠神经生长因子为竞争蛋白,但印迹纳米粒与这两种竞争蛋白均无结合,结果提示印迹聚合物纳米粒具有与模板分子相同的“空穴”,并能与之进行特异性结合。流式细胞仪测定4T1和BxPC-3细胞对纳米粒的摄取结果显示MIPNPs组的荧光强度均是NIPNPs组的3倍左右;小动物活体成像测定体内分布结果表明,与NIPNPs相比,MIPNPs能靶向识别肿瘤。细胞和体内水平均表明印迹聚合物纳米粒对p32蛋白具有靶向性。对载体进行初步安全性评价,结果表明在一定的剂量范围内,印迹聚合物纳米粒对细胞及机体均没有明显毒副作用,这为载体的应用奠定了基础。综上所述,本课题提出了构象表位印迹策略并采用该策略构建了多肽功能分子“间接”介导肿瘤靶向的纳米载体,有效规避了传统的导向分子不稳定性的问题,提高了印迹聚合物与模板分子的结合效果;证实了印迹模板多肽空间结构对印迹聚合物印迹效果的重要性,表明选择靶蛋白的构象表位进行印迹所形成的印迹聚合物纳米粒对靶蛋白具有更强的特异性结合。本研究为以聚合物纳米粒为基础的靶向识别和治疗领域提供了新的研究思路。

关键词：构象表位印迹纳米载体肿瘤靶向

用合成肽文库对模拟乙型脑炎病毒蛋白构象表位抗原性和免疫原性的肽类的鉴定

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国际生物制品学杂志 1997年第5期20卷 227-228页

作者：贾彦征

本文介绍一种鉴定乙型脑炎病毒（JEV）构象表位的新方法.作者用Fmoc化学技术合成包含20;种五肽序列的五肽完整文库.然后用识别JEVprM蛋白构象表位的单克隆抗体（McAb）N.03和N.08进行免疫亲和性筛选.结果发现与N.03和N.08亲和的肽的型... 详细信息

本文介绍一种鉴定乙型脑炎病毒（JEV）构象表位的新方法.作者用Fmoc化学技术合成包含20;种五肽序列的五肽完整文库.然后用识别JEVprM蛋白构象表位的单克隆抗体（McAb）N.03和N.08进行免疫亲和性筛选.结果发现与N.03和N.08亲和的肽的型序列分别为（Y/W/F）GG（I/L/M）和（N/Q）WY（D/E）.为选择高亲和力肽,进一步合成了假肽文库（PPL）,针对N.03为XXGGOXX（X,代表20种天然氨基酸的任一种;O,代表每一次反应的特定氨基酸）.经ELISA筛选,XXG-GIXX显示较高亲和力,在第4次假文库筛选中,YGGIYX亲和力较OYGGIYX高.直

关键词：乙型脑炎病毒虫媒病毒构象表位肽文库蛋白